CN116004902A

CN116004902A - 检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组

Info

Publication number: CN116004902A
Application number: CN202211724697.8A
Authority: CN
Inventors: 刘迪秋; 梁婷婷; 李文云; 甘昆发; 车晓莉; 顾悦
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明公开了一种检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组，本发明选用茄腐镰刀菌的D‑氨基酸氧化酶基因作为特异性位点，设计了6条能在65℃下恒温扩增该基因的特异性引物，用10×TE缓冲液裂解样品DNA，配制LAMP扩增体系，反应条件为65℃30s,共40‑45个循环，通过检测荧光信号判断测试样品中是否存在茄腐镰刀菌，并建立标准曲线用于茄腐镰刀菌的定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明能快速准确检测三七植株各部位及种植土壤中茄腐镰刀菌的数量动态变化，可为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗流通过程中的带菌分子检测提供技术支持。

Description

检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组

技术领域

本发明属于植物病原菌检测技术领域，具体地，涉及一种利用实时荧光LAMP检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组和试剂盒。

背景技术

三七（ Panax notoginseng (Burk.) F. H. Chen）是五加科人参属多年生草本植物，又名田七、金不换、滇三七等，其根和根茎是用于改善血液循环和治疗内外伤口的珍贵中药。由于三七需要比较特殊的生长条件，因此主要种植在中国西南部，特别是云南省文山自治州。三七在云南省文山自治州种植已有400多年的历史。三七喜阴湿环境，栽培三年才能入药，生长过程中容易受到包括真菌、细菌和病毒在内的多种病原体的侵染。三七的病害多种多样，主要根腐病、病毒病、叶斑病等，病害的发生严重影响了三七药材的产量和品质。

根腐病是三七种植过程中一种常见且广泛传播的土传性病害，由镰刀属真菌引起的根腐病是其中发病率严重的一种，其中茄腐镰刀菌（ Fusarium solani）是三七根腐病的重要致病菌。病原菌通过根尖侵染植物根部伤口，初期根部须根病变腐烂，此时植株地上部分不会出现明显症状，后期可以观察到三七叶片枯黄凋落，这时病变已蔓延到主根，导致整个根部和茎部发黑腐烂，同时病变植株具有传播性。根腐病是影响三七产业健康发展的重要难题，迫切需要加强三七根腐病快速分子检测等方面的基础研究工作。开发一种三七根腐病菌的现场快速分子检测技术对于根腐病的防治尤为重要。

传统对植物致病菌的检测主要是组织分离培养鉴定法和基于PCR的检测方法。组织培养鉴定病原菌主要依据菌落形态及生长特征，分生孢子的形状、大小等，然而对病原菌分离纯化培养时容易受到杂菌的影响，且病原菌菌落形态特征也受环境条件的影响，这种方法不仅耗时费力，且准确性不高。基于PCR的检测方法主要通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分析病原菌，检测敏感、准确、迅速，但这些检测方法需要复杂、繁琐的操作步骤，不仅检测成本较高，而且对实验技术要求较高，因而难以胜任现场化便携式快速检测，不能满足对病原菌进行实地快速检测的要求。此外对一些处于潜伏期、丰度低的病原菌可能会漏检、延误防治，最终导致病害的大爆发。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种在等温条件下高特异性、高效率和快速扩增DNA的技术，该技术在恒温下能够利用很少拷贝的DNA快速扩增到10⁹，且不需要大型实验仪器和专业的技术人员操作，适用于实验室外的快速高通量检测，该方法针对靶基因序列设计4或6条特异性引物，利用 Bst DNA聚合酶在65℃左右的恒温条件下进行30-60分钟的反应完成扩增，与传统的实时荧光PCR反应相比，具有更高的扩增效率，没有热循环造成的时间损失，操作简单。目前该技术被广泛应用于病原菌的检测，特别在检测真菌、细菌、病毒和害虫等方面具有独特的优势。迄今为止，采用LAMP方法检测三七根腐病菌的技术体系还不成熟。因此，很有必要研发一种能快速、准确检测三七根腐病菌的LAMP技术体系。

发明内容

针对现有技术中对三七根腐病菌茄腐镰刀菌的检测和鉴定，程序繁琐，耗时长，对鉴定经验要求高，准确度低，难以满足三七根腐病菌实地快速准确诊断的现状，本发明提供了检测三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP引物组及包含该引物组的实时荧光LAMP检测试剂盒，通过该试剂盒可简单、快捷地检测出携带茄腐镰刀菌的植株、土壤、种苗，克服了病原检测对仪器依赖性较强的局限性。

本发明中，利用LAMP技术快速检测三七根腐病菌茄腐镰刀菌的引物组为：

DA1-F3: 5’-GCGAGGAAGATTGTGCTT-3’;

DA1-B3: 5’-CTTGCCGTTGGCAATCTC-3’;

DA1-FIP: 5’-AGCTGCTCGCTGCATCAGCTCATCACTTCAGGTGTCG-3’;

DA1-BIP: 5’- GGTACCATCCTGGGCGGTAATGTTAGGGTCTGGCTGA-3’;

DA1-LoopF: 5’- GTACATGACATCAGCACCG-3’;

DA1-LoopB: 5’- TGTTGGCAACTGGGAGTC-3’。

茄腐镰刀菌的D-氨基酸氧化酶基因（D00809）为特异性检测位点。

本发明还提供了一种含有上述引物组的三七根腐病菌茄腐镰刀菌特异性实时荧光LAMP检测试剂盒，其包括上述引物组以及LAMP检测所需的常规检测试剂（10×TE缓冲液，实时荧光LAMP反应液A、反应液B、反应液C）；

25μL实时荧光LAMP检测体系包括以下溶液：

10μL反应液A：含有10× Isothermal Amplification Buffer II2.5μL、10mMMgSO₄、1mM dNTP Mix、0.4U/μL Bst 3.0 DNA聚合酶、20×Eva Green1.25μL的无酶水；

5μL反应液B：含有0.125μM DA1-F3、0.125μM DA1-B3、1μM DA1-FIP、1μM DA1-BIP、0.25μM DA1-LoopF、0.25μM DA1-Loop B的无酶水；

反应液C（无酶水）: 去除核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的超纯水；

10×TE缓冲液为含有100mM Tris-HCl (pH8.0)、10mM EDTA(pH8.0)的水溶液。

实时荧光LAMP检测试剂盒还包括阳性质粒，阳性质粒为插入了D氨基酸氧化酶基因的T载体（pGEM-T- DA）。

利用上述试剂盒检测三七根腐病菌茄腐镰刀菌的方法如下：

（1）样品采用10×TE缓冲液制备实时荧光LAMP反应模板；

（2）配制25μL实时荧光LAMP检测体系；

（3）取步骤（1）制备的模板加入到步骤（2）配制的实时荧光LAMP检测体系中，混匀，在65℃恒温进行实时荧光LAMP反应，反应条件为65℃ 30s，共40-45个循环，反应结束后进行熔解曲线分析（95℃反应0.05s；65℃反应0.05s，按0.5℃/step的升温速率递增到95℃）；

（4）实时荧光LAMP标准曲线的建立

制备浓度在0.009pg/μL～90ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T- DA溶液，以不同浓度的溶液作为模板进行实时荧光LAMP反应，反应体系与扩增程序同步骤（2）和（3），以各浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；

（5）结果诊断：步骤（3）若出现荧光信号则判定所检测样品中存在根腐病致病菌茄腐镰刀菌，并将获得的Ct值带入茄腐镰刀菌的标准曲线中，计算得到检测样品中茄腐镰刀菌的含量。

本发明的优点在于：

（1）准确性高：本发明是根据基因序列在真菌种内的高度保守性和属种间可变性的特点设计对三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌具有特异扩增作用的LAMP引物，只在根腐病病株的腐烂根部及其土壤中特异性扩增出茄腐镰刀菌，说明本发明所设计的引物用于检测三七根腐病菌茄腐镰刀菌准确可靠；

（2）灵敏度高：本发明将设计的特异引物进行实时荧光LAMP分析，对三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到0.009pg/μL；

（3）样本处理简单：本发明用10×TE缓冲液快速裂解检测所需的样本，这种样本进行简单处理后可以直接作为模板使用，免去了传统的CTAB法制备样本的繁琐，可以在田间快速制备样本进行茄腐镰刀菌的检测；

（4）适用性广、实用性好：本发明的三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP检测方法，不仅能对病菌菌丝体进行检测，也能对感病的三七根部、叶片、种子、种苗以及土壤样品进行检测，可实现三七根腐病的早期检测，即在病害显症前进行检测，防治病害的爆发流行。

附图说明

图1为验证茄腐镰刀菌D-amino acid oxidase基因特异性的扩增电泳图，其中泳道Marker为2000 bp DNA Marker，泳道1为空白对照（无模板），泳道2为茄腐镰刀菌，泳道3为交链格孢菌，泳道4为木贼镰刀菌，泳道5为弯孢霉，泳道6为禾谷镰刀菌，泳道7为厚垣镰刀菌，泳道8为草茎点霉，泳道9为尖孢镰刀菌；

图2为本发明引物对八种病原真菌进行实时荧光LAMP的扩增曲线图（上图）以及熔解曲线图（下图），其中八种病原真菌分别为尖孢镰刀菌、禾谷镰刀菌、木贼镰刀菌、厚垣镰刀菌、草茎点霉、交链格孢、茄腐镰刀菌和弯孢霉；

图3为本发明携带茄腐镰刀菌D氨基酸氧化酶基因片段的重组质粒的实时荧光LAMP的扩增曲线图，其中1至8号分别为浓度为90ng/μL、9ng/μL、0.9ng/μL、0.09ng/μL、0.009ng/μL、0.9pg/μL、0.09pg/μL和0.009pg/μL重组质粒（pGEM-T- DA）标准品的实时荧光定量扩增曲线；

图4为以Ct值为横坐标，以质粒标准品质量对数值为纵坐标建立的标准曲线图（左图）和Ct值（右图）；

图5为应用本发明引物以及检测方法对三七田间样品进行实时荧光LAMP的扩增结果图。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，本实施例中方法如无特殊说明的均按常规方法操作，所用试剂如无特殊说明的采用常规试剂或按常规方法配置的试剂。

实施例中菌种为茄腐镰刀菌（ Fusarium solani）、尖孢镰刀菌（ F. oxysporum）、木贼镰刀菌（ Fusarium equiseti）、禾谷镰刀菌（ F. graminearum）、厚垣镰刀菌（ F. chlamydosporum）和草茎点霉（ Phoma herbarum）、交链格孢（ Alternaria alternata）和弯孢霉（ Curvularia trifolii）；检测样品采自云南省文山州三七种植基地。

实施例1：茄腐镰刀菌D氨基酸氧化酶基因特异性分析

根据前期研究结果选择茄腐镰刀菌的D-氨基酸氧化酶基因（D00809）作为检测靶点，并设计特异PCR引物，上游引物F为 5’-CGGGTCTCGGCTCCTACAA-3’、下游引物R 为5’-CGATCCTGACTCCGTCCTTTC -3’，引物序列委托昆明硕擎生物科技有限公司合成。

以下几种病原真菌作为筛选的模板：茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、厚垣镰刀菌、草茎点霉、交链格孢和弯孢霉；采用CTAB法提取真菌菌丝的基因组DNA，采用紫外分光光度计检测提取的DNA纯度和质量浓度。

以上述几种病原真菌的基因组DNA为模板进行PCR，以检测引物的特异性，PCR反应体系（20 μL）如下：2×Rapid Taq Master Mix 10μL、无菌双蒸水7μL、上游引物F (2μM) 1μL、下游引物R (2μM) 1μL、DNA模板1μL；PCR扩增条件为：95℃ 3 min；94℃ 15 s, 57℃ 30s, 72℃ 30 s, 28个循环；72℃ 5min。PCR产物通过1.4%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，这对引物只在以茄腐镰刀菌DNA为模板的PCR扩增中产生了250bp到500bp之间的扩增产物，可初步认定本实验设计的引物具有种间特异性，利用本引物只在茄腐镰刀菌中产生特异的条带，而在其他三七病原真菌中不引起有效扩增，因而能特异地将茄腐镰刀菌与其他病原菌区分开来，结果见图1。

进而将PCR产物进行T-A克隆，选择pGEM®-T easy Vector System (Promega,USA)作为克隆载体，与茄腐镰刀菌的PCR扩增产物进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，随后挑选阳性克隆测序，并对测序结果进行生物信息学分析。测序结果与预期扩增产物长度360bp相符，利用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在线分析工具对测序得到的序列与GenBank中的基因序列进行同源性分析，结果显示扩增序列与茄腐镰刀菌的D-amino acid oxidase (D00809)基因有99%的相似性。

实施例2：特异性实时荧光LAMP检测方法的建立

利用LAMP Designer软件设计LAMP引物组（DA1-F3、DA1-B3、DA1-FIP、DA1-BIP、DA1-LoopF、DA1-LoopB），引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

25μL LAMP扩增体系为：10μL反应液A、5μL反应液B、9μL反应液C、DNA模板1μL；反应条件为65℃ 30s，共40个循环，反应结束后进行熔解曲线分析（95℃ 0.05s，65℃ 0.05s，按0.5℃/step的升温速率递增到95℃）。

以ddH₂O以及上述实施例1使用的其他7种真菌基因组DNA模板作为对照，每个模板设置3次重复，以验证本发明中LAMP引物检测茄腐镰刀菌的特异性；本实施例中所用真菌的基因组DNA均采用CTAB法提取；

结果见图2，图中显示只在以茄腐镰刀菌基因组DNA为模板的LAMP反应中出现扩增曲线，三个重复得到三条重合的扩增曲线，其Ct值分别为23.50、23.53、23.93，熔解曲线峰型单一，峰值均在92℃左右，在模板分别为尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、厚垣镰刀菌、草茎点霉、交链格孢、弯孢霉的LAMP反应中未检测到扩增曲线和熔解曲线。说明这套引物适用于三七根腐病菌茄腐镰刀菌的实时荧光LAMP检测。也表明所建立的LAMP 引物以及检测体系能对茄腐镰刀菌的基因组DNA 进行特异性扩增，不能与其余7种菌株的DNA发生特异性反应，该实时荧光LAMP检测体系可以将三七根腐病菌茄腐镰刀菌与其它病原菌区分开来，具有种的特异性。

实施例3：特异性实时荧光LAMP检测方法的灵敏度测试

将实施例1制备的携带茄腐镰刀菌D氨基酸氧化酶基因片段的重组质粒（pGEM-T- DA）作为标准品，并测定质粒浓度，然后进行10倍的浓度梯度稀释，共设置8个浓度，分别为90ng/μL、9ng/μL、0.9ng/μL、0.09ng/μL、0.009ng/μL、0.9pg/μL、0.09pg/μL和0.009pg/μL，稀释介质为无核酸酶水。对8个浓度的标准品进行LAMP反应灵敏度测试。实时荧光LAMP反应体系和反应条件同实施例2，实时荧光扩增曲线见图3；结果显示本发明中LAMP检测方法的灵敏度是0.009pg/μL，同时以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，在Excel软件中生成标准曲线，得到线性回归方程为y = -0.3419x + 5.631，R²=0.9956，建立的标准曲线见图4。

实施例4：三七根腐病菌茄腐镰刀菌实时荧光LAMP快速检测方法的应用，为了确定实施例2建立的快速检测方法以及10×TE缓冲液快速裂解样本的方法是否适用于三七及土壤样品中茄腐镰刀菌的检测，具体操作如下：

样品采集：采集三七根腐病样本、根腐病土壤样本和正常三七及正常土壤样本，并进行编号，1-5号为感染根腐病的三年生三七病株，6-9号为根腐病病株的根际土壤样品，10-12号为正常三七植株，13-15号为正常三七的土壤样本，16号为无模板的阴性对照（仅含有50μL 10×TE缓冲液）。

10×TE缓冲液制备样本：用无菌剪刀剪下0.01g病根或正常根，用称量勺称取0.01g土壤样本，放置于含有50μL 10×TE缓冲液的离心管中，用研磨杵充分研磨，静置5min，取静置后的10×TE缓冲液裂解上清液1μL作为反应模板。

扩增检测：取上述裂解上清液1μL样本为模板，配制25μL LAMP扩增体系：10μL反应液A、5μL反应液B、9μL反应液C，反应条件为65℃ 30s, 共45个循环。

检测结果见图5，结果显示三七根腐病根部及根腐病病株的根际土壤样品中可以检测到茄腐镰刀菌的存在，其中1-5号为感染根腐病的三年生三七病株的曲线，6-9号为根腐病病株根际土壤样品的扩增曲线，样品出现明显的“S”型扩增曲线，而在其他编号的正常三七及其土壤样本和阴性对照样本中未见明显扩增；上述实验结果显示，本实验设计的引物以及建立的实时荧光LAMP快速检测体系能够诊断三七及其土壤样品中是否含有茄腐镰刀菌。

Claims

1.一种检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组，其特征在于，引物组的核苷酸序列为：

DA1-F3: 5’-GCGAGGAAGATTGTGCTT-3’

DA1-B3: 5’-CTTGCCGTTGGCAATCTC-3’；

DA1-FIP: 5’-AGCTGCTCGCTGCATCAGCTCATCACTTCAGGTGTCG-3’

DA1-BIP: 5’- GGTACCATCCTGGGCGGTAATGTTAGGGTCTGGCTGA-3’；

DA1-LoopF: 5’- GTACATGACATCAGCACCG-3’

DA1-LoopB: 5’- TGTTGGCAACTGGGAGTC-3’。

2.含有权利要求1所述的检测三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的引物组的试剂盒。