CN109182573A - 一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于凉茶基原物种的质量安全领域，具体涉及一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法和应用。本发明鉴别凉茶半夏正品及其混伪品的方法具体为：对采集的样品进行DNA提取，包括半夏正品及半夏混伪品；以提取的DNA为底物，以正引物1与反引物1、正引物2与反引物2两对正反引物为引物，分别进行PCR扩增得到PCR产物，分别为matK序列、rbcL序列；对所得matK序列、rbcL序列进行检测、纯化、测序、拼接，得到matK和rbcL组合序列；使用Mega5.1构建系统发育树，以matK和rbcL组合序列作为DNA条形码，鉴别凉茶半夏正品及半夏混伪品。本发明方法操作简单，可以缩短鉴定时间，准确性高，能够成功地对凉茶及其混伪品进行快速有效鉴别。

Description

一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法和应用

技术领域

本发明具体涉及一种半夏正品及其混伪品的鉴别方法和应用，特别涉及一种基于matK和rbcL组合序列鉴别凉茶半夏正品及其混伪品的方法和应用，属于凉茶基原物种的质量安全领域。

背景技术

凉茶在我国广东地区已有一千七百多年的历史。由于部分药材采集难、价格昂贵等原因，市场上制假卖假、混淆用药，以假充真现象屡见不鲜。经初步调查我国用于凉茶的药用植物至少有400种，半夏作为其中的一种，主要用于燥湿化痰。半夏正品为天南星科植物半夏[Pinellia ternata(Thunb.)Breit.]，市场上流通的凉茶半夏原料主要是加工后的干燥块茎切片，通过凉茶铺、药材市场、村社调查，常见混伪品有福建半夏(Pinelliafujianensis)、湖南半夏(Pinellia hunanensis)、岩芋(Remusatia vivipara)、早花岩芋(Remusatia hookeriana)、一把伞南星(Arisaema erubescens)、异叶南星(Arisaemaheterophyllum)；由于经加工处理的混伪品表面性状、显微特征与正品都非常相似，在实际应用中要进行准确鉴别存在一定的难度，常导致错误使用。因此，需要一种能够准确快速、稳定鉴别半夏及其混伪品的方法。

目前虽有关于半夏混伪品鉴别的文献，但这些研究尚存在一些缺陷：大多数是基于植物形态学的鉴定，而形态学鉴定法对植物的新鲜程度和生长期有一定要求，性状鉴定需要鉴定者有丰富的经验，往往受鉴定工作者主观能动性影响，因此，鉴定结果易受人为因素干扰；半夏含有多种复杂化学成分，采用理化鉴定的方法以少数理化特征作为鉴定依据达不到很好的鉴定结果，且需要对药材进行复杂预处理耗时耗力，而且半夏和其混伪品的组织粉末和特异性不强，所以显微鉴别难以区分；目前也有学者采用DNA条形码的方法进行药材鉴别，采用的ITS2序列长度短，数量少，在提取扩增产物时较困难，故已有的研究不能有效鉴别凉茶半夏正品及混伪品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如ITS2序列长度短，数量少，在提取扩增产物时较困难，以及不具有专一性等诸多难题，且目前植物物种鉴定以传统的形态学鉴定为主，具有很大的局限性等，本发明提供了一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法。

本发明采用以下的技术方案来实现上述的目的，具体包括以下几个步骤：

(1)提取样品基因组DNA：

对采集的样品进行DNA提取，所述样品包括半夏正品及半夏混伪品；

(2)PCR扩增：

以步骤(1)提取的DNA为模板，以正引物1与反引物1、正引物2与反引物2两对正反引物为引物，分别进行PCR扩增得到PCR产物，即为matK序列、rbcL序列；

(3)对PCR产物进行检测、纯化、测序、拼接：

对PCR扩增所得matK序列、rbcL序列进行检测、纯化、测序、拼接，得到matK和rbcL组合序列；

(4)构建系统发育树：

使用Mega5.1构建系统发育树，以matK和rbcL组合序列作为DNA条形码，鉴别半夏正品及半夏混伪品。

步骤(2)中，选用两对引物的核苷酸序列具体为：

matK正引物1(SEQ.ID.NO.1)：5'－CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG－3'

反引物1(SEQ.ID.NO.2)：5'－ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC－3'

rbcL正引物2(SEQ.ID.NO.3)：5'－ATGTCACCACAAACAGAAACT－3'

反引物2(SEQ.ID.NO.4)：5'－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3'

步骤(2)中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4min；然后进入循环，每个循环93℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个热循环，最后72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物。

步骤(3)中，所述对matK序列和rbcL序列进行检测的方法为：采用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物matK序列和rbcL序列；

所述纯化具体为通过PCR产物回收试剂盒进行纯化回收；

所述测序为将纯化回收的PCR产物送测序公司进行DNA测序；

所述拼接具体为通过ClustalX软件进行错误位点修正，截去两个条形码首尾各20bp高噪音位点，再通过DNAMAN6.0软件对matK序列和rbcL序列进行拼接，得到matK和rbcL组合序列。

本发明还提供了一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法的应用，所述方法用于鉴别凉茶中的半夏正品及其混伪品。

与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：

(1)本发明对凉茶市场中半夏及其常见混伪品进行有效鉴别，利于规范凉茶市场，为公众，从业人员和决策部门提供科学依据，使人类免受伤害。

(2)目前植物界常用候选序列为matK、rbcL、psbA-trnH、ITS、trnL-trnF，所以本发明从ITS、psbA-trnH、matK和rbcL四个序列中筛选出适合鉴别凉茶半夏及其混伪品的核心DNA条形码，最终，matK和rbcL的扩增成功率均为100％，ITS只有30％，psbA-trnH测序后只能得到300bp低质量序列，故选择用matK和rbcL的组合序列进行鉴别，因此选择这两对引物，目前并未有基于matK和rbcL组合序列鉴别凉茶半夏与混伪品的研究。

(3)基于matK和rbcL组合序列成功鉴别凉茶半夏及其用作凉茶的混伪品，相比其他的研究仅限于中药材半夏，可以成功应用到凉茶混伪品的鉴定中。本发明提供的广东凉茶半夏鉴别方法为DNA提取方法和matK和rbcL组合序列制备方法，可以有效鉴别凉茶半夏的基原物种及混伪品，以及解决药用凉茶种质资源开发、利用问题。

(4)本发明方法操作简单，可以缩短鉴定时间，准确性高，避免人工主观意识的影响和传统化学检验方法的弊端，能够成功地对凉茶及其混伪品进行快速有效鉴别。

附图说明

图1为本发明的技术路线；

图2为基于matK和rbcL组合序列的各物种样品的系统发育树；

图3为基于matK序列的各物种样品的系统发育树；

图4为基于rbcL序列的各物种样品的系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

图1为本发明的技术路线；由图1所示，中国岭南地区做凉茶资源调查，并采集凭证标本；改良CTAB法提取植物DNA，通过比较扩增成功率选择matK和rbcL组合序列作为核心DNA条形码，选择能扩增matK和rbcL的两对引物；PCR扩增；产物的检测与纯化，公司测序，序列拼接与比对；部分混伪品种的matK和rbcL序列可在GenBank中下载使用，故不需再重复提取序列，省时省力；将比对好的凉茶半夏与混伪品序列导入Mega5.1构建系统发育树。

本发明的matK的正引物1与反引物1，rbcL的正引物2与反引物2，是在PubMed系统筛选中的引物序列。

本发明中，PVP为聚乙烯吡咯烷酮，Tris-HCl为三(羟甲基)氨基甲烷，EDTA为乙二胺四乙酸，CTAB为十六烷基三乙基溴化铵，RNase为核糖核酸酶。

实施例1：

(1)准备样品：

中国岭南地区做凉茶原料调查，并采集凭证标本；以下是采集的15种样品，包括凉茶半夏正品及不同产地不同生长方式下的混伪品，详见表1。

表1 15种样品的信息表

此外，调查走访的凉茶半夏混伪品中，一把伞南星、异叶天南星的matK和rbcL序列均可在GenBank中下载，故不重复实验提取DNA获得序列信息，一把伞南星、异叶天南星的matK和rbcL序列在GenBank中具体信息见表2。

表2 GenBank中一把伞南星、异叶天南星的matK和rbcL序列的信息表

(2)提取样品基因组DNA：

采用改良CTAB法提取样品DNA，对步骤(1)采集的15种样品进行DNA提取，包括半夏正品及其混伪品，提取方法在常规CTAB法基础上加以改进，将提取缓冲液中NaCl浓度提高到2.5mol·L^-1；延长温育时间至2h，不使用液氮研磨样品，提取缓冲液配方中去除巯基乙醇、PVP等成分；使用高纯水溶解DNA沉淀；提取步骤为：温育、氯仿萃取、沉淀；使操作简化从而降低中药材DNA提取难度。提取步骤具体为：

A温育：

取100mg样品，剪成小碎片置研钵中，加10％PVP-40粉末后，快速加入液氮研成粉末；将得到的混合液转入至离心管中，加1mL细胞核分离缓冲液(10mmol·L^-1Tris-HCl(pH8.0)，0.3mol·L^-1蔗糖，4‰β-巯基乙醇)迅速混匀，放置2min后，4℃12000g，离心4min，弃上清液，在沉淀物中加入1mL预热的提取缓冲液1(100mmol·L^-1Tris-HC1(pH 8.0)，20mmol·L-1EDTA，1mmol·L^-1NaCl，2％CTAB，1％PVP-40)，混匀后，置于65℃水浴30min(间隔晃动2～3次)，冷却至室温，得到反应物。

B氯仿萃取：

向反应物中，加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇体积比为24:1)，充分混匀，4℃10000g下，离心30min，取上清液。

C沉淀：

在步骤B的上清液中加入2mL提取缓冲液2(2％CTAB，50mmol·L^-1Tris-HC1(pH8.0)，10mmol·L-1EDTA，40mmol·L^-1NaC1)充分混匀，室温放置60min，4℃10000g下离心25min，弃上清液；

向得到的沉淀物中加入等体积的2.5mol·L^-1的NaCl溶液，并加入1μL RNase(10mg·mL^-1)，37℃保温30min，加入等体积的氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇体积比为24:1)充分混匀，4℃，10000g下，离心10min，取上清液，加入0.2mL 5mol·L^-1NaAc溶液混匀后，加入2mL预冷的无水乙醇，-20℃放置20min使DNA充分沉淀，8000g·min^-1下离心2min，倾倒出上清液，使用70％乙醇洗涤沉淀2次，沉淀置超净工作台吹干后，用100μL去离子水定容，得到DNA溶液，-20℃贮存备用。

(3)PCR扩增：

选用正引物1与反引物1、正引物2与反引物2两对引物，分别进行PCR扩增目的片段序列matK序列、rbcL序列，得到PCR产物；PCR扩增反应程序为：95℃预变性4min；然后进入循环，每个循环93℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个热循环，最后72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物matK序列、rbcL序列。

matK正引物1(SEQ.ID.NO.1)：5'－CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG－3'

反引物1(SEQ.ID.NO.2)：5'－ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC－3'

rbcL正引物2(SEQ.ID.NO.3)：5'－ATGTCACCACAAACAGAAACT－3'

反引物2(SEQ.ID.NO.4)：5'－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3'

(4)对PCR扩增所得matK、rbcL序列进行检测、纯化、测序、拼接：

对matK和rbcL序列进行检测，具体方法为：采用琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物，此过程中设置阴性对照，排除DNA污染情况，matK和rbcL的PCR产物均会在大约700bp的位置出现目的条带；通过PCR产物回收试剂盒进行纯化回收；将纯化回收的PCR产物送测序公司进行DNA测序；然后通过ClustalX软件进行错误位点修正，截去两个条形码首尾各20bp高噪音位点，再通过DNAMAN6.0软件对matK和rbcL序列进行拼接，分别得到15种半夏正品及其混伪品的matK和rbcL组合序列。

此外，对于5种GenBank中下载得到的凉茶半夏混伪品的matK序列和rbcL序列，采用DNAMAN8.0软件将matK序列和rbcL序列进行拼接，分别得到5种凉茶半夏混伪品的matK和rbcL组合序列。

(5)构建系统发育树，鉴别广东凉茶半夏正品及其混伪品：

将步骤(4)得到的20种半夏正品及其混伪品的matK和rbcL组合序列用Mega5.1构建系统发育树，以matK和rbcL组合序列作为DNA条形码，鉴别广东凉茶半夏正品及其混伪品。

对比例：

提取凉茶半夏及其混伪品DNA，选择相应的能够扩增matK、rbcL、ITS、psbA-trnH序列的引物，进行PCR扩增，其中，matK和rbcL的扩增成功率均为100％，ITS只有30％，psbA-trnH测序后只能得到300bp低质量序列，基于此数据结果，本发明选用matK和rbcL的扩增序列做凉茶半夏及其混伪品的鉴别分析，对扩增所得的产物matK和rbcL序列进行检测、纯化、测序与拼接，将序列导入Mega5.1，构建系统发育树。

由图2所示，基于matK和rbcL组合序列构建凉茶半夏及其混伪品的系统发育树图，可以明显区分开图中凉茶半夏与混伪品，福建半夏、早花岩芋、湖南半夏、一把伞南星、异叶南星也均单独聚为一支，呈现良好的单系性其鉴别成功率为100％。

由图3所示，基于matK序列构建的各物种样品的系统发育树中，半夏、福建半夏、早花岩芋、一把伞南星、异叶南星均单独聚为一支，仅湖南半夏未聚为一支，其鉴别成功率为6/7。

由图4所示，基于rbcL序列构建的各物种样品的系统发育树中，半夏、早花岩芋均未单独聚为一支，福建半夏、湖南半夏、一把伞南星及异叶南星均很好的聚为一支，其鉴别成功率为5/7。

因此，本发明以matK序列与rbcL序列作为DNA条形码检测广东凉茶半夏正品及其混伪品，鉴别成功率达100％，准确性高，避免人工主观意识的影响和传统化学检验方法的弊端，能够成功地对凉茶及其混伪品进行快速有效鉴别。

序列表

<110> 江苏大学

<120> 一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtacagtac ttttgtgttt acgag 25

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acccagtcca tctggaaatc ttggttc 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcaccac aaacagaaac t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgcatgtac ctgcagtagc 20

Claims (8)

1.一种凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取样品基因组DNA：

对采集的样品进行DNA提取，所述样品包括半夏正品及半夏混伪品；

（2）PCR扩增：

以步骤（1）提取的DNA为模板，以正引物1与反引物1、正引物2与反引物2两对正反引物为引物，分别进行PCR扩增，分别得到matK序列、rbcL序列；

（3）对PCR产物进行检测、纯化、测序、拼接：

对PCR扩增所得matK序列、rbcL序列进行检测、纯化、测序、拼接，得到matK和rbcL组合序列；

（4）构建系统发育树：

构建系统发育树，以matK和rbcL组合序列作为DNA条形码，鉴别半夏正品及半夏混伪品；

所述正引物1的核苷酸序列为：5'－CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG－3'；

所述反引物1的核苷酸序列为：5'－ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC－3'；

所述正引物2的核苷酸序列为：5'－ATGTCACCACAAACAGAAACT－3'；

所述反引物2的核苷酸序列为：5'－TCGCATGTACCTGCAGTAGC－3'。

2. 根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（2）中，所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性4 min ；然后进入循环，每个循环 93℃变性30s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个热循环，最后72℃延伸7min；4℃冷却后取出扩增产物。

3.根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，所述检测的方法为：采用琼脂糖凝胶电泳技术检测matK序列和rbcL序列。

4.根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，所述纯化为通过PCR产物回收试剂盒进行纯化回收。

5.根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，所述测序为将纯化回收的PCR产物送测序公司进行DNA测序。

6.根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，所述拼接具体为通过ClustalX软件进行错误位点修正，截去两个条形码首尾各20bp高噪音位点，再通过DNAMAN6.0软件对matK序列和rbcL序列进行拼接，得到matK和rbcL组合序列。

7.根据权利要求1所述的凉茶半夏正品及其混伪品的鉴别方法，其特征在于，步骤（4）中，构建系统发育树时，使用Mega5.1。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法用于鉴别凉茶中的半夏正品及其混伪品。