CN103194537B

CN103194537B - 一种大白菜ssr指纹图谱构建方法

Info

Publication number: CN103194537B
Application number: CN201310080186.1A
Authority: CN
Inventors: 李汝玉; 张晗; 段丽丽; 王东建; 孙加梅; 李华; 郑永胜; 王雪梅
Original assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2013-03-13
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2033-03-13
Also published as: CN103194537A

Abstract

本发明公开了一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，属于农业的大白菜育种与应用技术领域。它首先提取供试品种的DNA，然后用如序列表SEQ ID No.1～58所示的29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测或者五色荧光毛细管电泳检测构建大白菜品种的SSR指纹图谱。本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的大白菜DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于大白菜品种鉴定DNA指纹检测的方法。本发明利用毛细管电泳方法进行大白菜品种鉴定，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不受环境影响。

Description

一种大白菜SSR指纹图谱构建方法

技术领域

本发明涉及一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，属于农业的大白菜育种与应用技术领域。

背景技术

大白菜（B.campestris L.ssp.Pekinensis(Lour).Olsson，染色体组AA，2n=2x=20）起源于中国，是最具中国特色、分布最广、种植面积最大的重要蔬菜作物。大白菜在中国的种植面积约占蔬菜播种面积的9%～15%，并且先后传入日本、韩国、朝鲜等国家。由于大白菜在中国及东亚国家的蔬菜生产和消费中占有举足轻重的地位，因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。

目前我国对大白菜品种进行鉴定主要方法是按照GB/T 19557.5-2004《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南大白菜》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间测定，鉴定结果易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致代码判定结果不一致的问题。同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。

利用分子标记技术建立DNA指纹图谱（fingerprint）是鉴别品种、品系的有力工具。品种DNA指纹数据库的构建在白菜品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值，对理清我国白菜种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR等。简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微卫星（Microsatellites），是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。目前，SSR标记也已经应用于大白菜、水稻、小麦、大麦、玉米等作物的指纹图谱构建、品种鉴定和遗传多样性分析。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前大白菜品种的鉴定只能在大田里进行，易受环境影响且工作量大等一系列问题，提供一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，利用SSR指纹图谱进行品种鉴定。

本发明的目的是这样实现的：一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于：所述的荧光标记SSR引物包括29对核心SSR引物，分别是cnu_m139a、nia_m086a、nia_m098a、nia_m138a、cnu_m046a、nia_m121a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_m101a、cnu_m252a、Na10-D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_m149a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_m182a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ IDNo.1～58所示。

具体步骤如下：

（1）提取供试品种的DNA；

（2）用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增。PCR扩增采用25μL的反应体积，含dNTP 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg²⁺），MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA 10-40ng。反应程序采用TouchdownPCR：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

（3）PCR产物经电泳检测构建大白菜品种的SSR指纹图谱。

a.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记录为0/0；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。

b.五色荧光毛细管电泳检测

将6-FAM（蓝色）和HEX（绿色）荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA（黑色）和ROX（红色）荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；取1μL混合液加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后；无效等位变异记录为0/0；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱形。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。

本发明所构建的SSR指纹图谱如表3所示。

利用SSR指纹图谱进行大白菜品种鉴别；依据29对核心荧光标记SSR引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种。

本发明的有益效果是：本发明建立了快速准确、经济简便、稳定可靠的大白菜DNA指纹鉴定标准实验体系，并在此基础上开发了一种适用于大白菜品种鉴定DNA指纹检测的方法。本发明利用毛细管电泳方法进行大白菜品种鉴定，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不受环境影响。

附图说明

图1是50份大白菜品种基于29对核心SSR引物的品种聚类图。

具体实施方式

实施例1

1）DNA提取

表1 50份供试品种

采用CTAB法提取供试品种的DNA：取幼嫩组织混合样0.2g，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎。或将种子研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加入400μL，混匀样品。将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下，保温过程中震荡离心管，使样品与提取液充分混合。向离心管中加入400μL24:1氯仿-异戊醇（V/V），振荡混匀。10 000g离心10min。将上清液200μL转入另一只1.5mL离心管，加入400μL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10 000g离心1min，弃上清液，加入500μL乙醇-乙酸铵溶液（称取154.6mg乙酸铵，加入140ml无水乙醇，用去离子水定容至200mL。），6 000g离心5min收集沉淀。室温晾干，加入100μL TE（pH8.0）溶液溶解DNA，检测DNA浓度。-20℃保存。

其中，DNA提取液的配方为：分别称取20.0g十六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠放入烧杯中，然后加入40mL乙二胺四乙酸二钠盐溶液（pH8.0）、100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入800ml去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。于4℃保存。

2）核心引物的选择

本发明中核心引物的筛选确定：从我国各地区大白菜主栽品种中选择8份品种进行大白菜SSR引物的筛选，综合考虑引物的扩增情况和多态性，从大白菜基因组每个连锁群上挑选1～5对多态性高、稳定性与重复性好的引物，合计29对，作为大白菜指纹图谱构建和品种鉴定的一套核心引物。（表2）

表2 29对荧光标记SSR核心引物（其序列如序列表SEQ ID No.1～58所示）

3）利用29对核心SSR引物对供试品种进行PCR扩增。

PCR扩增采用25μL的反应体积，含每种dNTP 0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg²⁺），MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA 10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

毛细管电泳按照以下步骤进行：将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μLLIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上（ABI3730XL）。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。

f)分析毛细管电泳结果。根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0。

依据29对引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种；形成鉴定结果。比较50份品种的指纹数据，发现任两个品种间的差异位点数都大于3，说明这29对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开（表3）；利用NTSYS软件进行品种聚类，分析品种间的遗传关系，从图中可以看出大多数品种的遗传相似性系数小于0.08可以把大多数品种区别开（图1）。

表3 50份品种的指纹数据

Claims

1.一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增、电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于：所述的荧光标记SSR引物包括29对核心SSR引物，分别是cnu_m139a、nia_m086a、nia_m098a、nia_m138a、cnu_m046a、nia_m121a、cnu_m073a、cnu_m288a、cnu_m316a、cnu_m327a、nia_m101a、cnu_m252a、Na10-D09、cnu_m289a、cnu_m442a、cnu_m050a、cnu_m149a、nia_m037a、nia_m049a、cnu_m182a、cnu_m295a、cnu_m090a、cnu_m016a、cnu_m530a、 cnu_m534a、nia_m038a、nia_m022a、ENA2、nia_m035a，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID No.1～58所示；所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测或者变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

2.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测，具体为：将6-FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；取1 mL混合液加入0.1 mL LIZ500分子量内标和8.9 mL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95 ℃变性5 min，取出，立即置于碎冰上，冷却10 min以上；瞬时离心10 s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR 指纹图谱。

3.如权利要求1所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，具体为：采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，将每一位点待测样品和相应的参照品种扩增片段的带型和移动位置进行比较，根据参照品种的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR 指纹图谱。

4.如权利要求2或3所述的一种大白菜SSR指纹图谱构建方法，其特征是，用29对核心SSR引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增采用25 μL的反应体积，该反应体系含dNTP 0.25 mmol/L，正向引物、反向引物各0.4 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液，MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA 10-40 ng；反应程序采用TouchdownPCR：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；所述1×PCR缓冲液不含Mg²⁺。

5.一种大白菜品种鉴定的方法，其特征是，采用权利要求2或3的方法构建大白菜SSR指纹图谱；依据29对核心荧光标记SSR引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种。