CN114438246B - 用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物组、试剂盒和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物对、试剂盒和检测方法，包含1～4对引物，引物对选自：SED ID NO.1‑2所示的引物对1，SED ID NO.3‑4所示的引物对2，SED ID NO.5‑6所示的引物对3，SED ID NO.7‑8所示的引物对4；引物对1、2、3、4分别用于鉴别目标重楼品种滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼。鉴别方法包括步骤：1)提取待测样品的基因组DNA；2)采用的引物对或者的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增，不同的引物对分管扩增；3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴别为目标品种阳性。

Description

用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物组、试剂盒和方法
技术领域
本发明涉及重楼种质鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物组、试剂盒和方法。
背景技术
重楼属(学名：Paris L.)是百合科多年生草本植物，我国有22个种，其中12个特有种，其中滇重楼、华重楼收载于2015年版《中国药典》，是云南白药等多种中药的重要原料之一。球药隔重楼和黑籽重楼也被认为有显著的药用价值收载于2014年版《四川省藏药材标准》。在市场流通中，存在着除药典规定品种以外的其它重楼属植物及伪品用作药用的情况。由于不同重楼种的特性性状交叉重叠，给不同重楼种质鉴定带来困难，难以区分是否是药用重楼。
中国专利申请CN201610116268.0公开了一组PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，但该申请是用于鉴别滇重楼一个种。中国专利申请CN201710357874.6公开了一种快速鉴别重楼品种的试剂盒，其是用于鉴别华重楼、黑籽重楼、球药隔重楼及其混伪品的。中国专利申请CN201810159772.8公开了一种鉴别滇重楼正品及不同基因型的试剂盒、鉴别方法，该申请是针对滇重楼鉴别的，且需要用到两对引物对。且这些专利申请中检测用到的DNA模板量通常都需要几十ng以上，灵敏度不够高，而在鉴定过程中，可能发生获得的样品量很少的情况，这种情况就对检测的引物灵敏度有很高的要求。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种准确、灵敏度高的用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物对，包含1～4对引物，引物对选自：SED ID NO.1-2所示的引物对1，SED IDNO.3-4所示的引物对2，SED ID NO.5-6所示的引物对3，SED ID NO.7-8所示的引物对4；
所述引物对1、2、3、4分别用于鉴别目标重楼品种滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼。
在另一技术方案中，所述的引物对还包含1～4个探针，所述探针的序列选自SEDID NO.9～12所示的序列，SED ID NO.9、SED ID NO.10、SED ID NO.11、SED ID NO.12所示的探针序列分别用于鉴别滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼；
优选探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；进一步优选所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
优选地，所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼。
本发明的另一方面提供一种用于鉴别鉴别重楼品种及其混伪品的试剂盒，包含上述的引物对，还包含PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂。
优选地，所述试剂盒，还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增或者实时荧光PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
本发明的另一方面提供一种鉴别重楼品种及其混伪品的方法，包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用上述的引物对或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增，不同的引物对分管扩增；
3)检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品鉴别为滇重楼和/或华重楼和/或球药隔重楼和/或黑籽重楼阳性；滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼的目的扩增片段的大小依次为394bp、393bp、297bp、339bp。
所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，其中，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl、浓度为10μM的正反向引物各1μl、基因组DNA 1μl、余量为ddH2O；
所述步骤2)中鉴别滇重楼或华重楼或球药隔重楼采用的PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃30s,60℃30s,72℃1min,循环30次；72℃5min；鉴别黑籽重楼采用的PCR扩增的反应条件为：94℃3min；94℃30s,65℃30s,72℃1min,循环30次；72℃5min；
优选所述步骤3)中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
本发明的再一方面提供一种鉴别重楼品种及其混伪品的实时荧光PCR方法，包括如下步骤：
1)提取待测样品的基因组DNA；
2)采用上述的引物对或者上述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，不同的引物对分管扩增，根据扩增结果判断待测对象是否含有目标重楼品种，如果Ct＜30则判断为目标重楼品种阳性，Ct≥30则判断为目标重楼品种阴性。
所述实时荧光PCR的反应体系为：总体积20μl，其中2×Premix Ex Taq 10μl、浓度为10μM的上下游引物各1μl、浓度为10μM的探针0.5μl、基因组DNA 1μl，余量为ddH2O；qPCR扩增程序为：95℃预变性30s，40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s。
本发明的最后一方面提供前述的引物组或者试剂盒在鉴别重楼品种及其混伪品中的应用，所述重楼品种为滇重楼或华重楼或球药隔重楼或黑籽重楼；
优选所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼。
本发明的有益效果是：基于重楼ITS基因的特异性SNP位点，建立了基于滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼的SNP位点特异性的PCR和荧光实时定量PCR的快速、有效的鉴定方法，结果准确可靠，具有优异的重楼品种特异性，能准确区分目标重楼品种及其常见混伪品，且检测灵敏度高达1ng/μl，检测灵敏度很高，为重楼的国际贸易中出口管制、出境查验和市场监管提供技术储备，对于遏制资源流失，有效保护重楼种质资源，促进重楼种质资源研究，保护消费者权益具有重要意义。
附图说明
图1是滇重楼特异性引物普通PCR检测结果，其中，图a是特异性检测结果，泳道1-18依次为表1中对应样品编号，M为DL2000 Marker；图b是引物灵敏度检测结果,泳道1-6依次为浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的模板DNA、ddH2O，M为DL2000 Marker。
图2是华重楼特异性引物普通PCR检测结果，其中，图a是特异性检测结果，泳道1-18依次为表1中对应样品编号，M为DL2000 Marker；图b是引物灵敏度检测结果,泳道1-6依次为浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的模板DNA、ddH2O，M为DL2000 Marker。
图3是球药隔重楼特异性引物普通PCR检测结果，其中，图a是特异性检测结果，泳道1-18依次为表1中对应样品编号，M为DL2000 Marker；图b是引物灵敏度检测结果,泳道1-6依次为浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的模板DNA、ddH2O，M为DL2000 Marker。
图4是黑籽重楼特异性引物普通PCR检测结果，其中，图a是特异性检测结果，泳道1-18依次为表1中对应样品编号，M为DL2000 Marker；图b是引物灵敏度检测结果,泳道1-6依次为浓度为100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.01ng/μl、0.001ng/μl的模板DNA、ddH2O，M为DL2000 Marker。
图5是滇重楼特异性引物实时荧光定量PCR扩增曲线。
图6是华重楼特异性引物实时荧光定量PCR扩增曲线。
图7是球药隔重楼特异性引物实时荧光定量PCR扩增曲线。
图8是黑籽重楼特异性引物实时荧光定量PCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所使用的生物、化学试剂，如无特殊说明，均为市售常规商品，均可商购获得。
实施例1
一、实验材料
实验所用植物材料均为硅胶干燥保存的叶片。凭证标本均保存于原国家质检总局生物物种资源检测鉴定研究中心标本室。本实验共采集重楼属18份植物样品，样品信息如表1中所示。
表1实验用重楼植物材料
二、实验方法和结果
1、DNA提取
硅胶干燥的实验样品叶片100mg置于事先加入4mm钢珠的2ml EP管中，迅速放入液氮中冷冻30min，将EP管置于Geno/Grinder 2000(SPEX SamplePrep)高通量研磨机上，研磨3min，1000rpm/min。采用植物基因组DNA提取试剂盒(DNeasy Plant MiniKit，Qiagen公司)提取叶片总DNA备用，作为后续PCR扩增的模板。
2、特异性引物设计
模板DNA用现有技术文献中公布的ITS引物(ITS-4/ITS-L)进行扩增，扩增体系为25μL反应体系：KOD one PCR Master mix(东洋纺(上海)生物科技有限公司)12.5μL，浓度为10μM的上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加ddH2O至25μL。扩增产物送上海生工测序，测序结果使用Codon Code Aligner3.7.1软件(Codon Code Co.，USA)校对拼接，去除引物。引物ITS-4/ITS-L的序列为：
ITS-4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO.13),
ITS-L：5’-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTC-3’(SEQ ID NO.14)。
在Genbank数据库中下载重楼属及其易混淆种(表2)的ITS序列，所有序列用BioEdit软件进行比对分析，找出具有稳定差异的SNP位点:滇重楼222bp处为A，华重楼为T，其它混淆品为C；华重楼101bp处为A，其它混淆品为C；球药隔重楼281bp处为A，其它混淆品为C；黑籽重楼218bp处为G，其它混淆品为A。用Primer Premier5.0软件在滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼的特有SNP位点分别设计其特异性引物，使SNP位点位于引物的3’末端。
表2 Genbank数据库中重楼属及其易混淆种
为了保证引物的高度特异性，在3’末端的倒数第二或第三个碱基处引入错配碱基，使得引物对非目标DNA有两个碱基的错配，从而提高引物的特异性。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。设计的4对特异性引物序列及PCR扩增程序见表3。
表3四种重楼特异性引物及扩增条件
3、普通PCR特异性扩增及灵敏度检测
用表2中的4对特异性引物分别对表1中的18份材料的样品DNA进行PCR扩增，检测引物的特异性。25μL反应体系：2×Taq PCR Master mix(天根生化科技(北京)有限公司，货号KT201)12.5μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，加ddH2O至25μL。PCR反应程序见表2，反应结束后取5μL扩增产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。
利用本研究中设计的引物对DFM/DR对表1中的18份材料的DNA进行PCR扩增，电泳结果显示只有序号为8-10的三个滇重楼样品有特异性扩增，扩增片段长度约为394bp，其它样品均无扩增片段，说明该引物对滇重楼具有种特异性。特异性检测电泳结果如图1a，同时对扩增序列的BLAST比对结果表明，该目标片段属于滇重楼。PCR灵敏度检测结果如图1b，当模板DNA浓度为1ng/μl时，即可产生明亮的条带。
利用本研究中设计的引物对HFM/HR对表1中的18份材料的DNA进行PCR扩增，电泳结果显示只有序号为1-5的五个华重楼样品有特异性扩增，扩增片段长度约为393bp，其它样品均无扩增片段，说明该引物对华重楼具有种特异性。特异性检测电泳结果如图2a，同时对扩增序列BLAST比对结果表明，该目标片段属于华重楼。PCR灵敏度检测结果如图2b，当模板DNA浓度为1ng/μl时，即可产生明亮的条带。
利用本研究中设计的引物对QYGFM/QYGR对表1中的18份材料的DNA进行PCR扩增，电泳结果显示只有序号为12的一个球药隔重楼样品有特异性扩增，扩增片段长度约为297bp，其它样品均无扩增片段，说明该引物对球药隔重楼具有种特异性。特异性检测电泳结果如图3a，同时对扩增序列BLAST比对结果表明，该目标片段属于球药隔重楼。PCR灵敏度检测结果如图3b，当模板DNA浓度为0.1ng/μl时，扩增条带微弱，当模板DNA浓度为1ng/μl时可产生明亮的条带。
利用本研究中设计的引物对HZFM/HZR对表1中的18份材料的DNA进行PCR扩增，电泳结果显示只有序号6-7的两个黑籽重楼样品有特异性扩增，扩增片段长度约为339bp，其它样品均无扩增片段，说明该引物对黑籽重楼具有种特异性。特异性检测电泳结果如图4a，同时对扩增序列BLAST比对结果表明，该目标片段属于黑籽重楼。PCR灵敏度检测结果如图4b，当模板DNA浓度为0.1ng/μl时，扩增条带微弱，当模板DNA浓度为1ng/μl时可产生明亮的条带。
4、TaqMan探针设计
在已筛选出的种特异性引物基础上，进行种特异性TaqMan探针设计。根据序列比对结果，在重楼属物种各自特异性引物范围内，通过PrimerQuest Tool(https://sg.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index)软件在上下游引物间区域设计种属特异性的荧光探针，探针设计原则如下：(1)5’端第一个碱基不能为G；(2)3’端的前四个碱基避免有3个或以上G；(3)探针与引物的距离越近越好；(4)GC％在30％-70％之间，且退火温度在65℃-67℃之间；(5)探针长度在13bp-25bp之间；(6)避免出现重复喊基，尤其避免4个以上的G重复出现，避免6个A连续出现；(7)选择C比G多的序列作为探针。探针委托上海生物工程技术服务有限公司合成，表4所示。
表4四种重楼荧光探针设计
5、荧光定量PCR反应
利用本研究中设计的引物探针对DFM/DR/DP，以提取的滇重楼基因组DNA作为实时荧光PCR扩增模板，并以提取的其它重楼基因组DNA作为对照，以ddH2O为阴性对照，采用Taqman荧光探针的方法进行实时荧光PCR反应。
实时荧光PCR反应总体系为20μl，其中其中包括2xPremix Ex Taq(Takara)l0μl,上、下游引物(10μmol/L)1μl，探针(10μmol/L)0.5μl，ddH2O 6.5μl，DNA模板1μl；反应的条件为：95℃预变性30s，40个循环的95℃变性5s，60℃退火30s，最后40℃30s冷却。
结果如图5所示，对18个重楼样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线显示只有3个滇重楼样品的DNA有特异性扩增，CT值＜30，而其他易混淆种DNA和ddH2O对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对滇重楼物种有特异性，如果Ct＜30则判断为滇重楼物种阳性，Ct≥30则判断为滇重楼物种阴性。
采用与上述引物探针对DFM/DR/DP荧光定量PCR反应相同的方法(即相同的PCR反应总体系、反应条件)，分别用引物探针对HFM/HR/HP、QYGFM/QYGR/QYGP、HZFM/HZR/HZP对表1中的18种重楼样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增。
引物探针对HFM/HR/HP扩增结果显示：结果如图6所示，对18个重楼样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线显示只有5个华重楼样品的DNA有特异性扩增，CT值＜30，而其他易混淆种DNA和ddH2O对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对华重楼物种有特异性，如果Ct＜30则判断为华重楼物种阳性，Ct≥30则判断为华重楼物种阴性。
引物探针对QYGFM/QYGR/QYGP扩增结果显示：结果如图7所示，对18个重楼样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线显示只有1个球药隔重楼样品的DNA有特异性扩增，CT值＜30，而其他易混淆种DNA和ddH2O对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对球药隔重楼物种有特异性，如果Ct＜30则判断为球药隔重楼物种阳性，Ct≥30则判断为球药隔重楼物种阴性。
引物探针对HZFM/HZR/HZP扩增结果显示：结果如图8所示，对18个重楼样品的基因组DNA进行实时荧光PCR扩增，扩增曲线显示只有2个黑籽重楼样品的DNA有特异性扩增，CT值＜30，而其他易混淆种DNA和ddH2O对照在第30个循环反应之前均无荧光增长信号，说明该探针和引物组合只对黑籽重楼物种有特异性，如果Ct＜30则判断为黑籽重楼物种阳性，Ct≥30则判断为黑籽重楼物种阴性。
序列表
<110> 三亚中国检科院生物安全中心，中国检验检疫科学研究院
<120> 用于鉴别重楼品种及其混伪品的引物组、试剂盒和方法
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DFM
<400> 1
gtgaatacgg cctactgtca tttca 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物DR
<400> 2
aacacgtaca gcgcaaccat gt 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HFM
<400> 3
cgtcccgaag ctaaagcccc tagta 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HR
<400> 4
tccacatcca tgccaacact ttca 24
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物QYGFM
<400> 5
gactctcggc aacggatatc ttcca 25
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物QYGR
<400> 6
ggcccccgag cctttagagg t 21
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HZFM
<400> 7
gaatgcggcc cactgtcaaa g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物HZR
<400> 8
gagaccacga cgtccggctc a 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针DP
<400> 9
agtgttggca cggatgtgga gatt 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针HP
<400> 10
tgcatcgact aatgacagtg ggcc 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针QYGP
<400> 11
ctacgcctgt gggtcgaaag tgttg 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针HZP
<400> 12
tgcacacggt aggttgaaga gtgg 24
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ITS-4
<400> 13
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物ITS-L
<400> 14
tcgtaacaag gtttccgtag gtc 23

Claims (10)

1.一种用于鉴别鉴别重楼品种及其混伪品的试剂盒，其特征在于：包含引物对和PCR扩增的反应试剂；
所述引物对包含4对引物：SED ID NO.1-2所示的引物对1，SED ID NO.3-4所示的引物对2，SED ID NO.5-6所示的引物对3，SED ID NO.7-8所示的引物对4；
所述引物对1、2、3、4分别用于鉴别目标重楼品种滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼；
所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼；
其中，待测样品的模板DNA浓度可低至1ng/μl。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包含4个探针，所述探针的序列分别如SED ID NO.9～12所示的序列，SED ID NO.9、SED ID NO.10、SED ID NO.11、SED ID NO.12所示的探针序列分别用于鉴别滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团；所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为BHQ1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、阳性对照和阴性对照，所述PCR扩增的反应试剂包括DNA聚合酶和DNA聚合酶缓冲液。
5.一种鉴别重楼品种及其混伪品的方法，其特征在于，其中，待鉴别重楼品种包括滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼，所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼，包括如下步骤：
1）提取待测样品的基因组DNA；
2）采用权利要求1所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行PCR扩增，
不同的引物对分管扩增；
3）检测PCR扩增产物中是否含有目的扩增片段，含有目的扩增片段的样品
鉴别为滇重楼和/或华重楼和/或球药隔重楼和/或黑籽重楼阳性；滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼的目的扩增片段的大小依次为394bp、393bp、297bp、339bp。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系为：总体积25μl，其中，2×Taq PCR MasterMix 12.5μl、浓度为10μM的正反向引物各1μl、基因组DNA 1μl、余量为ddH2O；
所述步骤2）中鉴别滇重楼或华重楼或球药隔重楼采用的PCR扩增的反应条件为：94℃3min; 94℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 1 min, 循环30 次; 72℃ 5 min；鉴别黑籽重楼采用的PCR扩增的反应条件为：94℃ 3min; 94℃ 30s, 65℃ 30s, 72℃ 1 min, 循环30 次;72℃ 5 min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述步骤3）中采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物中是否含有目的条带。
8.一种鉴别重楼品种及其混伪品的实时荧光PCR方法，其特征在于，其中，待鉴别重楼品种包括滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼，所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼，包括如下步骤：
1）提取待测样品的基因组DNA；
2）采用权利要求2所述的试剂盒，对提取的基因组DNA进行实时荧光PCR
扩增，不同的引物对分管扩增，根据扩增结果判断待测对象是否含有目标重楼品种，如果Ct＜30则判断为目标重楼品种阳性，Ct≥30则判断为目标重楼品种阴性。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述实时荧光PCR的反应体系为：总体积20μl，其中2×Premix Ex Taq 10μl、浓度为10μM的上下游引物各1μl、浓度为10μM的探针0.5μl、基因组DNA 1μl，余量为ddH2O；qPCR扩增程序为：95℃预变性30s，40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s。
10.权利要求1至4任一项所述的试剂盒在鉴别重楼品种及其混伪品中的应用，所述重楼品种包括滇重楼、华重楼、球药隔重楼、黑籽重楼；所述混伪品包括北重楼、皱叶重楼、长柱重楼、五指莲、独龙重楼。
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