CN110791583B - 一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子标记领域，具体公开了一种鉴别狭叶重楼的分子标记在及其在定性鉴定狭叶重楼中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还公开了一种鉴别狭叶重楼的分子标记方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，利用引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物用限制性内切酶Hpy99I酶切；对酶切产物进行电泳检测，若在125bp和361bp处检出两种条带，则所述待测样品中含狭叶重楼的生物组织。本发明获得的分子标记可用于鉴定狭叶重楼与滇重楼和七叶一枝花的幼苗或休眠根茎，以及药材是否为狭叶重楼或者药材中是否混有狭叶重楼的样本材料。

Description

一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用

技术领域

本发明涉及分子标记领域，具体涉及一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用。

背景技术

重楼最早见于《神农本草经》，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，可用于治疗痈肿疔疮、咽喉肿痛、毒蛇咬伤、惊风抽搐、跌打损伤。含有重楼的中成药产品有云南白药、芪珍胶囊、肝复乐胶囊等。现代研究表明重楼的主要化学成分为甾体皂苷类化合物，具有止血、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等药理活性。

《中华人民共和国药典》中记录药材重楼的基源植物为百合科重楼属植物滇重楼(Paris polyphylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.)或七叶一枝花(Paris polyphylla Simth var.chinensis(F.)Hara)。与此同时，狭叶重楼(Parispolyphylla Smith var.stenophylla Franch.)没有被《中华人民共和国药典》收录，仅有《浙江省中药炮制规范》中记录浙重楼为百合科植物狭叶重楼的干燥根茎。不同基源植物的有效化学成分组成差异较大，杨光义等研究表明狭叶重楼地下根茎不含《中华人民共和国药典》规定的指标化学成分重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅵ。因此，使用狭叶重楼的根茎替代七叶一枝花或滇重楼的根茎入药，存在影响治疗效果的风险。

重楼的生产周期较长，从播种到收获需要8年以上时间。生长3年以上狭叶重楼轮生8-13(-22)以上叶片且叶片狭长，而七叶一枝花和滇重楼轮生叶片数一般在8片以下，且叶片较狭叶重楼宽大。然而，重楼属植物苗期均为1张心形叶，物种间很难通过表观特性分辨。与此同时，在休眠期，狭叶重楼、七叶一枝花和滇重楼地上部分倒苗，其地下的带芽根茎也很难从形态外观上辨认。

研究表明重楼属叶绿体基因序列可以很好的区分属内的不同物种如公开号CN105483282A的专利申请文献公开了一种PCR特异性鉴别引物及其鉴别滇重楼的方法，其对PCR产物进行凝胶电泳，根据电泳条带的大小及有无即可区分滇重楼及其混淆品，具有操作简单、快速的特点，在药材真伪品快速检测方面具有独特的优势。但是，该方法仅仅能够鉴别出滇重楼，并未给出鉴别狭叶重楼的方法。

现有技术中没有一种简单有效的鉴别狭叶重楼的方法，针对该技术问题，本发明根据三种重楼狭叶重楼与七叶一枝花和滇重楼的叶绿体基因序列，设计了特异性的扩增引物，根据三者的差异性片段设计了CAMPs分子标记。通过该分子标记可以在苗期和种苗休眠期进行狭叶重楼混杂种苗的检测。

发明内容

针对狭叶重楼与七叶一枝花和滇重楼难以鉴别的问题，本发明的目的在于提供了一种区分狭叶重楼与七叶一枝花和滇重楼的分子标记及其鉴别方法，该鉴别方法操作简单、结果准确，在混杂种苗和药材真伪品的快速检测方面具有独特的优势。

第一方面，本发明提供了一种鉴别狭叶重楼的分子标记，命名为XYCL，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

针对重楼属植物狭叶重楼、七叶一枝花和滇重楼苗期物种间很难通过表观特性分辨的问题，本发明提供了一种鉴别狭叶重楼的分子标记，可以很好的与七叶一枝花和滇重楼分辨出来，这是由于对应的七叶一枝花的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，对应的滇重楼的序列如SEQ ID NO:3所示所示，有较大的区别。

第二方面，本发明提供了所述的分子标记在定性鉴定狭叶重楼中的应用。

第三方面，本发明提供了一种引物对，所述引物对的上游引物的核苷酸序列为：5‘-GACAGAACCCGTGATTGTATAG-3‘；所述引物对的下游引物为：5‘-CCATCTCTACTGCAGAACCGG-3‘。

第四方面，本发明提供了一种利用分子标记鉴别狭叶重楼的方法，包括：以待测样品的基因组DNA为模板，采用上述引物对进行PCR扩增，得到的扩增产物用限制性内切酶Hpy99I酶切；对酶切产物进行电泳检测，若在125bp和361bp处检出两种条带，则所述待测样品中含狭叶重楼的生物组织。

上述分子标记方法中，基因组DNA50ng，1×PCR buffer 2.0μl，0.2mM dNTPs 1.6μL，0.5μM上游引物0.5μl，0.5μM下游引物0.5μL，Taq酶1U，总体积20μL。

所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸7min。

所述酶切的体系为：1UHpy99I、1μgDNA、0.5uL10×NEBbuffer、ddH₂O补足5μL，37℃反应1h。

所述待测样品包括狭叶重楼、七叶一枝花或滇重楼的幼苗或根茎组织；还包括狭叶重楼、七叶一枝花、滇重楼药材中的一种或多种。

以现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明获得的分子标记可用于鉴定狭叶重楼与滇重楼和七叶一枝花的幼苗或休眠根茎，以及药材是否为狭叶重楼或者药材中是否混有狭叶重楼的样本材料；且本发明利用分子标记鉴别狭叶重楼的方法操作简单、结果准确，适合大规模推广应用。

附图说明

图1为分子标记XYCL对狭叶重楼幼苗和根茎组织的鉴别，其中：1-3泳道为滇重楼的幼苗叶片；4-6泳道为七叶一枝花的幼苗叶片；7-8泳道为狭叶重楼的幼苗叶片；M为分子量标记。

图2为分子标记XYCL对狭叶重楼药材的鉴别，其中：1泳道为滇重楼与狭叶重楼药材8：1(质量比)混样；2泳道为七叶一枝花与狭叶重楼药材8：1(质量比)混样；3泳道为滇重楼与狭叶重楼幼苗嫩叶8：1(质量比)混样；4泳道为七叶一枝花与狭叶重楼幼苗嫩叶8：1(质量比)混样；5泳道为七叶一枝花与狭叶重楼根茎组织1：1(质量比)混样；6泳道为滇重楼与狭叶重楼根茎组织1：1(质量比)混样；7为七叶一枝花与狭叶重楼药材1：1(质量比)混样；8泳道为滇重楼与狭叶重楼药材1：1(质量比)混样；M为分子量标记。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

分子标记引物设计：

参考美国国立生物技术信息中心https://www.ncbi.nlm.nih.gov网站公布的物种序列信息，设计重楼属植物叶绿体基因目的片段序列通用引物进行扩增，对扩增引物进行测序，并评价序列片段的物种区分特点。找到多样性SNP位点，分别用Primer Premier5.0和SNP2CAPS软件设计dCAMPs引物，设计得到的引物对如下所示：

对应片段的上游引物为：5‘-GACAGAACCCGTGATTGTATAG-3‘；

对应片段的下游引物为：5‘-CCATCTCTACTGCAGAACCGG-3‘。

实施例1

植物材料：滇重楼、七叶一枝花、狭叶重楼的5年以上的植株，其种子成熟后，取种子经过破休眠发芽后得到幼苗。

基因组DNA提取：从滇重楼幼苗群体中随机选取20株，每株取叶片50mg，液氮速冻后，混样，研磨，然后用CTAB法提取基因组DNA提取，提取的基因组DNA浓度调至50ng.μl^-1待用。华重楼及狭叶重楼的幼苗群体叶片基因组DNA提取方法同样方式处理。

反应及电泳：PCR反应体积20μ1，反应液组成为1×PCR buffer，0.2mM dNTPs，每个引物0.5μM，50ng基因组DNA，1U Taq酶。PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后每个循环：94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min。扩增产物用限制性内切酶Hpy99I进行酶切。酶切体系为1UHpy99I、1μgDNA、0.5uL10×NEBbuffer、ddH₂O补足5μL，37℃反应1h。酶切后的产物用0.8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

群体基因型的分子检测：检测结果如图1所示，滇重楼和七叶一枝花的扩增产物不能被Hpy99I酶切，其片段长度为481bp；狭叶重楼的扩增产物可以被Hpy99I酶切，得到125bp和361bp两个片段。

实施例2

实验材料：滇重楼、七叶一枝花、狭叶重楼的5年以上的植株，其种子成熟后，取种子经过破休眠发芽后得到幼苗；滇重楼、七叶一枝花、狭叶重楼的根茎组织；滇重楼、七叶一枝花、狭叶重楼的药材。

基因组DNA提取：取滇重楼与狭叶重楼药材1：1(质量比)混样；七叶一枝花与狭叶重楼药材1：1(质量比)混样；泳道为滇重楼与狭叶重楼根茎组织1：1(质量比)混样；泳道为七叶一枝花与狭叶重楼根茎组织1：1(质量比)混样；泳道为七叶一枝花与狭叶重楼幼苗嫩叶8：1(质量比)混样；泳道为滇重楼与狭叶重楼幼苗嫩叶8：1(质量比)混样；泳道为七叶一枝花与狭叶重楼药材8：1(质量比)混样；泳道为滇重楼与狭叶重楼药材8：1(质量比)混样。液氮速冻后，混样，研磨，然后用CTAB法提取基因组DNA提取，提取的基因组DNA浓度调至50ng.μl^-1待用。

反应及电泳：PCR反应体积20μ1，反应液组成为1×PCR buffer，0.2mM dNTPs，每个引物0.5μM，50ng基因组DNA，1U Taq酶。PCR反应程序为：94℃预变性5min；然后每个循环：94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸7min。扩增产物用限制性内切酶Hpy99I进行酶切，酶切后的产物用0.8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。

检测结果分析：检测结果如图2所示，当样品中混有狭叶重楼的组织材料时，检测结果会出现481bp、125bp和361bp三个片段。

序列表

<110> 浙江省中药研究所有限公司

<120> 一种鉴别狭叶重楼的分子标记及其鉴别方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gacagaaccc gtgattgtat aggattctat tgaaaacgaa tcctaatgat tcattgggtg 60

ggatggcgga acgaaccaag aacaaattga tttattctaa atggccgcgg tggattaacc 120

cgacgaataa ataaagaaag agtcaatatt cgcccgcgaa cctttattta ttggtatatt 180

ggtattggat taaattaata tatgaaatta aaaattaata tattttggtg tgattgatag 240

gagtaaaaat aataattatc tataaatata cataaaaaaa aagatatacg ttcgactgta 300

tatcttgtat atacagctta ctatataaca ataacaaatg aaatatcaaa aaatcccatt 360

actctattac taagtgtatt atttattaga tacatgtgta tctggaatag cattgaatca 420

tttcattcgc gaggagctgg atgagaagaa actctcatgt ccggttctgc agtagagatg 480

g 481

<210> 2

<211> 475

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gacagaaccc gtgattgtat aggattctat tgaaaacgaa tcctaatgat tcattgggtg 60

ggatggcgga acgaaccaag aacaaattga tttattctaa atggccgcgg tggattaacc 120

agacgaataa ataaagaaag agtcaatatt cgcccgcgaa cctttattta ttggtatatt 180

ggtattggat taaattaata tatgaaatta aaaattaata tattttggtg tgattgatag 240

gagtaaaaat aataattatc tataaatata gataaaaaaa aagatatacg ttcgactgta 300

tatcttgtat atacagctta ctatataaca ataacaaatg aaatatcaaa aaatcccatt 360

actctattac taagtgtaat tagatacatg tgtatctgga atagcattga atcatttcat 420

tcgcgaggag ctggatgaga agaaactctc atgtccggtt ctgcagtaga gatgg 475

<210> 3

<211> 481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacagaaccc gtgattgtat aggattctat tgaaaacgaa tcctaatgat tcattgggtg 60

ggatggcgga acgaaccaag aacaaattga tttattctaa atggccgcgg tggattaacc 120

agacgaataa ataaagaaag agtcaatatt cgcccgcgaa cctttattta ttggtatatt 180

ggtattggat taaattaata tatgaaatta aaaattaata tattttggtg tgattgatag 240

gagtaaaaat aataattatc tataaatata cataaaaaaa aagatatacg ttcgactgta 300

tatcttgtat atacagctta ctatataaca ataacaaatg aaatatcaaa aaatcccatt 360

actctattac taagtgtatt atttattaga tacatgtgta tctggaatag cattgaatca 420

tttcattcgc gaggagctgg atgagaagaa actctcatgt ccggttctgc agtagagatg 480

g 481

Claims (6)

1.一种鉴别狭叶重楼的分子标记在定性鉴定狭叶重楼中的应用，其特征在于，所述分子标记的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。

2.一种利用分子标记鉴别狭叶重楼的方法，其特征在于，包括：

以待测样品的基因组 DNA 为模板，采用引物对进行 PCR 扩增，得到的扩增产物用限制性内切酶Hpy99I 酶切；对酶切产物进行电泳检测，若在125bp和361bp处检出两种条带，则所述待测样品中含狭叶重楼的生物组织；

所述引物对的上游引物的核苷酸序列为：5’-GACAGAACCCGTGATTGTATAG-3’；所述引物对的下游引物为：5’-CCATCTCTACTGCAGAACCGG-3’。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：基因组DNA 50ng，1×PCR buffer 2.0μl，0.2mM dNTPs 1.6μL，0.5μM上游引物0.5μl，0.5μM下游引物 0.5μL，Taq 酶 1U，总体积 20μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述 PCR 扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃复性30s，72℃延伸1min，循环30 次；72℃延伸 7min。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶切的体系为：1UHpy99I、1μgDNA、0.5uL10×NEBbuffer、ddH₂O补足5μL，37℃反应1h。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述待测样品包括狭叶重楼、七叶一枝花或滇重楼的幼苗或根茎组织；所述待测样品还包括狭叶重楼、七叶一枝花、滇重楼药材中的一种或多种。

Images