CN104293942A - 用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的ssr分子标记a001 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001，涉及分子遗传育种技术领域。本分子标记A001在雌株中扩增得到的特异片段核苷酸序列如SEQ.IDNo1所示；所述标记的引物序列如SEQ.IDNo2和SEQ.IDNo3所示。本分子标记A001可用于猕猴桃雌雄性别的早期鉴定检测，避免大量雄株在育种和生产中造成极大的浪费；利用高密度遗传图谱，能快速发掘性别相关的分子标记用于辅助育种，为功能标记的开发提供了重要的实践经验；本分子标记A001用于雌雄性别标记辅助选择，将大大提高育种中雌株的选择效率，缩短育种周期，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

Description

用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001

技术领域

本发明涉及分子遗传育种技术领域，尤其涉及一种用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001（A001是为区别其它SSR分子标记而命名的，A为猕猴桃拉丁名Actinidia的首字母），即用于猕猴桃幼苗雌雄性别性状的早期分子辅助选择，以提高育种效率，减少土地和人力成本。

背景技术

猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.)富含果实维生素C、膳食纤维和多种矿物营养，被誉为“水果之王”，是一种有益健康的新兴高档水果。随着人民生活水平的迅速提高，对高品质和新品种猕猴桃的需求显著增加，猕猴桃育种效率亟待提升。猕猴桃为功能性雌雄异株植物，具有花形态相似但雌雄器官相异的雌花和雄花。猕猴桃杂交后代的雌雄分离比例约为1：1，鉴于猕猴桃雌雄异株的性别功能，猕猴桃果园通常配置少量授粉雄株以保证果园产量和果实品质，剩余的雄株则除掉。作为多年生果树，猕猴桃在传统育种中面临着童期长、占地面积大等问题。猕猴桃幼苗往往下地种植数年后才能开花，利用猕猴桃花形态结构的差异方能鉴别植株的雌雄性别，因此在开花前的数年内大量的不结果雄株给育种工作造成了极大的浪费。由于缺乏可用的猕猴桃雌雄性别鉴别的分子标记，猕猴桃植株的早期性别鉴定工作一直难以开展。SSR标记具高多态性、位点特异性、稳定性高和操作程序简单等优势，是一种检测方便的共显性遗传标记。结合遗传学和基因组学研究成果，开展猕猴桃分子标记辅助育种研究，构建经济、高效的分子育种技术体系，已经成为猕猴桃育种的重要研究方向。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一种用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001。

具体要求是：

筛选出用于猕猴桃早期性别鉴定的分子标记；

提供上述分子标记的获得方法；

提供上述分子标记在猕猴桃性别鉴定以及标记辅助育种中的应用。

本发明的目的是这样实现的：

利用猕猴桃高密度遗传图谱，定位花性别表型性状位点，在性别决定区间筛选SSR标记，最终得到能用于猕猴桃早期性别鉴定的分子标记，形成本项发明的技术方案。猕猴桃植株早期性别鉴定在很大程度减少育种前期在土地、生产资料和人力成本的浪费，有着重要的理论学术意义和较高的经济价值。

一、分子标记A001

用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001（简称分子标记A001）在雌株中扩增得到的特异片段核苷酸序列如SEQ.ID No1 所示。

分子标记是基于猕猴桃性别决定区域的简单重复序列多态性开发的。根据性别相关区域的序列信息设计特异性引物，PCR扩增产物表现为雌株为两条谱带，而雄株为一条谱带，通过扩增长度为202bp的雌株特异片段来区分猕猴桃雌雄性别。

本发明还提供了扩增上述分子标记的引物。

所述S001标记的引物序列如SEQ.ID No2 和 SEQ.ID No3 所示。

二、分子标记获得方法

分子标记获得方法包括下列步骤：

①构建猕猴桃高密度遗传图谱；

②收集性别表型转换为表型标记；

③在遗传图谱上定位表型标记；

④在基因组序列上确定性别决定区间；

⑤筛选性别决定区间内SSR标记。

其工作机理是：

基因组中存在许多简单序列重复（SSR）单元，其数目存在高度变异。由于特定的SSR的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以根据侧翼序列合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物就产生长度的多态性，以此来检测等位基因的多态性。

三、分子标记应用

分子标记A001在山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中的应用

利用上述分子标记的引物扩增猕猴桃杂交群体中雌株基因组DNA和雄株基因组DNA，在猕猴桃雌株中扩增得到两条谱带，其中一条谱带为雌株特有的分子标记特征谱带，所述携带目标特征谱带的植株鉴定为雌株。

在分子标记引物扩增猕猴桃基因组DNA中，PCR 反应扩增体系为：

10μL反应体系包括正、反向引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，1μl 10X Taq buffer，0.5 units Taq 聚合酶，50ng DNA 模板。

在分子标记引物扩增猕猴桃基因组DNA中，PCR 扩增程序为：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58 ℃退火35s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸5-10min。

PCR扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳（8％）。

本发明具有下列优点和积极效果：

①本分子标记A001可用于猕猴桃雌雄性别的早期鉴定检测，避免大量雄株在育种和生产中造成极大的浪费；

②利用高密度遗传图谱，能快速发掘性别相关的分子标记用于辅助育种，为功能标记的开发提供了重要的实践经验；

③本分子标记用于雌雄性别标记辅助选择，将大大提高育种中雌株的选择效率，缩短育种周期，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

附图说明

图1为本分子标记A001在第9个连锁群上的示意图；

图2为本分子标记A001在群体筛选中扩增的聚丙烯凝胶电泳图；

图3为本分子标记A001在杂交群体雌株和雄株中扩增的聚丙烯凝胶电泳图之一；

图4为本分子标记A001在杂交群体雌株和雄株中扩增的聚丙烯凝胶电泳图之二；

英译汉

1、SSR（Simple Sequence Repeats）标记：是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA（Microsatellite DNA），是一类由几个核苷酸（一般为1～6个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。

2、PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

具体实施方式

下面结合附图和实施例详细说明：

若未特别指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

一、分子标记A001的获得

试验地点：中国湖北省大悟县；试验时间：2014年4月

材料：试验选用174份‘山梨’和‘桂海4号’杂交群体为猕猴桃分子遗传研究的群体，其中包括87份猕猴桃雄株和87份猕猴桃雌株。山梨（A. rufa）猕猴桃维生素C含量极低，抗寒、耐储，果柄基部不生成离层，具有越冬不落果的特性。‘桂海四号’(A. chinensis cv.‘GuiHai No.4’) 维生素C含量高，适应性广，抗逆性强，耐高温干旱，且抗炭疽病、日灼病的能力强，感病率低。

①构建猕猴桃高密度遗传图谱

利用具有各自优良性状且遗传关系较远的‘山梨’和‘桂海四号’构建杂交群体。基于第二代测序的RAD-seq技术，对基因组进行简化测序，快速检测亲本及分离群体的SNP基因型，构建基因型数据库；运用JoinMap 4.1作图软件构建猕猴桃的高密度遗传连锁图谱。

②收集性别表型转换为表型标记

调查收集杂交群体中各单株的雌雄性别，建立性别表型数据库，将雌株和雄株的性别表型转换为一个表型分子标记。

③在遗传图谱上定位表型标记

结合基因型SNP标记和表型分子标记，运用JoinMap 4.1作图软件将性别表型标记定位在遗传连锁图上的第9号连锁群上（见图1）。

④在基因组序列上确定性别决定区间

整理性别表型标记附近的SNP分子标记A001，将SNP标记A001的核苷酸序列比对到猕猴桃基因组序列；比对结果显示性别表型标记邻近的SNP标记A001均来自于第25号染色体上，具体位置在2Mb附近；因此，将猕猴桃性别相关区段锁定在第25号染色体的1.5-2.5Mb区间内。

⑤筛选性别决定区间内SSR标记A001

提取猕猴桃基因组第25号染色体上1.5-2.5Mb区间的核苷酸序列，搜索到有功能的简单重复序列30个；利用Primer5.0 软件，针对简单重复序列设计扩增引物；利用设计合成的引物，对猕猴桃雌株和雄株进行PCR扩增，摸索合适的扩增条件，保证扩增条带的清晰度和稳定性；筛选得到本分子标记能在雌株中扩增得到两条谱带，而雄株中得到一条谱带（见图2）。

二、分子标记A001的应用

1、分子标记A001在山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中的应用之一

采集中国湖北省大悟县山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中87份雌株和87份雄株的嫩叶片，提取植株基因组DNA；采用分子标记引物SEQ.ID No2 和SEQ.ID No3对174份猕猴桃DNA样本进行扩增。

PCR 反应扩增体系为：10μL反应体系包括正、反向引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂, 1μl 10X Taq buffer，0.5 units Taq 聚合酶，50ng DNA 模板；

PCR 扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58 ℃退火35s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸5-10min。除了F14和F75外，其余的85份雌株均扩增到两条谱带，特异谱带片段大小为202bp；在所有的87份雄株中，均得到一条扩增谱带；图3 显示了本分子标记在杂交群体雌株和雄株中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。

鉴定结果：

2、分子标记A001在山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中的应用之二

采集中国湖北省武汉市山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中100份雌株和100份雄株的嫩叶片，提取植株基因组DNA；采用分子标记引物SEQ.ID No2 和SEQ.ID No3对200份猕猴桃DNA样本进行扩增。

PCR 反应扩增体系为：10μL反应体系包括正、反向引物各0.2μM，0.2mM dNTPs，2mM MgCl₂，1μl 10X Taq buffer，0.5 units Taq 聚合酶，50ng DNA 模板；

PCR 扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58 ℃退火35s，72℃延伸50s，33个循环；72℃延伸5-10min。在100份雌株中，除了F9、F14、F37、F41、F63和F81外，其余的94份雌株均扩增到两条谱带，特异谱带片段大小为202bp；在所有的100份雄株中，除F12和F13外，均未扩增到特异谱带；图4 显示了本分子标记性别鉴定标记在杂交群体雌株和雄株中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。

鉴定结果

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001

<140> 

<141> 

<160> 3

<210> 1

<211> 202

<212> 分子标记

<400> TGGGTAAACATAACCACATGCCAACACACACTCACGTAAAGACACACACGTGCATCCATTCATGCATATTTCCTGCTGCACACCACACGCATGCGCGCGTGCACACGCATAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGATTCCTCAGAAAAAAGGCAAAAGGCAATTGAAAGCTCGTAGATATGGACAAAGGAATGTCTAAATGCATTGA；

<210> 2

<211> 28

<212> 引物-1

<400> TCAATGCATTTAGACATTCCTTTGTCCA；

<210> 3

<211> 25

<212> 引物-2

<400> TGGGTAAACATAACCACATGCCAAC。   

序列表

<110> 中国科学院武汉植物园

<120> 猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001

<140>

<141>

<160> 3

<210> 1

<211> 202

<212> 分子标记

<400> TGGGTAAACATAACCACATGCCAACACACACTCACGTAAAGACACACACGTGCATCCATTCATGCATATTTCCTGCTGCACACCACACGCATGCGCGCGTGCACACGCATAGGGAGAGAGAGAGAGAGAGATTCCTCAGAAAAAAGGCAAAAGGCAATTGAAAGCTCGTAGATATGGACAAAGGAATGTCTAAATGCATTGA；

<210> 2

<211> 28

<212> 引物-1

<400> TCAATGCATTTAGACATTCCTTTGTCCA；

<210> 3

<211> 25

<212> 引物-2

<400> TGGGTAAACATAACCACATGCCAAC。

Claims (3)

1.一种用于猕猴桃杂交群体雌雄性别鉴定的SSR分子标记A001，其特征在于：

在雌株中扩增得到特异片段核苷酸序列如SEQ.ID No1所示；

所述S001标记的引物序列如SEQ.ID No2 和 SEQ.ID No3 所示。

2.按权利要求1所述的SSR分子标记的获得方法，其特征在于包括下列步骤：

①构建猕猴桃高密度遗传图谱；

②收集性别表型转换为表型标记；

③在遗传图谱上定位表型标记；

④在基因组序列上确定性别决定区间；

⑤筛选性别决定区间内SSR标记。

3.按权利要求1所述的SSR分子标记的应用，其特征在于：

分子标记在山梨猕猴桃和中华猕猴桃‘桂海4号’杂交群体中的应用。