CN104894288A - 一种石斛dna指纹图谱及其专用引物和建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种石斛DNA指纹图谱及其专用引物和建立方法。所述专用引物其核苷酸序列如序列表所示，所述专用引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。采用石斛材料的基因组DNA作为模板，用上述任一专用引物进行SRAP-PCR扩增；将得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。本发明创建了石斛DNA指纹图谱，能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准确、可靠。

Description

一种石斛DNA指纹图谱及其专用引物和建立方法
技术领域
本发明属于植物DNA指纹图谱技术领域，具体涉及一种石斛DNA指纹图谱及其专用引物和建立方法。
背景技术
石斛属(Dendrobium)是兰科中最大的一个属。我国目前广泛种植的石斛属植物有金钗石斛、霍山石斛、铁皮石斛等。尤其是铁皮石斛(Dendrobiumofficinale Kimura et Migo)由于具有益胃生津、滋阴清热等功效(中国药典(2010年))，种植面积在我国发展很快。生产上多以味甘、质重、柔韧、粘性强等外观形态来评价铁皮石斛的质量。目前铁皮石斛价格昂贵，市场上铁皮石斛品种繁多，不同品种间茎叶颜色存在差异，多糖含量、甘露糖含量、生物碱等功能成分含量高低不一，抗病性也存在较大差异。仅仅通过外观形态鉴别，很容易以次充好，消费者往往很难鉴别。因此，准确鉴别石斛品种真伪对其生产有重大意义。另外，对种植者来说选择一种优良品种，有助于获得较高的经济效益。
G.Li等在《Theoretical and Applied Genetics》(《理论与应用遗传学》)2001年第103期455-461页发表了题为《Sequence-related amplifiedpolymorphism(SRAP),a new marker system based on a simple PCR reaction:itsapplication to mapping and gene tagging in Brassica》(相关序列扩增多态性，一种新的基于PCR的标记系统及其在芸薹属作图和基因标签法上的应用)一文。文中评述SRAP是一种新型的基于PCR的标记系统，它的正向引物含有一段14个碱基的核心序列，5’端前10个碱基是无任何碱基特异构成的填充序列，接着为CCGG序列，该序列可特异结合开放阅读框(ORF)区域中的外显子，其后为3’端的3个选择性碱基；反向引物与正向引物的碱基组成不同在于填充序列后为AATT序列，该序列可特异结合启动子和内含子区域，其扩增产物多位于外显子区域。SRAP技术由于具有简便、可靠、易于分离条带和测序等优点，已成功用于甘蓝、西葫芦、茄子等蔬菜和棉花等作物品种鉴定、DNA指纹图谱构建。然而还未见该技术在石斛指纹图谱建立中的应用。
发明内容
本发明的目的是，提供一种石斛NDA指纹图谱及其专用引物和建立方法。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其核苷酸序列如序列表所示，所述专用引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。所述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.8分别对应序列表中的序列1-序列8。
进一步地，一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，所述专用引物由序列表中的以下6对引物组成：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
具体地，所述专用引物由以下6对引物(引物序列均为5’-3’)组成：
(1)TGAGTCCAAACCGGATA和GACTGCGTACGAATTCAA；
(2)TGAGTCCAAACCGGATA和GACTGCGTACGAATTCAG；
(3)TGAGTCCAAACCGGAAT和GACTGCGTACGAATTGAC；
(4)TGAGTCCAAACCGGAAT和GACTGCGTACGAATTAAC；
(5)TGAGTCCTTTCCGGTGC和GACTGCGTACGAATTCAG；
(6)TGAGTCCAAACCGGTAG和GACTGCGTACGAATTGAC。
优选地，所述专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。
本发明还提供一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引物进行SRAP-PCR扩增；
步骤2，将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。
本发明还提供了利用上述指纹图谱建立方法获得的石斛DNA指纹图谱。所述石斛DNA指纹图谱由“0”和“1”组成的一串有序数字表示，具体为：01100000000，01000000000，00000110101，00000100101，00010111001，10010011000，00010110001，00001101100，00000100001，00010101100，00010110000，00000101101，00001110100，00000101100，00010110100，00000100000，00010100000，00010100010及00000001000。其中数字“1”表示图谱中确定位置上存在扩增条带，“0”表示图谱中该位置上没有扩增条带存在。转换成了数码形式，便于计算机识别和分析。上述19串数字分别对应2种霍山石斛和17种铁皮石斛的DNA指纹图谱。其中，每串有序数字具有11个数位，从第1数位到第11数位对应的引物对以及特征条带为：第1数位表示ME8和EM14引物对，特征条带为180bp；第2数位表示ME8和EM14引物对，特征条带为190bp；第3数位表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp；第4数位表示ME9和EM3引物对，特征条带为250bp；第5数位表示ME9和EM3引物对，特征条带为260bp；第6数位表示ME1和EM7引物对，特征条带为220bp；第7数位表示ME1和EM7引物对，特征条带为140bp；第8数位表示ME1和EM14引物对，特征条带为170bp；第9数位表示ME1和EM14引物对，特征条带为250bp；第10数位表示ME3和EM3引物对，特征条带为150bp；第11数位表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
本发明还提供了所述任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明利用SRAP分子标记来鉴定石斛品种，通过构建基于每个石斛品种的SRAP分子标记指纹图谱，为种植者提供参考。能从遗传本质上对石斛品系进行种质鉴定，准确、可靠。
2、当石斛指纹图谱一旦建立以后，在对某个未知样品进行真实检测时，几个小时就可以知道该石斛DNA指纹，因此可以迅速判断出石斛品种的真实性。
3、采用该发明，构建该DNA指纹图谱所用的样品可以根据需要不断增加，并对指纹进行实时更新。
4、本发明采用表的形式来说明DNA指纹图谱，并将其转换成了数码形式，便于计算机识别和分析。
附图说明
图1为本发明实施例中引物对ME8和EM14在20份石斛材料中的电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。
实施例1
本实施例采用收集到的20份具有广泛代表性的石斛品系为供试材料，用组培苗提取DNA，进行SRAP分析，建立与之相对应的指纹图谱。得到的指纹图谱再用于对这20种石斛品种进行鉴定，并为其它石斛的种质鉴定提供一条可供借鉴的有效方法。建立石斛DNA指纹图谱的具体操作如下：
1、选用代表性石斛品种
本实施例采用表2所示20份石斛品种，其中金钗石斛(Dendrobiumnobile Lindl.)1份，霍山石斛(Dendrobium huoshanense)1份，铁皮石斛(Dendrobium officinale)18份，选材以生产中广泛种植的石斛品系，参见表1。本实施例以20份石斛的叶片提取DNA，建立了这20份石斛品系的DNA指纹图谱。这些石斛材料具有较好的代表性。
表1：石斛种质及其来源
种类 编号 拉丁名 来源地
金钗石斛 SH-1 Dendrobium nobile Lindl. 广西
霍山石斛 SH-2 Dendrobium huoshanense 安徽霍山
铁皮石斛 SH-3 Dendrobium officinale 云南
铁皮石斛 SH-4 Dendrobium officinale 安徽
铁皮石斛 SH-5 Dendrobium officinale 浙江
铁皮石斛 SH-6 Dendrobium officinale 浙江德清县
铁皮石斛 SH-7 Dendrobium officinale 浙江
铁皮石斛 SH-8 Dendrobium officinale 浙江
铁皮石斛 SH-9 Dendrobium officinale 上海
铁皮石斛 SH-10 Dendrobium officinale 上海
铁皮石斛 SH-11 Dendrobium officinale 上海
铁皮石斛 SH-12 Dendrobium officinale 上海
铁皮石斛 SH-13 Dendrobium officinale 云南
铁皮石斛 SH-14 Dendrobium officinale 浙江
铁皮石斛 SH-15 Dendrobium officinale 浙江雁荡山
铁皮石斛 SH-16 Dendrobium officinale 浙江天目山
铁皮石斛 SH-17 Dendrobium officinale 广东韶山
铁皮石斛 SH-18 Dendrobium officinale 福建
铁皮石斛 SH-19 Dendrobium officinale 浙江丽水
铁皮石斛 SH-20 Dendrobium officinale 上海
2、石斛品系的DNA提取及纯化
取石斛幼苗两三片，以Doyle等人提出的CTAB法提取DNA(Focus,1990,12:13-15)，所得产物用TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA)保存。然后用NanoUV-3000超微量紫外分光光度计测定其浓度，稀释至20ng·μL-1，于-20℃下保存备用。
3、SRAP-PCR扩增及电泳检测
采用10μL反应体系，其中包括MgCl22.0mmol·L-1，dNTP各为0.2mmol·L-1，引物0.50μmol·L-1，模板DNA 50ng，Taq DNA聚合酶1U。
PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，35℃复性1min，72℃延伸1min，5个循环；94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃延伸7min。
电泳步骤如下：扩增产物加5μL上样缓冲液，94℃变性5min。然后迅速将其置于冰上冷却。采用4％变性聚丙烯酰胺凝胶，0.5×TBE缓冲液，50W恒功率电泳约1.5h，银染检测电泳结果。选择有代表性的多态性SRAP扩增条带构建供试材料的指纹图谱。
4、构建DNA指纹图谱
构建指纹图谱时，本着用最少引物、最少条带，又要把所有供试样品区分开来的原则，本实施例从110对SRAP引物中筛选出ME1和EM7；ME1和EM14；ME3和EM3；ME3和EM5；ME8和EM14；ME9和EM3这6对专用引物组合。引物序列参见表2。
表2：石斛DNA指纹图谱的引物序列
引物名称 引物序列(5'--3')
ME1 TGAGTCCAAACCGGATA(SEQ ID NO.1)
ME3 TGAGTCCAAACCGGAAT(SEQ ID NO.2)
ME8 TGAGTCCTTTCCGGTGC(SEQ ID NO.3)
ME9 TGAGTCCAAACCGGTAG(SEQ ID NO.4)
EM3 GACTGCGTACGAATTGAC(SEQ ID NO.5)
EM5 GACTGCGTACGAATTAAC(SEQ ID NO.6)
EM7 GACTGCGTACGAATTCAA(SEQ ID NO.7)
EM14 GACTGCGTACGAATTCAG(SEQ ID NO.8)
上述6对引物共扩增出127个条带，从中选取其中11条稳定性和重复性良好、多态性高的条带，用于构建这20个石斛材料的DNA指纹图谱。参见图1，该图为引物组合ME8和EM14引物对在20份石斛材料中的电泳图。其中，a表示特征条带为180bp；b表示特征条带为190bp。c表示特征条带为240bp；采用的引物对为ME8和EM14。电泳图中M泳道代表100bp marker，泳道1-20的标号分别对应编号SH-1到SH-20的石斛材料。
根据每条引物呈现的条带信息建立指纹图谱。根据这11条扩增条带的有无，绘制出所有20个材料的DNA指纹图谱。在该图谱中，每个材料都具有其特异的DNA指纹。为了描述方便，设定用“1”表示图谱中某个位置上有扩增条带存在，用“0”表示在该位置上没有扩增条带存在。最终，每个材料都拥有了有“1”和“0”组成的一串短数字。
如表3所示，本实施例中20份石斛材料的DNA指纹图谱中，左栏为石斛品系，右栏为相对应的有11个数字串。
表3：20个石斛材料的DNA指纹
材料 a b c d e f g h i j k
SH-1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SH-2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
SH-3 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SH-4 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1
SH-5 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1
SH-6 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1
SH-7 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0
SH-8 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1
SH-9 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0
SH-10 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1
SH-11 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0
SH-12 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0
SH-13 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1
SH-14 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0
SH-15 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0
SH-16 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0
SH-17 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
SH-18 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0
SH-19 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0
SH-20 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
上述表3中a表示ME8和EM14引物对，特征条带为180bp。b表示ME8和EM14引物对，特征条带为190bp。c表示ME8和EM14引物对，特征条带为240bp。d表示ME9和EM3引物对，特征条带为250bp。e表示ME9和EM3引物对，特征条带为260bp。f表示ME1和EM7引物对，特征条带为220bp。g表示ME1和EM7引物对，特征条带为140bp。h表示ME1和EM14引物对，特征条带为170bp。i表示ME1和EM14引物对，特征条带为250bp。j表示ME3和EM3引物对，特征条带为150bp。k表示ME3和EM5引物对，特征条带为150bp。
实施例2
本发明石斛DNA指纹图谱用于石斛的种质鉴定
假设供试材料中SH是生产上应用的优良品种，现有一批石斛不能确定是否是真正的石斛SH-15。可按照如下方法对它的DNA指纹进行鉴定。
石斛标准DNA指纹图谱建立以后，要对某个样品进行真伪性鉴定时，提取待测样品DNA，用提取的DNA为模板，用ME1和EM7；ME1和EM14；ME3和EM3；ME3和EM5；ME8和EM14；ME9和EM3这6对引物对其进行SRAP-PCR扩增，扩增产物在4％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，绘制出该待测样品的DNA指纹图谱，与标准DNA指纹图谱进行比对，就可以知道该品种是否是真正的石斛SH-15。
结果表明它的DNA指纹是00000101100，这与SH-15的标准指纹是一致的，因此所检测的石斛品种是SH-15。如果待测样品的指纹不是00000101100，那么该材料就不是真正的SH-15。
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。
<110>  上海孙桥现代农业联合发展有限公司
       上海孙桥农业科技股份有限公司
       上海交通大学
 
<120>  一种石斛DNA指纹图谱及其建立方法和专用引物
<130>  2015
<160>  8    
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  1
tgagtccaaaccggata                                                   17
 
<210>  2
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  2
tgagtccaaaccggaat                                                   17
 
<210>  3
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  3
tgagtcctttccggtgc                                                    17
 
<210>  4
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  4
tgagtccaaaccggtag                                                   17
                                                 
<210>  5
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  5
gactgcgtacgaattgac                                                  18
 
<210>  6
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  6
gactgcgtacgaattaac                                                  18
 
<210>  7
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  7
gactgcgtacgaattcaa                                                  18
 
<210>  8
<211>  18
<212>  DNA
<213>  人工序列
<400>  8
gactgcgtacgaattcag                                                  18
 

Claims (7)

1.一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专用引物选自以下引物对中的一对或多对：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5。
2.如权利要求1所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专用引物由序列表中的以下6对引物组成：SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.7；SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5；SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.6；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.8；SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5。
3.如权利要求1或2所述的一种获取石斛DNA指纹图谱的专用引物，其特征在于，所述专用引物获取DNA指纹图谱的石斛品种为霍山石斛和铁皮石斛。
4.一种石斛DNA指纹图谱的建立方法，该方法包括如下步骤：
步骤1，提取石斛材料的基因组DNA作为模板，用权利要求1-2中任一所述专用引物进行SRAP-PCR扩增；
步骤2，将前述步骤中得到的SRAP-PCR扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染显示DNA条带，获得石斛DNA指纹图谱。
5.一种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱由权利要求4所述的方法建立获得。
6.权利要求5所述的一种石斛DNA指纹图谱，该指纹图谱为：01100000000，01000000000，00000110101，00000100101，00010111001，10010011000，00010110001，00001101100，00000100001，00010101100，00010110000，00000101101，00001110100，00000101100，00010110100，00000100000，00010100000，00010100010，00000001000；其中数字“1”表示图谱中确定位置上存在扩增条带，“0”表示图谱中该位置上没有扩增条带存在。
7.权利要求1或2所述的任一专用引物在获取石斛DNA指纹图谱中的应用。
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