CN104561332B - 一种鉴定山杨性别的ssr分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

一种鉴定山杨性别的SSR分子标记及其应用，涉及一种应用SSR分子标记对山杨性别进行鉴定。本发明是要解决现有技术中不易鉴定山杨雌雄幼株的技术问题，从而提供了一种鉴定山杨性别的SSR分子标记及其应用。本发明的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记，用于PCR扩增分子标记的引物对为P60F和P60R，具体序列为：P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC，P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC。本发明的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记用于鉴别山杨的雌雄性别。本发明应用于分子标记技术领域。

Description

一种鉴定山杨性别的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明属于分子标记技术领域，涉及一种应用SSR分子标记对山杨性别进行鉴定。

背景技术

山杨(Populus Davidiana.Dode)是我国广泛分布的乡土树种之一，也是白杨派的重要山地造林树种。其材质优良、木材色白、质轻而软、结构均匀、纹理通顺，是优质的工业原料。

山杨均为雌雄异株，雌雄株具有不同的经济价值，如雄株生长势较雌株好，适用于防护林的栽培，雌株开花飞絮给环卫带来不少问题。因此在育种过程中选择合适比例的植株进行栽培，可以提高杨树的利用率。但是，杨树早期利用外部形态特征进行性别鉴定存在困难，只有在花果期可以进行准确的性别鉴定。

以往大多数研究者常从雌雄株外部形态的差异、过氧化物同工酶的差异、生理生化上的差异、雌雄株叶片中氨基酸含量的差异和核型分析等方面对性别鉴别进行了研究(董莉娜，2007)，但这些性别鉴别方法大都是对己成熟的个体进行性别差异研究。此外，雌雄异株植株的性别分化是一个复杂的过程，采用基因表达后水平的差异进行早期性别鉴定的准确性和可靠性不高，不能很好地适用于雌雄异株植物的早期性别鉴别(尹立辉，2003)。近年来，DNA分子标记技术因其不受发育阶段、外界环境及组织特异性的影响，并能够提供多位点分析等优势，被广泛地应用于雌雄异株植物的早期性别鉴定研究中，成功地应用于大麻(陈其军，等2001；Mandolino G，1999)、银杏(王晓梅等，2001；王晓梅等，2002)、番木瓜(Parasnis A S，1999)、猕猴桃(GillG P，1998)等植物的性别早期鉴别。一般认为简单重复序列(simple sequence repeat,SSR)或者微卫星DNA(microsatellite DNA)是由1-6个碱基组成的短串联重复序列，呈现共显性遗传的特点，能够区分纯合子和杂合子。因此，山杨SSR连锁的性别标记筛选，不仅能够建立准备高效的遗传性别鉴定方法，还有助于山杨性别决定区的确定及性别差异基因的筛选研究。有关山杨性别连锁的SSR标记及遗传性别检测技术，目前国内外均未见文献报道。

发明内容

本发明是要解决现有技术中不易鉴定山杨雌雄幼株的技术问题，从而提供了一种鉴定山杨性别的SSR分子标记及其应用。

本发明的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记，用于PCR扩增分子标记的引物对为P60F和P60R，具体序列为：

P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC

P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC。

本发明的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，它用于鉴别山杨的雌雄性别。

本发明包含以下有益效果：

本发明从200对微卫星引物中筛选出1对用于鉴定山杨性别的特异性SSR标记，带型清晰、重复性好，能100％鉴别，可靠性强，可作为山杨的雌雄性别鉴定的引物。

本方法筛选的山杨性别鉴定的引物特异性极高，稳定性极强的SSR引物，不需要进行聚丙烯酰胺凝胶电泳片段分离，只需要进行常规的琼脂糖凝胶电泳检测即可完成对山杨性别的快速鉴定，为山杨的定向育种提供理论和技术上的指导。

附图说明

图1为微卫星引物P60扩增第一组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；

图2为微卫星引物P60扩增第二组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；

图3为微卫星引物P60扩增第三组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；

图4为微卫星引物P60扩增第四组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记，用于PCR扩增分子标记的引物对为P60F和P60R，具体序列为：

P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC

P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC。

具体实施方式二：本实施方式的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，它用于鉴别山杨的雌雄性别。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：鉴别山杨的雌雄性别的方法如下：采用PCR方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样品的微卫星标记基因型，若检测得到长度为550bp左右的单一片段为雄性，未检测到550bp左右的单一片段为雌性，从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：所述的采用PCR方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样品的微卫星标记基因型的具体操作如下：

一、提取待测样品的基因组DNA，备用；

二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，利用P60F和P60F引物，进行PCR反应；

三、待步骤二的PCR反应结束后，收集PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像仪观察电泳条带并拍照，若电泳得到长度为550bp左右的单一片段为雄性，未检测到550bp左右的单一片段为雌性，从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别；

其中，所述的P60F和P60R引物序列为：

P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC

P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：所述的PCR反应体系为：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。其它与具体实施方式二至四之一相同。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

一、山杨微卫星标记的筛选及其引物序列

1、山杨的基因组DNA提取

采用北京庄萌生物技术有限公司的植物组织基因组DNA提取试剂盒，按其说明书进行。提取的DNA用1％琼脂糖和紫外分光光度计进行浓度和质量的测定。用无菌水稀释至50ng/μL左右。

2、BSA基因池的建立

雌雄个体各5个，每个取20μL DNA溶液混合构成相应的雌雄基因池。

3、性别连锁的微卫星标记引物的筛选及PCR扩增

本研究使用的SSR引物分别来自：1)Populus Molecular Genetics Cooperative

(http://www.ornl.gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm，USA)，命名为‘P’、‘F’‘T’或‘G’；2)Oak Ridge National Laboratory(Department of Energy，USA)(Tuskan etal.2004)，命名为‘O’。

以200对引物对所构建的雌雄基因池进行PCR扩增反应，分析各对引物扩增的SSR电泳图谱，初步找出雌雄两个群体的差异性条带作为候选的性别特异SSR分子标记，将所对应的引物，按照上述PCR条件对构建雌雄基因池的24(图1)个山杨个体进行PCR扩增，分析有差异的等位基因片段在个体上具体的扩增情况，然后用其余的72(图2、图3、图4)个个体进行同样的操作，以进一步验证所得候选标记的正确性。总共用了200对SSR引物对5个山杨雄性个体和5个山杨雌性个体的基因组DNA进行了扩增，然后对电泳后产生的DNA条带图谱进行观察，照相和分析，筛选出1个与性别连锁的SSR标记。

图1为微卫星引物P60扩增第一组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；图2为微卫星引物P60扩增第二组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；图3为微卫星引物P60扩增第三组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨；图4为微卫星引物P60扩增第四组雌雄基因池中的24个山杨个体的微卫星图谱；其中，1-12为雌性山杨，13-24为雄性山杨。从图1、图2、图3和图4可以看出，雄性山杨经引物P60扩增后，在550bp左右出现单一片段，而雌性山杨在550bp左右未出现单一片段。

二、基于微卫星标记的山杨遗传性别鉴定方法

1、提取山杨的基因组DNA

①取新鲜山杨嫩叶75-100mg，于液氮中充分研磨至细粉状，将研磨好的粉末转移到预先装有500μL的溶液A的离心管中，充分颠倒混匀，如果需要去除RNA，可在加入植物缓冲液A后，立即加入5μL RNaseA(10mg/mL)溶液，振荡混匀15秒；

②迅速涡旋混匀1分钟，将离心管65℃水浴10分钟(其间涡旋振荡混合样品数次，使样品混合更均匀)；

③加入70μL植物缓冲液B，涡旋振荡混匀1分钟，12000r/min离心10分钟；

④小心地将上一步所得上清转入一个新的离心管中，加入加入上清液0.5倍体积的异丙醇，充分混匀；

⑤将混匀的液体全部转入吸附柱中，12000r/min离心30秒-2分钟，弃掉废液；

⑥向吸附柱中加入500μL植物缓冲液C，12000r/min离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

⑦向吸附柱中加入700μL漂洗液W2，12000r/min离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；

⑧向吸附柱中加入500μL漂洗液W2，12000r/min离心30秒，倒掉废液；

⑨将吸附柱放回收集管中，12000r/min离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱置于新的离心管中，室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

⑩将吸附柱转入一个干净的离心管中，向吸附柱的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000r/min离心2分钟，将溶液收集到离心管中，即得到样品基因组DNA原液，-20℃保存备用；

2、异条带的筛选与验证

①以样品DNA为模板进行PCR扩增，25uL反应体系中包含以下溶液或试剂：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。

②反应结束后，将得到的PCR产物通过溴化乙锭染色，在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，使用DL2000marker为参照，通过UVP多功能凝胶成像系统检测PCR扩增产物，紫外光下观察样品PCR扩增产物目的片段的长度；

电泳条件：电压1200V，功率50W，电流50mA，温度45℃，时间1.5h。

若电泳得到长度为550bp左右的单一片段为雄性，未检测到550bp左右的单一片段为雌性。

Claims (4)

1.一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，其特征在于用于PCR扩增分子标记的引物对为P60F和P60R，具体序列为：

P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC，

P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC；

鉴别山杨的性别的方法为：采用PCR方法，利用引物P60F和P60R，检测待测样品的微卫星标记基因型，若检测得到长度为550bp的单一片段为雄性，未检测到550bp的单一片段为雌性，从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别。

2.如根据权利要求1所述的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，其特征在于它用于鉴别山杨的雌雄性别。

3.根据权利要求1所述的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，其特征在于所述的采用PCR方法，利用权利要求1的引物对，检测待测样品的微卫星标记基因型的具体操作如下：

一、提取待测样品的基因组DNA，备用；

二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，利用P60F和P60F引物，进行PCR反应；

三、待步骤二的PCR反应结束后，收集PCR产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳，溴化乙锭染色，在凝胶成像仪观察电泳条带并拍照，若电泳得到长度为550bp的单一片段为雄性，未检测到550bp的单一片段为雌性，从而完成对山杨的雌雄性别的鉴别；

其中，所述的P60F和P60R引物序列为：

P60F：CCTAGCCTTCATTCTCATTCAGC

P60R：GGTTGCTAGTCAGCTTCTTACC。

4.根据权利要求3所述的一种鉴定山杨性别的SSR分子标记的应用，其特征在于所述的PCR反应体系为：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸60s，共35个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。