KR101953125B1 - 가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용하여 가지과 식물체에서 병원성 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 프라이머 세트 및 이를 이용하여 바이러스를 검출하는 방법은 가지과 식물체 또는 종자 전염 바이러스인 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, PMMoV를 개별적으로 또는 동시에 특이적으로 검출하는 데 이용할 수 있다. 따라서, 가지과 작물의 바이러스 감염 유무를 보다 손쉽고 정확하게 확인할 수 있고, 바이러스 무병주 생산 및 바이러스병 발생 모니터링에도 효과적으로 활용할 수 있다.
Description
가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용하여 가지과 식물체에서 병원성 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
고추는 우리나라에서 가장 중요한 채소 작물이며 식재료의 하나로서, '15년 통계청 자료 기준 총생산량은 97.7천톤에 달한다. 고추는 세계적으로 약 60여종의 바이러스들이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 우리나라에서는 고추에 경제적으로 피해를 일으키는 10종의 바이러스가 보고되고 있다. 노지 고추의 경우 고추 생육 말기에 이르면 90% 이상 바이러스 발병율을 나타내며, 바이러스병으로 인한 생산량 감수는 평균적으로 약 30%으로 추정된다.
고추 바이러스는 재배자의 손, 농기구 등의 기계적인 접촉, 매개충에 의한 전반 그리고 오염된 종자로 고추 유묘에도 감염이 된다. 이러한 감염 경로 중 기계적인 접촉이나 충매에 의한 감염은 병징으로 확인이 가능하지만 종자 감염의 경우 육안 관찰로는 종자에 바이러스 감염 여부를 판단할 수 없다. 비특허문헌 1은 시판 고추 종자에서 분리한 토바모바이러스(Tobamovirus)의 병원형을 개시하고 있다. 또한 식물체에 감염된 바이러스도 대부분은 모자이크의 병징이 나타나고 대부분 복합 감염이므로 병징만으로는 정확한 바이러스를 진단하기는 어렵다.
식물 바이러스는 병원성 곰팡이나 세균과는 다르게 식물체내 세포질 속에서 증식을 하므로 농약 개발이 어려워 약제 방제가 어려운 실정이다. 그러므로 종자나 식물 생육 초기에 바이러스 유무를 진단하고 이병주를 제거하는 것이 가장 큰 방제법 중 하나이다.
식물 바이러스 진단법에는 육안 검정, 생물학적인 검정, 항혈청학 및 분자생물학적 검정 등이 있다. 항혈청학적 방법 중 하나인 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)는 다량 분석에는 효과적이나 민감도가 떨어지고, 복합 감염을 진단하기는 어렵다.
따라서, 상기 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 4종 또는 6종의 바이러스의 동시다중 검출에 효율성을 높이기 위한 최적의 프라이머 세트의 염기서열 및 반응 조건을 구축하고 이를 키트로 제작하여 본 발명을 완성하였다.
한정현 등, "시판 고추 종자에서 분리한 Tobamovirus의 병원형", 원예과학기술지 제19권 제4호, 2001, 12: 530-534.
일 양상은 가지과 식물체 전염 병원성 바이러스인 담배모자이크바이러스, 토마토반점시들음바이러스, 담배연녹모자이크바이러스, 잠두시들음바이러스2, 오이모자이크바이러스, 및 고추순한얼룩바이러스 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 또는 키트를 제공한다.
다른 양상은 상기 프라이머 세트를 이용하여 가지과 식물체 중 담배모자이크바이러스, 토마토반점시들음바이러스, 담배연녹모자이크바이러스, 잠두시들음바이러스2, 오이모자이크바이러스, 및 고추순한얼룩바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus: TMV), 토마토반점시들음바이러스(Tomato spotted wilt virus: TSWV), 담배연녹모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus: TMGMV), 잠두시들음바이러스2(Broad bean wilt virus 2: BBWV2), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV), 고추순한얼룩바이러스(Pepper mild mottle virus: PMMoV) 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
용어, "프라이머(primer)"는 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로부터 기능하는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 이용한 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 상기 프라이머는 길이가 15 내지 45개의 뉴클레오티드, 15 내지 30개의 뉴클레오티드, 15 내지 25개의 뉴클레오티드, 20 내지 45개의 뉴클레오티드, 20 내지 35개의 뉴클레오티드, 또는 20 내지 30개의 뉴클레오티드일 수 있다. 상기 프라이머는 검출가능한 표지로 표지되어 있을 수 있다.
상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드는 TMV의 외피 단백질(coat protein: CP) 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드는 TMV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드는 TSWV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드는 TSWV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드는 TMGMV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드는 TMGMV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드는 BBWV2의 큰 외피 단백질(large coat protein: LCP) 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드는 BBWV2의 큰 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드는 CMV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드는 CMV의 외피 단백질 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드는 PMMoV의 RNA 의존적 핵산 중합효소(RNA dependent RNA polymerase: RdRp) 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 정방향 프라이머이고, 상기 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드는 PMMoV의 RNA 의존적 핵산 중합효소 유전자의 염기서열에 특이적으로 결합할 수 있는 역방향 프라이머이다.
상기 제1 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 제2 프라이머 세트는 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 제3 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 제4 프라이머 세트는 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 제5 프라이머 세트는 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 제6 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
상기 프라이머 세트는 가지과 식물체, 특히 가지과 식물체의 주요 전염 병원성 바이러스 중에서 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV에 있는 유전자만을 특이적으로 증폭시켜, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV의 존재 여부를 판별할 수 있는 표적서열을 증폭할 수 있다.
상기 가지과(Solanaceae) 식물체에는 작물로 이용되는 고추, 토마토, 담배 등이 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV가 감염될 수 있는 모든 가지과 식물체에 적용 가능하다. 상기 고추는 파프리카 등을 포함할 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트는, 및 제6 프라이머 세트는, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 검출 목적에 따라 단독으로 사용될 수 있으며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 2 이상을 동시에 검출하기 위하여 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 가지과 식물의 종자를 감염시키는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV 바이러스 4종을 동시에 검출하기 위하여 제1 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트, 및 제6 프라이머 세트가 동시에 사용될 수 있다. 또한, 가지과 식물체를 감염시키는 6종의 바이러스를 동시에 검출하기 위하여 제1 내지 제6 프라이머 세트가 동시에 사용될 수 있다.
따라서, 상기 프라이머 세트는 제1 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트 및 제6프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 4종의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트 및 제6프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 6종의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트는 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서, 프라이머 세트에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
상기 조성물에는 상기 올리고뉴클레오티드를 안정화시키거나 보존하기 위한 용액 및 증폭에 필요한 시약을 포함할 수 있다.
다른 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에서, 프라이머 세트에 관한 내용은 상술한 바와 같다.
상기 키트에는 상기 올리고뉴클레오티드 외에 핵산 증폭에 필요한 시약 및 검출에 필요한 시약을 포함할 수 있다.
다른 양상은 가지과 작물로부터 유래된 핵산을 주형으로 하고 상기 제1 내지 제6 프라이머 세트의 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 가지과 작물 중에 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 가지과 식물체 중 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 가지과 작물로부터 유래된 핵산을 주형으로 하고, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 표적서열을 증폭하는 단계를 포함한다.
구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제1 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제2 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제3 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제4 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 제5 프라이머 세트; 및 서열번호 11 및 12의 올리고뉴크레오티드로 이루어지는 제6 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 프라이머 세트일 수 있다.
상기 가지과 작물로부터 유래된 핵산이란, DNA 또는 RNA를 포함한다. DNA의 경우, 가지과 작물로부터 분리한 게놈(genomic) DNA 뿐만 아니라, 가지과 작물로부터 분리한 RNA로부터 수득한 cDNA 등 식물체로부터 얻을 수 있는 모든 종류의 DNA를 의미한다.
상기 핵산은 상기 가지과 작물의 잎, 종자, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것일 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트는, 및 제6 프라이머 세트는, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 검출 목적에 따라 단독으로 사용될 수 있으며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 2 이상을 동시에 검출하기 위하여 함께 사용될 수 있다. 구체적으로, 가지과 식물의 종자를 감염시키는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV 바이러스 4종을 동시에 검출하기 위하여 제1 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트, 및 제6 프라이머 세트가 동시에 사용될 수 있다. 또한, 가지과 식물체를 감염시키는 6종의 바이러스를 동시에 검출하기 위하여 제1 내지 제6 프라이머 세트가 동시에 사용될 수 있다.
따라서, 상기 프라이머 세트는 제1 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트 및 제6프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 4종의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
또한, 상기 프라이머 세트는 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 제4 프라이머 세트, 제5 프라이머 세트 및 제6프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트일 수 있다. 상기 6종의 프라이머 세트로 구성된 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트는 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트일 수 있다.
상기 가지과 식물의 종자를 감염시키는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV 바이러스 4종을 동시에 검출하기 위하여 제1, 제3, 제5, 및 제6 프라이머 세트를 동시에 사용하는 경우, 제1 프라이머 세트 : 제3 프라이머 세트 : 제5 프라이머 세트 : 제6 프라이머 세트의 혼합 비율은 4.5 내지 5.5 : 2 내지 3 : 2 내지 3 : 9.5 내지 10.5일 수 있고, 예를 들어 5 : 2.5 : 2.5 : 10일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 4종의 프라이머 세트에 대한 증폭 결과를 어렵지 않게 확인할 수 있는 적절한 혼합 비율을 사용할 수 있다.
상기 가지과 식물체를 감염시키는 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 바이러스 6종을 동시에 검출하기 위하여 제1 내지 제6 프라이머 세트를 동시에 사용하는 경우, 제1 프라이머 세트 : 제2 프라이머 세트 : 제3 프라이머 세트 : 제4 프라이머 세트 : 제5 프라이머 세트 : 제6 프라이머 세트의 혼합 비율은 4.5 내지 5.5 : 2 내지 3 : 2 내지 3 : 4.5 내지 5.5 : 4.5 내지 5.5일 수 있고, 예를 들어 5 : 2.5 : 2.5 : 5 : 2.5 : 5일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 6종의 프라이머 세트에 대한 증폭 결과를 어렵지 않게 확인할 수 있는 적절한 혼합 비율을 사용할 수 있다.
상기 증폭은 중합연쇄효소를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR)일 수 있으며, 예를 들어, cDNA를 이용하는 RT-PCR일 수 있다. 또한, 상기 증폭은 한번의 PCR로 하나의 유전자 존재 여부를 판정하는 단일 PCR, 구체적으로 단일 RT-PCR이거나, 한번의 PCR로 여러 가지 유전자의 존재 여부를 판정하는 다중 PCR, 구체적으로 다중 RT-PCR일 수 있다.
상기 가지과 작물로부터 유래된 핵산이 DNA인 경우, DNA를 얻기 위하여, 식물체에서 RNA를 추출하고, 이를 랜덤 프라이머와 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 합성하는 단계를 거칠 수 있다. 그러나, 이러한 별도의 cDNA 합성 단계를 수행하지 않고도, RNA를 주형으로 one-step mRT-PCR(multiplex Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 수행할 수 있다.
가지과 작물 중에 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 단계는 프라이머 세트에 의한 증폭 산물의 존재 여부에 기반한다.
상기 프라이머로 다중 RT-PCR을 수행할 경우, 한번의 RT-PCR로 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV를 검출할 수 있다. RT-PCR은 P. Seeburg (Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하게 된다. 이때 증폭 단계에서 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV를 확인하기 위해 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하는데, 다중 RT-PCR은 하나의 프라이머가 아니라 다종의 프라이머를 사용하여 여러 가지 단편을 동시에 증폭시키는 PCR 방식을 말한다. 다중 RT-PCR 후 전기영동 하여 밴드 패턴을 확인함으로써, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 또는 PMMoV 감염 여부를 간편하게 진단할 수 있다.
TMV 존재 시 서열번호 1 및 2의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 200 bp(이하 A밴드라고도 함)일 수 있다. TSWV 존재 시 서열번호 3 및 4의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 300 bp(이하 B 밴드라고도 함)일 수 있다. TMGMV 존재 시 서열번호 5 및 6의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 400 bp(이하 C 밴드라고도 함)일 수 있다. BBWV2 존재 시 서열번호 7 및 8의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 500 bp(이하 D 밴드라고도 함)일 수 있다. CMV 존재 시 서열번호 9 및 10의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 600bp(이하 E밴드라고도 함)일 수 있다. PMMoV 존재 시 서열번호 11 및 12의 프라이머에 의해 증폭되는 표적서열의 증폭산물은 800 bp(이하 F밴드라고도 함)일 수 있다.
따라서, 증폭 결과 A 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 TMV가 감염되어 있는 것으로 판정하고, B 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 TSWV가 감염되어 있는 것으로 판정하고, C 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 TMGMV가 감염되어 있는 것으로 판정하고, D 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 BBWV2가 감염되어 있는 것으로 판정하고, E 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 CMV가 감염되어 있는 것으로 판정하고, F 밴드가 나타나면 가지과 식물체에 PMMoV가 감염되어 있는 것으로 판정할 수 있다.
상기 증폭에서, 어닐링 온도는 54 내지 57 ℃일 수 있으며, 예를 들어 55 ℃일 수 있다.
상기 프라이머 세트는, 약 0.01 ng/㎕ 농도의 주형 RNA만 있어도 증폭이 가능하므로 민감성이 매우 높고, 다른 바이러스와 작용하지 않아 특이성도 높으므로, 가지과 작물의 식물체 또는 종자에 존재하는 매우 적은 수의 바이러스 감염 진단에 유용하다. 특히, 종자에서는 바이러스의 농도가 식물체보다 낮아 검출법의 높은 민감도가 요구되는 바, 상기 방법을 이용하면 종자에서도 높은 효율로 바이러스의 검출이 가능하다.
일 양상에 따른 가지과 작물의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 바이러스를 검출하는 방법은 가지과 식물체 또는 종자 전염 바이러스인 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, PMMoV를 개별적으로 또는 동시에 특이적으로 검출하는 데 이용할 수 있다. 따라서, 가지과 작물의 바이러스 감염 유무를 보다 손쉽고 정확하게 확인할 수 있고, 바이러스 무병주 생산 및 바이러스병 발생 모니터링에도 효과적으로 활용할 수 있다.
도 1은 고추에서 보고된 담배연녹모자이크바이러스(TMGMV)의 3개 분리주들의 외피단백질(coat protein, CP) 유전자 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다. 이 도면에는 유전자의 일부분만 나타내었다.
도 2는 6종의 바이러스 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 유전자 내 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 6종의 바이러스 중 TMGMV에 대하여 바이러스 양성대조 클론을 만들기 위해 바이러스 감염 시료로부터 추출한 전체 RNA 주형의 RT-PCR 산물을 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 4는 고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다: lane 1, TMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 2, TMGMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 3, CMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 4, PMMoV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane mix, 4종의 프라이머 세트 모두 첨가.
도 5는 식물의 전체 RNA에 대하여 4종의 바이러스 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV를 증폭하기 위한 프라이머를 사용하여 mRT-PCR을 수행한 결과이다: 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMov의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 5:2.5:2.5:10 pmol; lane 2 및 5, 2.5:2.5:2.5:10 pmol; lane 3 및 6, 5:5:5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다.
도 6은 4종의 바이러스 동시다중 검출의 민감도를 테스트하기 위하여, 바이러스의 이병주로부터 추출한 전체 RNA의 농도가 200, 100, 50, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎕일 때, mRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 국내 유통 고추 종자 156 품종의 전체 RNA을 주형으로 mRT-PCR을 수행한 결과이다. 이 결과는 전체 결과의 일부분이며, (+): 양성대조, (-): 음성대조(주형 없음), *: 3종 바이러스의 복합 검출 결과이다.
도 8은 6종 바이러스의 양성대조 DNA를 주형으로 PCR 수행 후 전기영동으로 분석한 결과이다: lane 1, TMV 양성대조; lane 2, TSWV 양성대조; lane 3, TMGMV 양성대조; lane 4, BBWV2 양성대조; lane 5, CMV 양성대조; lane 6, PMMoV 양성대조; mix, 6종 혼합 양성대조.
도 9는 고추 식물체의 전체 RNA에 대해 6종의 프라이머 세트를 사용하여 수행한 mRT-PCR의 결과이다: RT-PCR 조건의 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 2.5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 2 및 5, 5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 3 및 6, 2.5:2.5:2.5:10:2.5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다.
도 10은 노지 고추 재배지에서 바이러스 의심 증상 샘플을 채집 후 6종 바이러스의 동시다중 검출법으로 분석한 결과이다.
도 11은 노지 고추 재배지에서의 바이러스 증상을 육안으로 관찰한 결과와 6종 동시다중 검출법의 결과를 정리한 것이다.
도 2는 6종의 바이러스 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 유전자 내 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 6종의 바이러스 중 TMGMV에 대하여 바이러스 양성대조 클론을 만들기 위해 바이러스 감염 시료로부터 추출한 전체 RNA 주형의 RT-PCR 산물을 전기영동으로 분석한 결과이다.
도 4는 고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다: lane 1, TMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 2, TMGMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 3, CMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 4, PMMoV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane mix, 4종의 프라이머 세트 모두 첨가.
도 5는 식물의 전체 RNA에 대하여 4종의 바이러스 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV를 증폭하기 위한 프라이머를 사용하여 mRT-PCR을 수행한 결과이다: 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMov의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 5:2.5:2.5:10 pmol; lane 2 및 5, 2.5:2.5:2.5:10 pmol; lane 3 및 6, 5:5:5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다.
도 6은 4종의 바이러스 동시다중 검출의 민감도를 테스트하기 위하여, 바이러스의 이병주로부터 추출한 전체 RNA의 농도가 200, 100, 50, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎕일 때, mRT-PCR을 수행한 결과이다.
도 7은 국내 유통 고추 종자 156 품종의 전체 RNA을 주형으로 mRT-PCR을 수행한 결과이다. 이 결과는 전체 결과의 일부분이며, (+): 양성대조, (-): 음성대조(주형 없음), *: 3종 바이러스의 복합 검출 결과이다.
도 8은 6종 바이러스의 양성대조 DNA를 주형으로 PCR 수행 후 전기영동으로 분석한 결과이다: lane 1, TMV 양성대조; lane 2, TSWV 양성대조; lane 3, TMGMV 양성대조; lane 4, BBWV2 양성대조; lane 5, CMV 양성대조; lane 6, PMMoV 양성대조; mix, 6종 혼합 양성대조.
도 9는 고추 식물체의 전체 RNA에 대해 6종의 프라이머 세트를 사용하여 수행한 mRT-PCR의 결과이다: RT-PCR 조건의 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 2.5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 2 및 5, 5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 3 및 6, 2.5:2.5:2.5:10:2.5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다.
도 10은 노지 고추 재배지에서 바이러스 의심 증상 샘플을 채집 후 6종 바이러스의 동시다중 검출법으로 분석한 결과이다.
도 11은 노지 고추 재배지에서의 바이러스 증상을 육안으로 관찰한 결과와 6종 동시다중 검출법의 결과를 정리한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 바이러스의 염기서열 비교 분석 및 바이러스 특이적
프라이머의
제작
식물 바이러스는 몇 개의 단백질을 코딩하는 유전자를 가지고 있고, 이들은 보존적인 염기서열을 가지기도 한다. 보고된 바이러스의 유전 정보에서 보존적인 염기서열의 위치를 찾고 프라이머를 제작하기 위하여 미국국립생물정보센터(NCBI)의 홈페이지(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 고추 유래 바이러스의 염기서열을 비교 분석하였다. 염기서열의 비교 분석은 DNASTAR 프로그램의 EditSeq Clustal W 방법으로 분석하였다.
표 1은 상기 염기서열 분석의 대상이 되는 고추 유래 바이러스 6종의 종류 및 전반 경로를 나타낸 것이다.
| No. | 바이러스명 | 그룹(속명, 종명) | 전반 경로 |
| 1 | 담배모자이크바이러스 (Tobacco mosaic virus, TMV) |
Virgaviridae , Tobamovirus | 접촉, 종자 |
| 2 | 토마토반점시들음바이러스 (Tomato spotted wilt virus, TSWV) |
Bunyaviridae , Tospovirus | 접촉, 총채벌레 |
| 3 | 담배연녹모자이크바이러스 (Tobacco mild green mosaic virus, TMGMV) |
Virgaviridae , Tobamovirus | 접촉, 종자 |
| 4 | 잠두시들음바이러스2 (Broad bean wilt virus 2, BBWV2) |
Secoviridae , Fabavirus | 접촉, 진딧물 |
| 5 | 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus, CMV) |
Bromoviridae , Cucumovirus | 접촉, 종자, 진딧물 |
| 6 | 고추순한얼룩바이러스 (Pepper mild mottle virus, PMMoV) |
Virgaviridae , Tobamovirus | 접촉, 종자 |
도 1은 고추에서 보고된 담배연녹모자이크바이러스(TMGMV)의 3개 분리주들의 외피단백질(coat protein, CP) 유전자 염기서열을 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다. 이 도면에는 유전자의 일부분만 나타내었다.
TMGMV의 염기서열 비교 분석 결과를 바탕으로, NCBI의 primer-BLAST 프로그램을 이용하여 얻은 10개의 후보 프라이머 염기서열 중 RT-PCR 산물이 400 bp가 되고 Tm 값이 일정하며 프라이머의 이합체(dimer)가 생길 확률이 낮은 프라이머 세트를 선정하였다. 동일한 방법으로 나머지 5종 바이러스들의 프라이머 세트를 선발하였다.
도 2는 6종의 바이러스 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 유전자 내 프라이머의 위치를 나타낸 것이다.
표 2는 6종의 바이러스 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV를 각각 특이적으로 증폭하는 프라이머 세트 정보를 나타낸 것이다.
| 서열번호 | 프라이머명 |
프라이머
서열
(5'→3') |
산물 길이 (bp) | 바이러스 종 | GenBank number |
| 1 | TMV CP 101F | TAATCAGTTTCAAACACAGCAGGCT | 200 | TMV | L35073 |
| 2 | TMV CP 300R | CGGATTTTCTACTTCTATTATCCTA | |||
| 3 | TSWV CP 353F | AGCCCCACAGACTTTGCATC | 300 | TSWV | KJ139671 |
| 4 | TSWV CP 652R | TGACCAGATCAAGAAGATGAGCA | |||
| 5 | TMGMV CP 8F | ATACAATCAACTCTCCGAGCCA | 400 | TMGMV | AB078435 |
| 6 | TMGMV CP 407R | CCACGAACCAGTTCATTAGCC | |||
| 7 | BBWV2 LCP 567F | GCGTGTGGCTTACTCTTTTGA | 500 | BBWV2 | KU309314 |
| 8 | BBWV2 LCP 1066R | GCGTGATCGTTGTTGGGTAG | |||
| 9 | CMV CP 3F | GGACAAATCTGAATCAACCAGTGC | 600 | CMV | KC527764 |
| 10 | CMV CP 602R | AGTACCAATTCGTCCGTCTCG |
|||
| 11 | PMMoV RdRp 289F | TACAACACGCAGAACGCTGT | 800 | PMMoV | KR108206 |
| 12 | PMMoV RdRp 1088R | TGCCAAGCATCTTCCATTGC |
* 표 2에서 CP는 외피 단백질, LCP는 큰 외피 단백질(large coat protein), RdRp는 RNA 의존적 RNA 핵산 중합효소(RNA dependent RNA polymerase)를 의미함
실시예
2. 고추 바이러스를 진단하기 위한 바이러스 6종의 양성대조 클론 확보
실시예 1에서 제작한 프라이머 조합을 이용하여 DNA 수준에서 프라이머 및 진단법의 효율성을 확인하기 위한 실험을 하였다.
먼저, 양성대조로 이용할 유전자 클론 확보를 위하여, 국립종자원 종자검정연구센터에서 보관 중인 바이러스 감염 시료 및 식물바이러스은행(Plant virus Genbank)에서 분양 받은 감염 시료에서 식물의 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA는 Macherey-Nagel사의 Plant mini RNA kit(Germany)를 이용하였다. 추출한 전체 RNA를 주형으로 표 2의 프라이머 세트를 이용하여 one-step mRT-PCR(multiplex Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)을 수행하였다. 상기 후보로 선발한 바이러스들은 RNA 바이러스이므로, PCR로 유전자 가닥을 증폭하기 위해서는 먼저 RNA에서 cDNA로의 합성 과정이 필요하고, 합성한 cDNA를 주형으로 PCR을 수행하는 것이 RT-PCR의 기본 방법이다. 그러나, RNA에서 cDNA로의 합성 과정을 줄이고자 one-step RT-PCR 키트를 이용하였다(QIAGEN, Germany). RT-PCR을 위한 혼합물의 조건은 전체 25 ㎕의 볼륨으로 1 ㎕의 주형 RNA(~100 ng), 5 ㎕의 반응 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP 믹스, 1 ㎕의 효소 믹스, 1 ㎕의 10 pmol 정방향 프라이머, 1 ㎕의 10 pmol 역방향 프라이머, 15 ㎕의 뉴클레아제 프리 워터(nuclease free water)였다. 이들을 잘 혼합해준 튜브를 PCR 기계에서 다음과 같은 과정의 프로그램으로 반응하였다: ① 50℃에서 30분 ② 95℃에서 15분 ③ 95℃에서 40초 ④ 55 내지 60℃(프라이머 세트의 Tm 값에 따른 변동) ⑤ 72℃에서 30초 내지 1분(최종 PCR산물의 길이에 따른 변동, 1kb 합성에 1분 소요) ⑥ 72℃에서 10분 ⑦ 4℃, 이 과정에서 번호 ③~⑤과정은 35회 반복하였다.
도 3은 6종의 바이러스 중 TMGMV에 대하여 바이러스 양성대조 클론을 만들기 위해 바이러스 감염 시료로부터 추출한 전체 RNA 주형의 RT-PCR 산물을 전기영동으로 분석한 결과이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, TMGMV 외피 단백질에서 400 bp 길이의 산물이 증폭되었다.
나머지 바이러스에 대하여도 상기 방법으로 바이러스 감염주에서 추출한 RNA를 주형으로 바이러스 유전자를 증폭하였다. 그리고 pGEM T-easy vector(Promega, USA)에 바이러스 유전자 증폭 산물을 삽입하고 염기서열 분석을 의뢰하여 6종의 바이러스 양성대조 클론을 확보하였다.
실시예
3. 고추 종자 감염 바이러스 4종의
동시다중
검출
(1) 고추 종자에서 전체 RNA 추출
고추 종자를 감염시키는 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV 바이러스 4종을 동시다중 검출하는 방법을 검증하기 위해, 국내 유통 고추 종자 156품종의 전체 RNA를 주형으로 이용하였다.
시판되는 고추 종자는 종자에 코팅이 되어 있는 상태이므로 RNA 추출 전 충분한 마쇄가 필요하였다. 효과적인 종자의 마쇄를 위하여 MP 바이오메디칼스사의 FastPrep-24 조직 및 세포 균질기(USA)와 TOKKEN사의 오토밀(Automill) 동식물조직 자동파쇄기(TK-AM7, Japan)에 0.3g의 종자(60-70립)를 마쇄하였다. 2 ml 튜브 수준에서의 종자 마쇄는 TOKKEN사의 오토밀(Automill)이 더 효과적이었고, 이를 이용하여 156품종의 샘플들을 모두 1,300 rpm에서 1분씩 마쇄하였다. 마쇄한 고추 종자에서 전체 RNA를 추출하기 위하여 식물 종자 바이러스 RNA 키트(이노진텍, Korea)를 이용하였다. 이 키트의 주어진 프로토콜에서 우리의 시료 분량에 맞추어 조직 용균 버퍼를 1 ml 수준으로 맞추어 추출하였다. 추출한 전체 RNA는 모두 UV-분광광도계(Nanoquant Plate, TECAN, switzerland)를 이용하여 순도와 농도를 확인하였고, 이를 하기 실험의 주형으로 이용하였다.
(2) 고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종의 최적의
동시다중
검출 조건 및 검출 특이성 확인
고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 동시다중 검출에 있어서 각 프라이머의 농도 및 반응 조건 등을 테스트하였다.
RNA 수준에서의 진단법 이전에 프라이머의 효율성을 확인하기 위하여 양성대조 클론의 조합을 이용하여 PCR 수행으로 반응 조건을 테스트하였다. PCR을 위한 혼합물의 조건은 전체 50 ㎕의 볼륨으로 2 ㎕의 주형 DNA mix(개별 DNA 10 ng), 5 ㎕의 반응 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP mix, 0.5 ㎕의 Ex Taq 폴리머라제 (TaKaRa, Japan), 4 ㎕의 프라이머 믹스(개별 프라이머 10 pmol), 37.5 ㎕의 뉴클레아제 프리 워터로 구성하였다. 혼합물은 다음과 같은 순서로 반응하여 분석하였다: ① 95℃에서 2분 ② 95℃에서 30초 ③ 55~57℃에서 1분 ④ 72℃에서 30초 내지 1분(최종 PCR산물의 길이에 따른 변동, 1kb 합성에 1분 소요) ⑤ 72℃에서 10분 ⑥ 4℃, 이 과정에서 번호 ②~④과정은 35회 반복하였다.
도 4는 고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트를 사용하여 PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다: lane 1, TMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 2, TMGMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 3, CMV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane 4, PMMoV 특이적 증폭용 프라이머 세트 하나만 첨가; lane mix, 4종의 프라이머 세트 모두 첨가. 도 4에 나타낸 바와 같이, 바이러스 종류에 따라 PCR 산물의 크기별 명확한 단일 밴드를 확인할 수 있었다.
이러한 조건을 바탕으로, 확인된 바이러스 감염주에서 추출한 전체 RNA를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다. 바이러스 4종의 프라이머 Tm 값이 모두 다르고, 증폭 밴드의 사이즈도 다르기 때문에 어닐링(annealing) 온도 및 연장(extension) 시간의 조정이 필요하였다. 이를 위하여 어닐링 온도는 55℃ 내지 60℃ 사이에서 1℃씩의 조건 변화로 테스트하였고, 연장 시간은 가장 큰 밴드사이즈인 800 bp와 가장 작은 밴드사이즈인 200 bp를 고려하여 30초 내지 1분 사이의 시간에서 10초 간격으로 테스트하였다.
또한, 바이러스의 프라이머 세트간 농도 구배도 반응 결과에 중요한 역할을 하므로, 프라이머 세트 당 10 pmol 기준으로 4세트 모두 같은 농도, 또는 여러 가지 농도 구배로 테스트하였다.
도 5는 식물의 전체 RNA에 대하여 4종의 바이러스 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV를 증폭하기 위한 프라이머를 사용하여 mRT-PCR을 수행한 결과이다: 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMov의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 5:2.5:2.5:10 pmol; lane 2 및 5, 2.5:2.5:2.5:10 pmol; lane 3 및 6, 5:5:5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 어닐링 온도의 차이 또는 프라이머 농도 구배의 차이에서 4종의 RT-PCR 산물의 밴드 밀도에 차이를 보였으며, 도 5의 lane 1의 결과에서처럼 적절한 프라이머 농도 구배를 찾았고, TMV(5 pmol), TMGMV(2.5 pmol), CMV(2.5 pmol), 및 PMMoV(10 pmol)의 농도에서 가장 적합함을 확인하였다.
(3) 고추 종자를 감염시키는 바이러스 4종의
동시다중
검출 민감도 확인
앞서 확인한 프라이머 농도와 조건으로, 바이러스 감염주에서 추출한 RNA에 대하여 다음과 같이 one-step mRT-PCR을 수행하였다.
먼저, 전체 25 ㎕의 볼륨으로 1 ㎕의 주형 RNA (평균 200 ng/㎕), 5 ㎕의 반응 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP 믹스, 1 ㎕의 효소 믹스, 1 ㎕의 프라이머 믹스(개별세트 TMV 증폭용 프라이머 세트 5 pmol/㎕, TMGMV 증폭용 프라이머 세트 2.5 pmol/㎕, CMV 증폭용 프라이머 세트 2.5 pmol/㎕, PMMoV 증폭용 프라이머 세트 10 pmol/㎕), 16 ㎕의 뉴클레아제 프리 워터로 구성하였다. 이 혼합물을 ① 50℃에서 5분 ② 95℃에서 15분 ③ 95℃에서 40초 ④ 55℃에서 1분 ⑤ 72℃에서 40초 ⑥ 72℃에서 10분 ⑦ 4℃, ③~⑤과정은 33회 반복의 순서로 mRT-PCR을 수행하였다. 이때, 주형 RNA의 농도를 200, 100, 50, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎕로 희석하여, 검출 민감도를 테스트하였다.
도 6은 4종의 바이러스 동시다중 검출의 민감도를 테스트하기 위하여, 바이러스의 이병주로부터 추출한 전체 RNA의 농도가 200, 100, 50, 10, 1, 0.1, 0.01 ng/㎕일 때, mRT-PCR을 수행한 결과이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 주형 RNA의 농도가 0.01 ng/㎕인 경우에도 4종 바이러스의 검출이 가능하였으므로, 검출 민감도가 매우 높음을 확인하였다.
또한, 상기와 동일한 조건으로, 국내 고추 유통 종자 156 품종에서 추출한 전체 RNA와 양성대조 그리고 음성대조(주형만 없음)의 구성으로 one-step mRT-PCR 수행 후, 전기영동으로 밴드 유무를 확인하였다.
도 7은 국내 유통 고추 종자 156 품종의 전체 RNA을 주형으로 mRT-PCR을 수행한 결과이다. 이 결과는 전체 결과의 일부분이며, (+): 양성대조, (-): 음성대조(주형 없음), *: 3종 바이러스의 복합 검출 결과이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 4종의 바이러스 진단 결과 50% 이상의 종자에서 PMMoV와 TMV 2종의 복합 감염이 확인되었고, 몇 종의 샘플에서는 3종 바이러스의 복합 감염이 확인되었다. 3종의 복합 감염은 PMMoV+TMGMV+TMV 혹은 PMMoV+CMV+TMV의 조합이었다.
따라서, 고추 종자 시료로부터 TMV, TMGMV, CMV, 및 PMMoV 4종의 바이러스의 동시다중 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예
4. 고추 식물체를 감염시키는 바이러스 6종의
동시다중
검출
(1) 노지 고추 재배지에서 채집한 바이러스 감염 의심주의 전체 RNA 추출
고추 재배지, 특히 노지에서의 고추 재배 시 곤충에 의해 매개가 되는 바이러스병인 CMV, TSWV, 및 BBWV2이 가장 큰 피해를 주고 있다. 또한, 접촉 감염에 의하여 이전부터 문제가 되었던 토바모바이러스(Tobamovirus) 그룹의 바이러스들인 PMMoV, TMGMV, 및 TMV도 충 매개 바이러스와 함께 복합 감염으로 큰 피해를 주고 있다.
상기 6종의 바이러스의 동시다중 검출방법을 개발하기에 앞서, 노지에서 바이러스 의심 증상의 고추 감염주를 채집하였다. 식물체의 수세가 약하며 모자이크 증상을 보이는 것이 가장 흔한 증상이었으며, 동심원의 병징을 보이는 잎도 채집하였다. 이병주는 Plant RNA mini kit로 전체 RNA를 추출하였고, 추출한 RNA는 UV-분광광도계를 이용하여 농도 및 순도를 측정하였다. 이렇게 추출한 RNA를 하기 실험에서 사용하였다.
(2) 고추 식물체를 감염시키는 바이러스 6종의
동시다중
검출
TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 6종의 바이러스를 검출하기 위한 방법도 상기 4종의 검출법 개발 방법과 같이 일련의 과정들을 거쳐 테스트하였다.
바이러스 양성대조 클론의 DNA를 이용한 PCR 조건은 50 ㎕의 볼륨으로 3 ㎕의 주형 DNA 믹스(개별 DNA 10 ng), 5 ㎕의 반응 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP 믹스, 0.5 ㎕의 Ex Taq 폴리머라제, 6 ㎕의 프라이머 믹스(개별 프라이머 10 pmol), 34.5 ㎕의 뉴클레아제 프리 워터로 반응 혼합물을 만들고, 이 혼합물을 ① 95℃에서 2분 ② 95℃에서 30초 ③ 55~57℃에서 1분 ④ 72℃에서 30초에서 1분 ⑤ 72℃에서 10분 ⑥ 4℃, 이 과정에서 번호 ②~④과정은 35회 반복의 조건으로 수행하는 것으로 하였다.
도 8은 6종 바이러스의 양성대조 DNA를 주형으로 PCR 수행 후 전기영동으로 분석한 결과이다: lane 1, TMV 양성대조; lane 2, TSWV 양성대조; lane 3, TMGMV 양성대조; lane 4, BBWV2 양성대조; lane 5, CMV 양성대조; lane 6, PMMoV 양성대조; mix, 6종 혼합 양성대조. 도 8에 나타낸 바와 같이, DNA 수준에서 6종의 프라이머 세트 혼합물은 바이러스 단일 및 복합 검출이 가능함을 확인하였다.
이러한 조건을 바탕으로 RT-PCR 반응의 dNTP농도, 어닐링 온도, 연장 시간 등을 조정하고 테스트하였다. 그 결과, 최종 프라이머 농도는 TMV(5 pmol), TSWV(2.5 pmol), TMGMV(2.5 pmol), BBWV2(5 pmol), CMV(2.5 pmol), PMMoV(5 pmol)로 확인하였다. 이러한 프라이머 농도를 이용하여 다음과 같은 반응 조건을 최종 확립하였다. 전체 25 ㎕의 볼륨으로 1 ㎕의 주형 RNA (평균 200 ng/㎕), 5 ㎕의 반응 버퍼, 1 ㎕의 10 mM dNTP 믹스, 1 ㎕의 효소 믹스, 1.5 ㎕의 프라이머 세트 믹스(TMV 증폭용 프라이머 세트 5 pmol/㎕, TSWV 증폭용 프라이머 세트 2.5 pmol/㎕, TMGMV 증폭용 프라이머 세트 2.5 pmol/㎕, BBWV2 증폭용 프라이머 세트 5 pmol/㎕, CMV 증폭용 프라이머 세트 2.5 pmol/㎕, PMMoV 증폭용 프라이머 세트 5 pmol/㎕), 15.5 ㎕의 뉴클레아제 프리 워터의 반응 혼합물로, ① 50℃에서 5분 ② 95℃에서 15분 ③ 95℃에서 40초 ④ 55℃에서 1분 ⑤ 72℃에서 40초 ⑥ 72℃에서 10분 ⑦ 4, ③~⑤과정은 32회 반복의 프로그램으로 RT-PCR을 수행하였다. 6종의 검출법 역시 mRT-PCR 민감도 테스트를 위하여 200 ng ~ 0.01 ng 농도의 전체 RNA 혼합물을 주형으로 사용하여 RT-PCR을 수행하였고, 종자 감염 4종 바이러스의 검출법과 같이 6종의 검출법에서도 0.01 ng의 RNA도 진단이 가능함을 확인하였다.
도 9는 고추 식물체의 전체 RNA에 대해 6종의 프라이머 세트를 사용하여 수행한 mRT-PCR의 결과이다: RT-PCR 조건의 어닐링 온도는 55℃(lane 1-3) 또는 57℃(lane 4-6)이고, 연장 시간은 40초이며, TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 프라이머 세트 농도는 lane 1 및 4, 2.5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 2 및 5, 5:2.5:2.5:5:2.5:5 pmol; lane 3 및 6, 2.5:2.5:2.5:10:2.5:10 pmol로 설정하여 수행한 결과이다.
도 10은 노지 고추 재배지에서 바이러스 의심 증상 샘플을 채집 후 6종 바이러스의 동시다중 검출법으로 분석한 결과이다.
도 11은 노지 고추 재배지에서의 바이러스 증상을 육안으로 관찰한 결과와 6종 동시다중 검출법의 결과를 정리한 것이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 일반적인 모자이크 증상을 보였던 샘플은 최소 2종 이상의 바이러스 복합 감염을 확인하였다. 또한, 복합 감염에서 바이러스 종류에 따라 바이러스 감염 증상도 다름을 확인할 수 있었다.
따라서, 6종의 프라이머 세트를 이용하여 최대 4종의 바이러스 복합 감염의 검출을 확인하였을 뿐만 아니라, 6종의 바이러스 모두 샘플에서 검출이 됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 프라이머 세트는 바이러스의 단일 검출과 동시다중 검출에 모두 효과적임을 알 수 있었다.
<110> KOREA SEED AND VARIETY SERVICE
<120> Primer set for detecting pathogenic virus in Solanaceae, and
method for detecting the virus thereof using the same
<130> PN116533
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV CP 101F primer
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TMV CP 300R primer
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cggattttct acttctatta tccta 25
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> PMMoV RdRp 1088R primer
<400> 12
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Claims (15)
- 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트;
서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트;
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트;
서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및
서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트를 포함하는, 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus: TMV), 토마토반점시들음바이러스(Tomato spotted wilt virus: TSWV), 담배연녹모자이크바이러스(Tobacco mild green mosaic virus: TMGMV), 잠두시들음바이러스2(Broad bean wilt virus 2: BBWV2), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus: CMV), 및 고추순한얼룩바이러스(Pepper mild mottle virus: PMMoV) 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트. - 삭제
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 가지과 작물 중의 상기 표적서열을 증폭하기 위한 프라이머 세트.
- 청구항 4에 있어서, 상기 가지과 작물은 고추, 토마토, 및 담배로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 프라이머 세트.
- 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트;
서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트;
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트;
서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및
서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트를 포함하는, 담배모자이크바이러스(TMV), 토마토반점시들음바이러스(TSWV), 담배연녹모자이크바이러스(TMGMV), 잠두시들음바이러스2(BBWV2), 오이모자이크바이러스(CMV), 및 고추순한얼룩바이러스(PMMoV) 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 조성물. - 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 세트;
서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머 세트;
서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제3 프라이머 세트;
서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제4 프라이머 세트;
서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제5 프라이머 세트; 및
서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 및 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함하는 제6 프라이머 세트를 포함하는, 담배모자이크바이러스(TMV), 토마토반점시들음바이러스(TSWV), 담배연녹모자이크바이러스(TMGMV), 잠두시들음바이러스2(BBWV2), 오이모자이크바이러스(CMV), 및 고추순한얼룩바이러스(PMMoV) 중 하나 이상의 바이러스의 표적서열을 증폭하기 위한 키트. - 가지과 작물로부터 유래된 핵산을 주형으로 하고 청구항 1의 제1 내지 제6 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 세트를 프라이머로 사용하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 산물의 존재 여부에 기반하여, 상기 가지과 작물 중에 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 가지과 식물체 중 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재 여부를 결정하는 방법. - 청구항 8에 있어서, 상기 가지과 작물은 고추, 토마토, 및 담배로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 핵산은 상기 가지과 작물의 잎, 종자, 또는 그의 조합으로부터 유래된 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR)인 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 증폭은 RT-PCR인 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 증폭은 단일 PCR 또는 다중 PCR인 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 증폭에서, 어닐링 온도는 54 내지 57 ℃인 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 결정하는 단계에서,
상기 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 하나 이상의 표적서열이 증폭된 경우, 상기 식물체 중에서 상기 하나 이상의 표적 서열에 대응되는 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 하나 이상이 존재하는 것으로 결정하고,
상기 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV의 하나 이상의 표적서열이 증폭되지 않은 경우, 상기 식물체 중에서 상기 하나 이상의 표적 서열에 대응되는 TMV, TSWV, TMGMV, BBWV2, CMV, 및 PMMoV 중 하나 이상이 존재하지 않는 것으로 결정하는 것인 방법.
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| KR1020160157434A KR101953125B1 (ko) | 2016-11-24 | 2016-11-24 | 가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160157434A KR101953125B1 (ko) | 2016-11-24 | 2016-11-24 | 가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family
ID=62635385
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160157434A KR101953125B1 (ko) | 2016-11-24 | 2016-11-24 | 가지과 식물체에서 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스의 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101953125B1 (ko) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101301865B1 (ko) * | 2011-03-08 | 2013-09-03 | 대한민국 | 가지과 식물체에서 병원성 세균 및 병원성 바이러스의 표적서열 증폭을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 병원균 검출 방법 |
-
2016
- 2016-11-24 KR KR1020160157434A patent/KR101953125B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20180058453A (ko) | 2018-06-01 |
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