CN111961743B - 一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用 - Google Patents

一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用。本发明针对蒲公英属植物基因中的三个SSR标记ONT21、ONT876和ONT15498设计了鉴别和区分橡胶草的方法，具体可针对这三个SSR标记设计了相应的特异性引物，对待鉴定样本进行PCR反应后通过扩增出的条带即可判断待鉴定材料的物种类型。本发明设计得到的特异性引物具有高度特异性和灵敏度，可以保证扩增结果的准确性。本发明基于三个SSR标记提供的橡胶草鉴定方法可以准确地将橡胶草从其同属不同种的各种蒲公英中鉴别和区分开，有效防止种间混杂和杂交，在橡胶草的选育和遗传保护方面具有重大意义。

Description

一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用
技术领域
本发明涉及分子标记技术领域，尤其涉及一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用。
背景技术
橡胶草又名俄罗斯蒲公英(Taraxacum kok-saghyz Rodin，TKS) 是菊科蒲公英属的多年生草本植物。研究发现，橡胶草含有4-5％的高质量天然橡胶，主要存在于橡胶草的根内，可以用来制造各种橡胶制品，是现有技术中具备较高经济价值的产胶植物。
目前，因为生长环境高度重叠，橡胶草多和其他蒲公英属植物混杂在一起，例如药用蒲公英(Taraxacum officinale F.H.Wigg.，TO)、普通蒲公英(Taraxacum mongolicumHand.-Mazz，TM)和短角蒲公英(Taraxacum brevicorniculatum Korol.，TB)。这些蒲公英属植物的表型较为接近，单靠表型很难对其进行分辨和鉴定，这给橡胶草野外采集和鉴定都带来很大的困难。同时，橡胶草和普通蒲公英之间能够中间杂交，这给橡胶草的种植保存和遗传保护带来了很大麻烦。因此，亟待提出能够快速鉴别和区分橡胶草的方法，以有效防止橡胶草的混杂和杂交，以应用于橡胶草的选育和遗传保护。
发明内容
为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用，通过对三个SSR标记进行检测，可以准确地鉴别和区分橡胶草和其他蒲公英属植物。
第一方面，本发明提供一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合，所述分子标记组合包括3个SSR标记，为ONT21、ONT876和ONT15498，所述ONT21位于橡胶草基因组染色体区段utg10026_GWHAAAA0002 8121上第17128～17629位，重复序列为AAT，重复7次；所述ONT876位于橡胶草基因染色体组区段utg107_GWHAAAA00025042上第3248 5～32673位，重复序列为AAC，重复5次；所述ONT15498位于橡胶草基因染色体组区段utg3309_GWHAAAA00031419上第325～605位，重复序列为AG，重复6次。
其中，橡胶草基因组染色体区段utg10026_GWHAAAA00028121 基因ID：evm.TU.utg10026.7，橡胶草基因染色体组区段 utg107_GWHAAAA00025042的基因ID：evm.TU.utg107.7，橡胶草基因染色体组区段utg3309_GWHAAAA00031419的基因ID：evm.TU.utg3309.3。
进一步地，所述ONT21的SSR位点位于如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的第362～382位，所述ONT876的SSR位点位于如SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的第148～162位，所述ONT15498的SSR位点位于如 SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的第25～36位。
第二方面，本发明提供用于扩增所述分子标记组合的引物组合，所述引物组合包括如下引物：
用于扩增ONT21的引物对：
ONT21-F:GCTGGCATTTATCATCGGTT，
ONT21-R:CATAAACATCAGTAGCACCACTTG；
用于扩增ONT876的引物对：
ONT876-F:CTGACTTTGACTGGGGCACT，
ONT876-R:CCTCGGTTTCTGGGGTATCT；
用于扩增ONT15498的引物对：
ONT15498-F:TGGGGGTGAAAGTGTATCAA，
ONT15498-R:TCTTGGAGAATTTGGATGGG。
本发明进一步提供包含所述引物组合的试剂盒。
第三方面，本发明提供一种鉴定橡胶草的方法，包括：
使用所述分子标记组合或所述引物组合对待鉴定材料进行鉴定，若检测到ONT876，且没有检测到ONT21和ONT15498，则判断所述待鉴定材料为橡胶草。
进一步地，所述方法包括：提取所述待鉴定材料的DNA，所述引物组合进行PCR扩增，若扩增得到单独一条189bp的条带，则判断所述待鉴定材料为橡胶草。
进一步地，所述PCR扩增的反应程序为：
94℃预变性5min；然后94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；
所述PCR扩增的反应体系为：
2×PCR Taq master Mix 7.5μL，10mM上下游引物各1μL， 50ng/μL DNA模板1μL，ddH2O 4.5μL。
本发明进一步提供所述分子标记组合或所述引物组合或所述方法在蒲公英种属鉴定中的应用。
本发明进一步提供所述分子标记组合或所述引物组合或所述方法在橡胶草辅助选育中的应用。
本发明进一步提供所述分子标记组合或所述引物组合或所述方法在橡胶草种质资源遗传保护中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明通过对蒲公英属的三个SSR标记ONT21、ONT876和 ONT15498处的核苷酸序列进行检测，可以准确地将橡胶草从其同属不同种的各种蒲公英中鉴别和区分开，有效防止种间混杂和杂交，在橡胶草的选育和遗传保护方面具有重大意义。
本发明针对这三个SSR标记提供的引物组合，具有高度的特异性和稳定性，进一步保证了橡胶草鉴定结果的准确性和可靠性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的21个样本在SSR标记ONT21、ONT876 和ONT15498的PCR扩增结果；
图2为本发明实施例提供的TKS、TB和TO在SSR标记ONT21标记处的核苷酸序列比对图；
图3为本发明实施例提供的TKS、TB和TO在SSR标记ONT876处的核苷酸序列比对图；
图4为本发明实施例提供的TKS、TB和TO在SSR标记ONT15498 处的核苷酸序列比对图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例通过橡胶草和普通蒲公英转绿组测序数据比对分析，基于SSR位点之间的序列差异设计SSR标记，最终筛选得到三个可以用于蒲公英属植物种间鉴定的SSR标记，分别为ONT21、ONT876 和ONT15498。所述ONT21位于橡胶草基因组染色体区段utg10026_GWHAAAA00028121(基因ID：evm.TU.utg10026.7)上第 17128～17629位，重复序列为AAT，重复7次；所述ONT876位于橡胶草基因染色体组区段utg107_GWHAAAA00025042(基因ID： evm.TU.utg107.7)上第32485～32673位，重复序列为AAC，重复5次；所述ONT15498位于utg3309_GWHAAAA00031419(基因ID： evm.TU.utg3309.3)上第325～605位，重复序列为AG，重复6次。
针对这三个SSR标记，本实施例分别设计了用于扩增的引物对，如表1所示：
表1 SSR标记以及相应的引物序列
Figure BDA0002647450810000041
基于此引物组合，本发明实施例进行橡胶草的鉴别，方法如下：
1、待测植株的选取：随机选取来自国内外的橡胶草种质资源10 份和其他蒲公英种11份，共计21份。其中，美国橡胶草种质4份(A164、 A181、A1262和A6212)，俄罗斯橡胶草种质2份(K445和K479)，哈萨克斯坦橡胶草种质2份(M960和M428)和中国新疆维吾尔自治区野生橡胶草种质2 份(XJ-1和XJ-2)。短角蒲公英(TB)1份，药用蒲公英(TO)5份，普通蒲公英(TM)5份。
2、DNA提取：选取新鲜的叶片约0.2g，用高效植物基因组DNA 提取试剂盒(天根，DP350)提取DNA，用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度。
3、PCR扩增和电泳检测：PCR扩增的反应体系为15μl：2×PCR Taq master Mix 7.5μl，上下游引物(10mM)各1μl，DNA模板(50ng/μL) 1μl，ddH2O 4.5μl。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳， GoldView I型核酸染色剂染色，254nm紫光灯下检测条带扩增情况，扩增结果见图1。
4、统计分析：观察PCR产物电泳结果，谱带按0、1系统记录，有扩增目标条带时赋值为"1"，无目标条带时赋值为"0"，构建各材料相应0、1字符。
5、结果与分析：结果如表2和图1所示，所有橡胶草材料(TKS) 只在标记ONT876中有扩增；短角蒲公英(TB)在3个标记中均有目标条带扩增，其余蒲公英材料在标记ONT21和ONT5498中有扩增，在 ONT876中没有扩增。对3个标记扩增条带分别进行回收、测序和序列比对分析。结果显示，3个标记扩增条带的均为目标序列，不同种属之间在引物区的序列差异导致扩增结果的差异(图2-4)，进一步证明了3个标记扩增的特异性和稳定性。
表2 21份待鉴定材料的检测结果
Figure BDA0002647450810000051
Figure 2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院橡胶研究所
北京玲珑蒲公英科技发展有限公司
北京化工大学
<120> 一种用于鉴定橡胶草的分子标记组合及其应用
<130> KHP201114321.5
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 435
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctggcattt atcatcggtt cacacttgat acagacaact acatcaaggt actttgatta 60
aatgtttcat taacgattaa tattattgtt atgagtagta attgttttat ttttattttt 120
atttttattt tgttggcagg ccatgaggct ttttgttggt gacccaattt ggactccttt 180
taatcgacca catgatcact tgcctgcaag gtttttttaa catatttgac atgaggtttt 240
gtacttttac ttattttaaa aaatacttat agtttttgta tttgtgaaaa tgttgcagga 300
aagagtatct tgaagttttt gtggagaagg gggatgctgt tgatgctgct gcttgagaga 360
gaataataat aataataata atagtttgtt gcaaaattat aataataagc acaagtggtg 420
ctactgatgt ttatg 435
<210> 2
<211> 189
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgactttga ctggggcact ggtgaaaccc caagaaggtc ttcaagaatc agtgagaagg 60
tcaaagaaag tccacctgta accgagcctt cccccaaaaa gcccaaaaca tcttctgctt 120
caaaaaccaa gaatgcccct caatctgaac aacaacaaca acaagaaaaa gataccccag 180
aaaccgagg 189
<210> 3
<211> 279
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgggggtgaa agtgtatcaa ttctagagag agagagactg agagagggag agggagaggg 60
ggagagagag attgtgagat taaatacaca tagtaatagc atcatggggt gttgtgtttc 120
atgcaaacga tcaaagaaag aggttaatct tcaaaagacc ataagagtgg tgcacatgga 180
tggtttacta gaagagtacg aagatccagc aacagtcgaa gaggtgatca ctaacttccc 240
caaacacttt ttatgcacac ccatccaaat tctccaaga 279
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctggcattt atcatcggtt 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cataaacatc agtagcacca cttg 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgactttga ctggggcact 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctcggtttc tggggtatct 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgggggtgaa agtgtatcaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcttggagaa tttggatggg 20

Claims (8)

1.一种用于鉴定橡胶草的引物组合，其特征在于，所述引物组合由如下引物对组成：
用于扩增ONT21的引物对：
ONT21-F: GCTGGCATTTATCATCGGTT，
ONT21-R: CATAAACATCAGTAGCACCACTTG；
用于扩增ONT876的引物对：
ONT876- F: CTGACTTTGACTGGGGCACT，
ONT876- R: CCTCGGTTTCTGGGGTATCT；
用于扩增ONT15498的引物对：
ONT15498- F: TGGGGGTGAAAGTGTATCAA，
ONT15498- R: TCTTGGAGAATTTGGATGGG。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述引物组合。
3.一种鉴定橡胶草的方法，其特征在于，包括：
使用权利要求1所述引物组合对待鉴定材料进行鉴定，若检测到如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，且没有检测到如SEQ ID NO:1所示核苷酸序列和如SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，则判断所述待鉴定材料为橡胶草。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括：
提取所述待鉴定材料的DNA，使用权利要求1所述引物组合进行PCR扩增。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序为：
94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；
所述PCR扩增的反应体系为：
2×PCR Taq master Mix 7.5 μL，10 mM上下游引物各1μL，50ng/μL DNA模板1μL，ddH2O4.5 μL。
6.权利要求1所述引物组合或权利要求2-5任一项所述方法在蒲公英种属鉴定中的应用。
7.权利要求1所述引物组合或权利要求2-5任一项所述方法在橡胶草辅助选育中的应用。
8.权利要求1所述引物组合或权利要求2-5任一项所述方法在橡胶草种质资源遗传保护中的应用。
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