CN108728573B - 一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种鉴别铁皮石斛的荧光pcr检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。该试剂盒包括铁皮石斛特异引物和特异探针，核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示；石斛属通用引物和通用探针核苷酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增可以对铁皮石斛及石斛属植物加以鉴别。本发明以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，为真正的铁皮石斛在中药市场的地位保驾护航。

Description

一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)系兰科石斛属多年生草本植物，为我国传统名贵药材，以新鲜或干燥的茎入药，有味甘、质重、黏性大等特点。铁皮石斛在《神农本草经》和《本草纲目》中均被列为上品，被誉为“中华九大仙草”之首，具有“养阴生津，润喉护嗓，温胃明目，补肾益力，延年益寿”的功效。现代的化学成分和药理研究表明：铁皮石斛还具有抗肿瘤、抗衰老、增强机体免疫力和有效减轻肝损伤等作用。由于其极高的药用价值，导致市场价格也随之攀升；另一方面铁皮石斛经过加工成干品之后，几乎无法从外观上辨别真伪；但在选购过程中混杂，特别容易使消费者成为“冤大头”。因此，辨别铁皮石斛的真伪，建立系统、准确、有效的中药铁皮石斛鉴定方法显得尤为重要，这样既可以让消费者买到质量有保障的产品，也可以提高消费者对铁皮石斛的认知，可谓一举二得。
目前常用的药材鉴定方法有组织鉴定、显微鉴定、光谱鉴定、色谱鉴定、分子生物学技术鉴定等，但是这些方法会存在感官检测局限性、准确性低、仪器配套成本高、鉴别操作复杂等问题。近年来实时荧光PCR技术检测的灵敏度、特异性和准确性，受到了很多研究领域的一致认可。本发明将该技术应用于铁皮石斛的真伪鉴定中，为市场上真正有品质、有疗效的铁皮石斛中药材保驾护航。
发明内容
本发明提供了一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用。本发明的试剂盒具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，它包括铁皮石斛特异引物和特异探针，石斛属通用引物和通用探针，其中，
铁皮石斛特异上游引物TPF：5’-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-3’(SEQ ID NO.1)；
铁皮石斛特异下游引物TPR：5’-AGGCCTATGCTATTGTGATAAGCG-3’(SEQ ID NO.2)；
铁皮石斛特异探针TPP：5’-X1-TATTGTGATAAGCGCGCCCG–Y1-3’(SEQ ID NO.3)；
石斛属通用上游引物USHF：5’-GGCAATGGATATCTCGGCTC-3’(SEQ ID NO.4)；
石斛属通用下游引物USHR：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCG-3’(SEQ ID NO.5)；
石斛属通用探针USHP：5’-X2-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-Y2-3’(SEQ ID NO.6)。
铁皮石斛特异探针TPP和石斛属通用探针USHP，探针序列的5’端修饰有报告基团X1/X2，3’端修饰有淬灭基团Y1/Y2，所述报告基团可以为FAM、HEX、TAMRA、ROX、CY5中的任一种，所述淬灭基团可以为Dabcyl、BHQ1，BHQ2中的任一种。
优选的，铁皮石斛特异探针TPP：5’-FAM-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-BHQ1-3’；
优选的，石斛属通用探针USHP：5’-ROX-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-BHQ2-3’。
进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，其中各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。
进一步的，本发明的荧光PCR检测试剂盒，它还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。
进一步优选的，上述的荧光PCR检测试剂盒，其20μL PCR扩增体系为：2×TaqManMaster Mix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL，其配制方法如表1所示。
表1PCR反应扩增体系
试剂名称 工作浓度 用量(μL) 终浓度
TaqMan Master Mix 2× 10 1×
USHF/USHR引物对 2～10μM 1 0.1～0.5μM
TPF/TPR引物对 2～10μM 1 0.1～0.5μM
TPP探针 1～5μM 1 0.05～0.25μM
USHP探针 1～5μM 1 0.05～0.25μM
DNA模板 0.5～50ng/μL 2 1～100ng
双蒸水 4
总体积 20
进一步的，上述的荧光PCR检测试剂盒，还包括铁皮石斛阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
本发明还提供了一种用于鉴别铁皮石斛真伪的检测方法，其特征是，具体步骤如下：
1)提取待测样本的模板DNA；
2)PCR扩增
使用上述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在4通道或4通道以上的任何型号的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环，根据不同型号的PCR仪的不同要求可以对标记荧光号进行相应的调整；
3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否为铁皮石斛及是否属于石斛属植物。
进一步的，如果FAM、ROX荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；如果只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属非铁皮石斛植物；如果FAM、ROX荧光修饰探针都没有扩增曲线时，则不是石斛属植物。
本发明的有益效果：与现有的技术相比：本发明以石斛的一对通用引物和铁皮石斛的一对特异引物对待测样本DNA提取物进行PCR扩增，以铁皮石斛的特异性荧光探针及石斛属通用探针，以2色荧光对铁皮石斛及石斛属植物加以鉴别。本发明以特异性荧光探针与模板配对，具有高度的特异性与专一性，并且扩增效率高，灵敏度高，准确率高，重现性好，检测周期短，能在1.5小时内完成检测，且能实时检测DNA扩增反应，具有很高的可行性与应用前景，为真正的铁皮石斛在中药市场的地位保驾护航。
附图说明
图1为铁皮石斛在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当FAM、Rox荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；
图2为石斛属非铁皮石斛植物在不同荧光修饰探针下的扩增曲线图；从图中可以看出：当只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属非铁皮石斛植物；
图3为铁皮石斛模板分别为10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng、0.0032ng时的灵敏度扩增曲线图；从图中可以看出：其最低检出限为0.016ng。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用实验材料、试剂与仪器如下：
实验材料：铁皮石斛、黄橙石斛、密花石斛、铜皮石斛、紫皮石斛、竹枝石斛、石豆石斛、霍山米斛、翅梗石斛、天宫石斛、玫瑰石斛、竹叶石斛、金钗石斛、喉红石斛、鼓槌石斛、蝴蝶兰(黄花)、蝴蝶兰(红花)、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡、平贝母、白术、人参。
所用试剂：植物DNA提取试剂盒，DNA分子量MakerDL2000、电泳上样缓冲液等PCR反应试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。引物与探针由生工生物工程(上海)有限公司负责合成。2×TaqMan Master Mix为DBI Bioscience品牌。DNA测序由山东省农业科学院生物技术中心测序中心完成。
所用仪器：ABI 7500荧光定量PCR仪为ABI公司产品，Takara PCR仪为宝生物工程(大连)有限公司产品。5424D型高速离心机为Eppendorf公司产品。
实施例1
1、铁皮石斛样品、其他石斛属及其他中药样本DNA提取：
采用植物DNA提取试剂盒提取，具体操作步骤见试剂盒说明书。提取的基因组DNA经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定OD260/OD280值均为1.8～1.9左右，浓度在10ng/μL以上，说明DNA纯度较高，浓度适中，符合PCR扩增要求。
2、靶基因的选择和引物的设计：基于DNA条形码技术，选择ITS2基因作为靶基因，设计石斛通用引物和通用探针、设计铁皮石斛特异引物和特异探针。引物及探针的核苷酸序列见表2。
表2引物及探针的核苷酸序列
Figure BDA0001694508110000041
3.荧光检测：
优先选用20μL的实时荧光PCR扩增体系，反应体系见表3。
表3PCR反应体系
试剂名称 浓度 用量(μL)
TaqMan Master Mix 2× 10
引物组 5μM 1
探针组合物 1-2μM 1
DNA模板 20ng/μL 2
双蒸水 6
总体积 20
4、PCR扩增条件为：95℃2min；95℃10s，64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环。
5、结果分析：每次试验设立铁皮石斛阳性对照、阴性对照及空白对照，试验结束后打开分析软件，分析实验结果，给出ΔRn(第n个循环时的荧光增加值)与扩增曲线Ct值，根据探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定待测样品是否为铁皮石斛。结果见图1，FAM、ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；图2显示当只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本中不含有铁皮石斛类源性成分。
实施例2特异性验证
利用本发明设计的引物和探针，分别以铁皮石斛、黄橙石斛、密花石斛、铜皮石斛、紫皮石斛、竹枝石斛、石豆石斛、霍山米斛、翅梗石斛、天宫石斛、玫瑰石斛、竹叶石斛、金钗石斛、喉红石斛、鼓槌石斛、蝴蝶兰(黄花)、蝴蝶兰(红花)、山药、鸡血藤、枸杞、柴胡、平贝母、白术、人参植物总基因组DNA为模板，进行实时荧光PCR检测，验证其引物和探针的特异性。其结果见表4及图2，结果表明本研究所设计的探针及引物具有很强的特异性。
表4特异性验证试验
Figure BDA0001694508110000051
Figure BDA0001694508110000061
实施例3灵敏度实验
将铁皮石斛的基因组DNA定量到5ng/μL，按5×梯度稀释，每个梯度均取2.0μL为模板量，(即：10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng，0.0032ng)进行实时荧光定量PCR检测，评估本发明的检测限。见图3，结果表明本方法定量检测限为0.016ng，说明本发明所提供的方法具有很高的灵敏度。
实施例4实际样本测试
使用本发明提供的试剂盒及检测方法对山东沃森农业科技有限公司和济南梅园铁皮石斛种植有限公司提供的共31份石斛样品使用优化后的多重实时荧光PCR检测方法检测，其中有16份检测出伪品石斛的源性成分，其余15份均为铁皮石斛。与测序结果进行验证，结果显示本方法与测序结果完全一致，相比形态学及液相方法更加准确可靠，灵敏快速。统计见表5。
表5实际样品检测结果
Figure BDA0001694508110000062
Figure BDA0001694508110000071
。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院生物技术研究中心
<120> 一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒及应用
<130> 0
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tattgtgata agcgcgcccg 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aggcctatgc tattgtgata agcg 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tattgtgata agcgcgcccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggcaatggat atctcggctc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caacttgcgt tcaaagactc g 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tggtgcgaat tgcagaatcc c 21

Claims (7)

1.一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，它包括铁皮石斛特异引物和特异探针，石斛属通用引物和通用探针，其中，
铁皮石斛特异上游引物TPF：5’-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-3’；
铁皮石斛特异下游引物TPR：5’-AGGCCTATGCTATTGTGATAAGCG-3’；
铁皮石斛特异探针TPP：5’-FAM-TATTGTGATAAGCGCGCCCG-BHQ1-3’；
石斛属通用上游引物USHF：5’-GGCAATGGATATCTCGGCTC-3’；
石斛属通用下游引物USHR：5’-CAACTTGCGTTCAAAGACTCG-3’；
石斛属通用探针USHP：5’-ROX-TGGTGCGAATTGCAGAATCCC-BHQ2-3’。
2.如权利要求1所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM。
3.如权利要求1所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述荧光PCR检测试剂盒，它还包括：2×TaqMan Master Mix、DNA模板和双蒸水。
4.如权利要求1-3中任一项所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述的荧光PCR检测试剂盒，其20μL PCR扩增体系为：2×TaqMan Master Mix，各引物终浓度为0.1～0.5μM，各探针终浓度为0.05～0.25μM，0.5～50ng/μL的DNA模板2μL，双蒸水补足20μL。
5.如权利要求4所述的一种鉴别铁皮石斛的荧光PCR检测试剂盒，其特征是，所述的荧光PCR检测试剂盒，还包括铁皮石斛阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
6.一种用于鉴别铁皮石斛真伪的检测方法，其特征是，具体步骤如下：
1)提取待测样本的模板DNA；
2)PCR扩增
使用权利要求1-3中任一项所述的荧光PCR检测试剂盒进行PCR扩增，需要在≥4通道的荧光定量PCR仪上进行，扩增程序：95℃，2min；95℃，10s；64℃，35s，在此收集荧光信号，40个循环；
3)设立阳性对照、阴性对照及空白对照，分析实验结果，给出第n个循环时的荧光增加值ΔRn与扩增曲线Ct值，根据不同探针荧光信号及扩增曲线Ct值来判定是否为铁皮石斛及是否属于石斛属植物。
7.如权利要求6所述的一种用于鉴别铁皮石斛真伪的检测方法，其特征是，判定是否为铁皮石斛及是否属于石斛属植物的方法为：如果FAM、ROX荧光修饰探针均有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为铁皮石斛；如果只有ROX荧光修饰探针有扩增曲线时，且满足Ct≤35说明待检样本为石斛属非铁皮石斛植物；如果FAM、ROX荧光修饰探针都没有扩增曲线时，则不是石斛属植物。
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