CN112410450B

CN112410450B - 一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法

Info

Publication number: CN112410450B
Application number: CN201910776844.8A
Authority: CN
Inventors: 张兰兰; 章飚; 冯红; 李细芬
Original assignee: Hebei Traditional Chinese Medicine Quality Inspection And Testing Research Center Co ltd
Current assignee: Hebei Traditional Chinese Medicine Quality Inspection And Testing Research Center Co ltd
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2024-05-14
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN112410450A

Abstract

本发明涉及一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法，该方法包括如下步骤：1)提取待鉴定样品的DNA；2)第一次PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，使用ITS 4/5通用引物对进行PCR扩增；3)第二次PCR扩增：以对步骤2)的PCR产物为模版，以多重位点特异性PCR引物对分别进行PCR扩增；4)对步骤3)的PCR扩增产物进行电泳，检测出620bp条带的待测样品鉴定为半夏，检测出346bp条带的待测样品鉴定为虎掌，检测出167bp条带的待测样品鉴定为鞭檐犁头尖，而其他易混品无上述扩增条带。

Description

一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法

技术领域：

本发明涉及中药材鉴别领域，具体涉及一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法。

背景技术：

半夏Pinellia ternate为天南星科植物的块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕和消痞散结的功效，善治脏腑之湿痰，止呕之要药。半夏是一味常用的大宗药材，不仅临床配方使用，也是多种中成药的原料药，使用量大；而野生半夏因大量釆挖、环境遭到破坏，资源逐渐减少；同时栽培半夏因种植过程规范化、标准化不够，产量不断减少，不能满足药材市场需求，且价格高。因此半夏市场上存在多种同科或同属的易混品，这对种植栽培、用药安全等方面造成严重问题，常见的易混品有天南星科半夏属虎掌Pinelliapedatisecta、天南星科犁头尖属鞭檐犁头尖Typhoniumflagelliforme(亦称为水半夏)等。

半夏及其易混品在外观形态上十分相似，且具有类似的化学成分，因此利用性状鉴别、理化鉴别等方法难以区分开。建立一种用于快速、准确鉴别半夏及其易混品的方法，对于保障半夏种茎的种植栽培、半夏饮片的用药安全有重要意义。设计半夏的特异性引物，并用于鉴别半夏，以区分其易混品，具有节省时间、降低成本和提高效率的优点。

多重PCR(multiplexPCR)是在普通PCR的基础上于一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR技术。多重PCR可以同时扩增多个目的基因，满足同时分析不同DNA序列的需要，它具有节省时间、降低成本、提高效率等优点。多重PCR己被成功应用到了生物学的多个方面，以及基因缺失、突变和多态性分析等。

由于多重PCR要求在同一反应体系中进行多个位点的特异性扩增，因而技术难度增大，一个理想的多重PCR反应体系，并非单一PCR的简单混合，需要针对目标产物，进行全面分析、建立适宜的反应体系和条件。多重PCR的目标是多个目的片段的扩增，因此目的片段的选择是核心。目的片段必须具有高度特异性，才能保证基因检测的准确性，避免目的片段间的竞争性扩增，实现高灵敏的扩增反应。此外，各个目的片段之间需具有明显的长度差异以利于鉴别。不同引物对之间互补的碱基不能太多，否则引物之间相互缠绕，严重影响反应结果。综合各个解链温度Tm，在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度以减少引物和模板间的非特异性结合，确保PCR反应的特异性。

多重PCR与常规PCR相比，有几个明显的优势：①多重PCR可同时扩增不同的基因组，因此可快速筛选同一基因组的不同区域或者不同物种的基因组，前者可用于检测结果确认，后者可用于复方中的不同组分检测；②选其中一个引物对作为阳性对照，可避免样本由于PCR抑制物质存在所导致的假阴性结果；③多重PCR所需试剂及样品量较少，因而节省大量人力、物力。

多重PCR成功的关键是引物特异性好，使单一PCR就能得到很好的效果，没有非特异性条带出现。

唐晓晶的《DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究》公开了半夏及其混淆品位点特异性PCR方法鉴别，利用GenBank中天南星科不同属药材之间的ITS基因序列，通过比对寻找种间SNP的分布情况，并利用位点特异性PCR方法进行SNP的检测。通过对大量不同产地半夏的检测，表明根据半夏ITS序列设计的引物PtITSF和PtITSR能成功对所有半夏样品进行扩增，得到395bp的条带，而对虎掌和水半夏等混淆品不扩增，没有条带，从而达到准确鉴别半夏的目的，保证了临床用药的安全。但该方法并不是多重位点特异性的PCR方法，因此仅仅能够将半夏与其他混伪品区分开来，但并不能判断其他混伪品是什么产品，因此具有局限性。

高等植物中核糖体DNA的编码区序列高度保守(不同纲、目间的同源率达90％以上)，差异主要表现在ITS、ETS及IGS等非编码区上。ITS(内转录间隔区)：18S～26S核糖体DNA(nrDNA)的内转录间隔区ITS(Internaltranscribed spacer)被5.8S分为ITS1和ITS2两部分，ITS序列在裸子植物中变异很大，尤其是长度变异非常显著，但在被子植物中，ITS区既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的保守性，说明其丰富的变异可在较低的分类阶元上(如属间、种间)解决植物分类的问题。

GenBnak中注册的半夏属、犁头尖属、天南星属植物DNA序列信息主要有叶绿体NADH基因、rp120基因、trnL内含子和trnL-trnF非编码区、核糖体5.8S rRNA基因及ITS间隔区。但经过比对分析，发现只有ITS间隔区具有半夏的SNP位点；rp120中SNP位点虽也能区分半夏与虎掌南星、水半夏，但不能区分半夏与其属内的其他物种；而trnL和trn-trnF非编码区基因序列片断短(约400bp)，仅具有属间的SNP，不适于作为半夏的分子遗传标记。表明植物基因组因其结构和功能上的差异，进化速率也有所不同，如何选择在种内高度保守，而种间存在差异的SNP位点是中药材分子鉴定成功的关键。

本发明基于SNP位点技术及多重特异性PCR技术，通过比对Genbank数据库中收录的半夏及其易混品ITS序列，根据特异性位点设计引物，以PCR扩增出不同长度的产物为标志，来判断正品半夏，以及常见的易混品虎掌、鞭檐犁头尖或其他易混品，从而建立一种快速准确鉴别半夏及其易混品的方法。

发明内容：

本发明是为了解决传统方法难以有效、准确鉴别半夏及其易混品的问题，提供多重位点特异性PCR引物对及其鉴别半夏、虎掌和鞭檐犁头尖的方法。

为此，本发明提供一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法，该方法包括如下步骤：

1)提取待鉴定样品的DNA；

2)第一次PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，使用ITS 4/5通用引物对进行PCR扩增；

所述ITS 4/5通用引物对为：

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC(见序列表序列7)

ITS 5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；(见序列表序列8)

3)第二次PCR扩增：以对步骤2)的PCR产物为模版，以多重位点特异性PCR引物对分别进行PCR扩增，

所述多重位点特异性PCR引物对：

引物对1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA

引物对2的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC

引物对3的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT；

4)对步骤3)的PCR扩增产物进行电泳，检测出620bp条带的待测样品鉴定为半夏，检测出346bp条带的待测样品鉴定为虎掌，检测出167bp条带的待测样品鉴定为鞭檐犁头尖，而其他易混品无上述扩增条带。

其中：

步骤1)对样品进行DNA提取，提取方法如下：

1)粉碎：用75％乙醇对样品表面消毒，将样品切成小块，再用高通量组织研磨仪研磨成粉末状；

2)去淀粉和多糖：取粉碎后样品100～150mg，加0.8-1.2mL核分离液混匀，低速离心，重复多次至离心后的核分离液澄清；

3)水浴裂解：沉淀加800μLCTAB液和20μLβ-巯基乙醇混匀，65℃水浴2～4小时，期间反复颠倒混匀多次；

4)抽提：冷却至室温，加800μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)混匀，离心，取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)混匀，离心；

5)沉淀：取上清加入异丙醇混匀，-20℃静置30min，离心；

6)洗涤：收集沉淀，用70％乙醇洗涤沉淀，重复一次，挥干乙醇；

7)溶解：将所得沉淀加入50～100μL TE缓冲液溶解，保存备用；

上述DNA提取方法中：

步骤2)低速离心，离心速度是3000-4000r/min离心3-8min。

CTAB液为十六烷基三乙基溴化铵溶液，浓度是1.5-2.5％。

异丙醇的加入量是上清液体积的0.5-0.7倍；

步骤4)和步骤5)的离心速度为11000-13000r/min离心8-12min。

其中，

步骤2)第一次PCR扩增中：

所述PCR反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL，浓度为2.5μM/μL，DNA模板4μL浓度为40ng/μL，加纯水补足至25μL。

所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环40次；72℃再延伸10min；4℃保存。

步骤3)第二次PCR扩增中：

反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL(2.5μM/μL～5μM/μL)(优选2.5μM/μL)，ITS通用引物对的PCR产物1μL～2μL(优选1μL)作为本步骤的模板，加纯水补足至25μL。其中，Taq PCR Mix采自艾德莱2×Taq PCR Mix，引物为美吉公司合成。

具体的，PCR扩增程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，循环32～35次(优选35次)；72℃再延伸5min；4℃保存。

本发明可以用于鉴别半夏以及类似物虎掌和鞭檐犁头尖。

本发明的多重位点特异性PCR引物对均来源于ITS序列，本发明涉及半夏、虎掌和鞭檐犁头尖的引物对，其对应的引物对分别为BX-F/BX-R引物对、HZ-F/HZ-R引物对、BY-F/BY-R引物对。

所述BX-F/BX-R(以下简称为引物对1)的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA(见序列表序列1)

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA；(见序列表序列2)

所述HZ-F/HZ-R(以下简称为引物对2)的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT(见序列表序列3)

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC；(见序列表序列4)

所述BY-F/BY-R(以下简称为引物对3)的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA(见序列表序列5)

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT。(见序列表序列6)

本发明还提供了上述多重位点特异性PCR引物对的制备方法，包括以下步骤：

从Genbank中下载半夏属植物半夏、虎掌、滴水珠、石蜘蛛、盾叶半夏、犁头尖属植物鞭檐犁头尖、犁头尖、独角莲、天南星属植物天南星、异叶天南星和东北天南星的ITS序列，然后采用Mega X软件对上述植物的ITS序列进行多序列比对分析，半夏的ITS序列在77bp处为A，其他为T，在662bp处为T，其他为G；虎掌的ITS序列在84bp处为T，其他为G，在338bp处为C，其他为G；鞭檐犁头尖的ITS序列在70bp处为A，其他为T，在197bp处为A，其他为C，最终确定三组多重位点特异性PCR引物对。

本申请的多重位点特异性PCR，各参数均是进行了摸索和筛选而得出的，具体包括如下步骤：

对影响多重位点特异性PCR扩增的主要因素进行考察(具体见表1)，包括退火温度、循环次数、Taq酶、引物浓度和模板量等，以保证其稳定性和准确性。

表1：对影响多重位点特异性PCR扩增的主要因素进行考察

BX：半夏样品；HZ：虎掌样品；BY：鞭檐犁头尖样品；

“+”代表有一条亮带、“△”代表有一条暗带、“-”代表无条带

表1结果显示：优化后的体系为63℃的退火温度、35×的循环数、2×Taq PCR Mix的Taq酶、2.5μM的引物浓度，1μL的模板量。

本发明还提供所述方法在半夏及其易混品鉴别中的应用。

本发明提供的半夏及其易混品的鉴别方法，具有以下优点：

1、一般鉴别半夏与其他易混品均是用PCR扩增，但是普通的PCR扩增并不能完全将半夏与其他易混品区别，且无法得知易混品的具体品种，因此发明人对ITS序列进行分析，最终确定了本发明的多重位点。

2、本发明提供了能特异性鉴别半夏、虎掌和鞭檐犁头尖的引物对和以所述引物对鉴别半夏及其易混品的方法。该方法简便易行，减少了测序、数据分析部分，缩短了分析时间及费用，可快速、准确的鉴别半夏。

附图说明：

图1：ITS 4/5通用引物对扩增半夏及其易混品的电泳图，其中：BX1、2、3为半夏，HZ1、2、3为虎掌，BY1、2、3为鞭檐犁头尖，NX为天南星，DJ为独角莲；

图2：从Genbank中下载天南星科的半夏属、犁头尖属、天南星属部分植物的ITS序列比对分析图，其中最左边的内容，依次是半夏(BX)、虎掌(HZ)、盾叶半夏(DYBX)、石蜘蛛(SZZ)、滴水珠(DSZ)、鞭檐犁头尖(BYLTJ)、独角莲(DJL)、犁头尖(LTJ)、一把伞南星(YBSNX)、东北天南星(DBNX)、异叶天南星(YYNX)，后面的字母加数字如KU551864.1是GENbank上对应的号码序列；

图3：BX-F/BX-R引物对扩增半夏及其易混品的电泳图；

图4：HZ-F/HZ-R引物对扩增半夏及其易混品的电泳图；

图5：BY-F/BY-R引物对扩增半夏及其易混品的电泳图；

图6：多重位点特异性PCR引物对分别扩增半夏、虎掌和鞭檐犁头尖的电泳图。

具体实施方式：

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下试剂的来源或制备方法：

1、Taq PCR Mix(浓缩PCR扩增预混和溶液)，购自北京艾德莱生物科技有限公司。

2、ITS4引物和ITS 5引物及实施例中涉及的所有引物，均为上海美吉生物医药科技有限公司合成。

3、核分离液：称取10.04g PVP-30，加无菌水溶解，并加入50mL 1mol/L Tris-HCl，20mL 0.5mol/L EDTA，50mL 7mmol/L NaCl，定容至500mL，高温高压灭菌，室温保存。

4、Tris平衡酚，成分Tris-HCl缓冲液和酚等，厂家：北京索莱宝科技有限公司，批号：113B011。

5、TE缓冲液，成分：Tris-HCl缓冲液和EDTA等，厂家：天根生化科技(北京)有限公司，批号：N2710。

实施例1：半夏及易混品的引物对第一次PCR扩增

1、样品来源

本实施例采用的正品半夏(是新鲜或干品均可，鲜品需要45℃低温烘干粉碎)，常见易混品虎掌、鞭檐犁头尖、其他易混品天南星、独角莲来自河北、湖南、安徽和广州等地。

2、DNA提取

对样品进行DNA提取，提取方法如下：

2)去淀粉和多糖：取粉碎后样品100～150mg，1mL核分离液混匀，3 500r/min低速离心5min，重复加液离心操作多次，至离心后的核分离液澄清；

3)水浴裂解：沉淀加800μL CTAB液(十六烷基三乙基溴化铵，浓度是2％)和20μLβ-巯基乙醇混匀，65℃水浴2～4小时，期间反复颠倒混匀多次；

4)抽提：冷却至室温，加800μL Tris平衡酚/氯仿/异戊醇(体积比为25:24:1)混匀，离心12 000r/min离心10min，取上清，加入等体积氯仿/异戊醇(体积比为24:1)混匀，离心12 000r/min离心10min；

5)沉淀：取上清加入上清液体积0.6倍的异丙醇混匀，-20℃静置30min，离心12000r/min离心10min；

7)溶解：将所得沉淀加入50～100μL TE缓冲液溶解，保存备用；

3、PCR扩增

3.1 PCR反应引物为：(该引物参考文献的42页1.3.2中涉及的引物：张文涛等，三种荆州半夏的ITS序列分析与种属鉴定，中国生物工程杂质，2015年35(1)：41-45)

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS 5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG

3.2 PCR反应体系为25μL：

12.5μL 2×Taq PCR Mix，ITS4引物和ITS 5引物各1μL(2.5μM/μL)，DNA模板4μL(约40ng/μL)，加纯水补足至25μL。

3.3 PCR扩增程序：

94℃预变性5min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环40次；72℃再延伸10min；4℃保存。

4、电泳检测

PCR扩增产物进行电泳，采用1％琼脂糖糖凝胶，在110V电压下电泳30min，在凝胶成像系统下观察并拍照保存。

图1为半夏及其易混品ITS序列PCR扩增产物电泳检测图，说明所提DNA质量符合要求。

实施例2：多重位点特异性PCR引物对的扩增

1、设计多重位点特异性PCR引物对

从Genbank中下载半夏属植物半夏、虎掌、滴水珠、石蜘蛛和盾叶半夏的ITS序列(登录号：KU551864.1，AF469040.1，AF469039.1，AF469033.1，AF469034.1)，犁头尖属植物鞭檐犁头尖、犁头尖和独角莲的ITS序列(登录号：KM236658.1，AY863058.1，KM236662.1)，天南星属植物天南星、异叶天南星和东北天南星的ITS序列(登录号：KT634023.1，MF095999.1，KT634014.1)。

采用Mega X软件对上述植物的ITS序列进行多序列比对分析。半夏的ITS序列在77bp处为A，其他为T，在662bp处为T，其他为G；虎掌的ITS序列在84bp处为T，其他为G，在338bp处为C，其他为G；鞭檐犁头尖的ITS序列在70bp处为A，其他为T，在197bp处为A，其他为C，最终确定三组多重位点特异性PCR引物对，具体比对分析见图2。

2、多重位点特异性PCR引物对鉴别半夏及其易混品

以实施例1中的PCR产物为模板，多重位点特异性PCR引物对分别扩增。

2.1 PCR反应引物为：

所述引物对1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA

所述引物对2的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC

所述引物对3的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT

PCR反应体系为25μL：

2.2 12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL(2.5μM/μL)，ITS通用引物对的PCR产物1μL，加纯水补足至25μL。

其中，Taq PCR Mix采自艾德莱2×Taq PCR Mix，引物为美吉公司合成。

2.3 PCR扩增程序：

94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，循环35次；72℃再延伸5min；4℃保存。

3、电泳检测

电泳结果如图3、图4、图5、图6，半夏能扩增出620bp特异性条带，虎掌能扩增出346bp特异性条带，鞭檐犁头尖能扩增出167bp特异性条带，而其他易混品无上述扩增条带。

结果表明：本发明提供的体系能够将半夏鉴别出来，还能鉴别出易混品中常见的虎掌和鞭檐犁头尖。

实验例1：过程的筛选

1、从Genbank中下载半夏属植物半夏、虎掌和盾叶半夏的ITS序列(登录号：KU551864.1，AF469040.1，AF469039.1，AF469033.1，AF469034.1)，犁头尖属植物鞭檐犁头尖、犁头尖和独角莲的ITS序列(登录号：KM236658.1，AY863058.1，KM236662.1)，天南星属植物天南星、异叶天南星和东北天南星的ITS序列(登录号：KT634023.1，MF095999.1，KT634014.1)。

采用Mega X软件对上述植物的ITS序列进行多序列比对分析。所设计的引物见表2。

表2半夏、虎掌和鞭檐犁头尖的多对特异性PCR引物

以“品种所设计的特异性引物只有该品种有特异性条带，其他易混品无扩增条带”为依据，经过PCR扩增筛选，最终确定：多重位点特异性PCR引物对的分别为BX-F1/BX-R1引物对、HZ-F1/HZ-R1引物对、BY-F1/BY-R1引物对，在下面分别称为引物对1(BX-F/BX-R)、引物对2(HZ-F/HZ-R)和引物对3(BY-F/BY-R)，核苷酸序列分别为：

所述引物对1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA

所述引物对2的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC

所述引物对3的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>数字本草检测科技有限公司

<120>一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法

<140>

<141>

<160>

<170>

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gctgctacat cccttccca 19

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

gagcgaccgt gccgtta 17

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tacggaagtg cgacagtctc att 23

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

tgatggttca cgggattctgc 21

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gattgcggga tgcggagaa 19

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

tcagatggtc gggttcctca ct 22

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

tcctccgctt attgatatgc 20

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

Claims

1.一种中药材半夏及其易混品的鉴别方法，该方法包括如下步骤：

1)提取待鉴定样品的DNA；

2)第一次PCR扩增：以步骤1)提取的DNA为模板，使用ITS 4/5通用引物对进行PCR扩增；所述ITS 4/5通用引物对为：

ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC

ITS 5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；

所述多重位点特异性PCR引物对：

引物对1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA

引物对2的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC

引物对3的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤1)对样品进行DNA提取，提取方法如下：

5)沉淀：取上清加入异丙醇混匀，-20℃静置30min，离心；

7)溶解：将所得沉淀加入50～100μL TE缓冲液溶解，保存备用。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中：

步骤2)低速离心，离心速度是3000-4000r/min离心3-8min，

CTAB液为十六烷基三乙基溴化铵溶液，浓度是1.5-2.5％，

异丙醇的加入量是上清液体积的0.5-0.7倍；

步骤4)和步骤5)的离心速度为11000-13000r/min离心8-12min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤2)第一次PCR扩增中：

所述PCR反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL，浓度为2.5μM/μL，DNA模板4μL浓度为40ng/μL，加纯水补足至25μL，

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中：

步骤3)第二次PCR扩增中：

反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL，其中2.5μM/μL～5μM/μL，ITS通用引物对的PCR产物1μL～2μL作为本步骤的模板，加纯水补足至25μL，

具体的，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火30s，循环32～35次；72℃再延伸5min；4℃保存。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，其中：

步骤3)第二次PCR扩增中：

反应体系为25μL：

12.5μL2×Taq PCR Mix，上下游引物各1μL 2.5μM/μL，ITS通用引物对的PCR产物1μL作为本步骤的模板，加纯水补足至25μL，

具体的，PCR扩增程序：

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中：所述方法可以用于鉴别半夏、以及类似物虎掌和鞭檐犁头尖。

8.用于中药材半夏及其易混品的多重位点特异性PCR引物对，其特征在于，包括BX-F1/BX-R1引物对、HZ-F1/HZ-R1引物对和BY-F1/BY-R1引物对；

所述BX-F1/BX-R1的序列为：

BX-F：GCTGCTACATCCCTTCCCA

BX-R：GAGCGACCGTGCCGTTA；

所述HZ-F1/HZ-R1的序列为：

HZ-F：TACGGAAGTGCGACAGTCTCATT

HZ-R：TGATGGTTCACGGGATTCTGC；

所述BY-F1/BY-R1的序列为：

BY-F：GATTGCGGGATGCGGAGAA

BY-R：TCAGATGGTCGGGTTCCTCACT。