CN105907866A - 鉴定结球叶用莴苣品种的方法 - Google Patents

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张鹏航
韩莹琰
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Abstract

本发明公开了一种鉴定结球叶用莴苣品种的方法，采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：SML026；SML022；SML021；SML015；SML013；SML002；SML001；SH86；SH66；SH49；SH43；SH42；KSL271；KSL173；KSL123；KSL115；KSL97；KSL92；KSL87；KSL51；KSL32；KSL26。用上述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱和待鉴定品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。能方便、准确的鉴定结球叶用莴苣品种。

Description

鉴定结球叶用莴苣品种的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴定结球叶用莴苣品种技术，尤其涉及一种鉴定结球叶用莴苣品种的方法。
背景技术
目前，我国国家蔬菜种质资源库收集和保存结球叶用莴苣种质资源200余份，但目前生产上使用的栽培品种多数引自国外。结球叶用莴苣是一种低投入、高收益、营养价值丰富的速生蔬菜，近年来栽培面积迅速扩大，逐渐成为人们食用的首选绿叶蔬菜之一。但是，我国结球叶用莴苣的栽培品种主要靠引进国外已有品种，具有自主知识产权的品种和类型很有限，并且在品种资源搜集、鉴定上几乎是空白。因此，需要多角度、多方法开展种质资源的创新工作，开发出品质优良的结球叶用莴苣新品种，来满足当前生产的需要。种质资源是蔬菜遗传育种和品种改良的基本材料，种质资源的鉴定和筛选是培育和改良优异品种的一项基础工作。由于不同地区之间频繁引种，使得品种名称十分混乱，同物异名和同名异物的现象非常普遍。所以，利用SSR指纹图谱技术鉴定结球叶用莴苣品种很有必要。
现阶段，对于蔬菜的种质资源鉴定，大多用的基于PCR技术的DNA标记技术，可综合为三大类：一是以分子杂交为基础的标记技术，主要是RFLP(Restriction FragmentLength Polymorphism)及VNTR(Variable number tandem repeat)；二是以PCR为基础的标记技术，如RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)、SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Regions)、STS(Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)、DAF(DNA Amplified Fingerprinting)及ERPAR(Ex-tended Random Primer Amplified Regions)等；三是酶切和PCR相结合的标记技术，主要有AFLP(Amplified ragment Length Polymorphism)和CAPS(Cleaved AmplifiedPolymorphic Sequence)。此外，还有一类新近发展起来的基于单个核苷酸多态性的DNA标记，即SNP(Simple Nucleotide Polymorphism)。随着逆转座子研究，一项基于反转录转座子的植物分子标记技术—RTN技术得到了很大的发展，主要有SSAP(Sequence-l VariationPolymorphism)、RIAP(Inverse Retrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP(Retrotransposon based Insertion Polymorphism)等5种。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用方便、结果准确的鉴定结球叶用莴苣品种的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：
(1)SML026
(2)SML022
(3)SML021
(4)SML015
(5)SML013
(6)SML002
(7)SML001
(8)SH86
(9)SH66
(10)SH49
(11)SH43
(12)SH42
(13)KSL271
(14)KSL173
(15)KSL123
(16)KSL115
(17)KSL97
(18)KSL92
(19)KSL87
(20)KSL51
(21)KSL32
(22)KSL26
用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，能方便、准确的鉴定结球叶用莴苣品种。
具体实施方式
下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。
本发明的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其较佳的具体实施方式是：
采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：
(1)SML026
(2)SML022
(3)SML021
(4)SML015
(5)SML013
(6)SML002
(7)SML001
(8)SH86
(9)SH66
(10)SH49
(11)SH43
(12)SH42
(13)KSL271
(14)KSL173
(15)KSL123
(16)KSL115
(17)KSL97
(18)KSL92
(19)KSL87
(20)KSL51
(21)KSL32
(22)KSL26
用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。
通过以下方法获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，包括以下步骤：
A、以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增；
B、将步骤A中得到的扩增产物进行毛细管电泳，分别记录品种中SSR片段的长度；
C、按照电泳的峰值图读数，有峰记为1，无峰记为0，根据(0,1)数据矩阵，构建SSR指纹图谱。
应用于品种鉴定时，将待鉴定品种的DNA用所述专用引物经PCR产物扩增，将产物对应的条带填写入相应的(0,1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与上述的SSR指纹图谱进行对比，直接获得鉴定结果。
具体实施例：
实例1、用SSR分子标记法建立结球叶用莴苣指纹图谱。
操作流程为：制备模板DNA→DNA扩增→毛细管电泳→统计分析结果。具体方法和过程如下：
1、使用改良的CTAB法提取的叶用莴苣基因组DNA：
提取的基因组DNA经Eppendorf Biophotometer测定OD260/OD280值在1.7-1.9范围内。将DNA提取液稀释成100ng/μl，取3μl DNA样品加入1μl loading buffer稀释液，在1％的琼脂糖凝胶上检测，稳压4V/cm，电泳45min。电泳结果显示，DNA主带清晰，无降解现象，RNA去除干净，可以作为模板。
2、SSR引物的设计和筛选：
在SSR分子标记实验中，不同引物组合对某一特定基因组的扩增效率是不同的。引物扩增效率的高低由它产生的多态性条带数决定。本实例对109对引物组合进行分别进行扩增，从中筛选出了22对谱带分布均匀，条带丰富，多态性较高且谱带质量较好的引物组合，可用于提供样品种质资源遗传多样性研究。这十一对引物如下：
引物对1：SML026；GGGTTCTCATTGGCTGACAT/TGTCTTCCAACCAAAACATACA(GAA)11
引物对2：SML022；GGGCCTCAAATCCTCTCTG/TGTTCTTCCCCTCTTTGGAA(ATC)13
引物对3：SML021；TTGGGAGAATTTTCATTTCCA/AGTCATCTTTTTCACCCCACA(TA)8
引物对4：SML015；TTGAGGAGGGCATTTACGTC/GAGGCGTATCTCCAAGGTGT(TGTTA)16
引物对5：SML013；TCCCATGATGGAGAGACTCA/CCCAAAAGGGAATAGCAACC(GAA) 14(CTG)5
引物对6：SML002；GTGATTGCATGCCAAATGAA/TTAGTAGCCCGCATGCTTTT(TTC)17
引物对7：SML001；CCATGGATCCTGTGTGAAGA/CACCATGTTCCACTTCCACTT(CATGAT)6
引物对8：SH86；GTCTGTGTGGTTTTGGT/TGTGGTGGAGTGTGATTT(CT)20
引物对9：SH66；GGTAGGGCAGTCAAGCAAGA/AATGATGATTTTGCCCTTGG(TC)28
引物对10：SH49；GGAGATTGAGAGGAAAA/GAGTGGAAGGGAAATAG(AG)25
引物对11：SH43；CTCTCGTTCCTTTTGTTGGTTT/TGGTAGTGGCTTCCTTGCTATT(AC)10
引物对12：SH42；GCAAGCTAAAGGGCTTTTTGT/CAGCCTGGGAATATTTACTCTGA(ATT)27
引物对13：KSL271；ACAAAGGCAAGATTGGGTCA/GCGGATATGCAGCCATAACA(ATG)12
引物对14：KSL173；ATAGTCACGACTCACGCCCA/CCATTTTCCTCTTTCTGCGA(CT)14
引物对15：KSL123；ATTGTAACTTCTGCGGGCCT/GCCTCACATGTTCTTCCCCT(ATC)13
引物对16：KSL115；CATTGCACTCCGTCATCTCC/GGGTTGATTCCGAAAGTTCC(CT)11
引物对17：KSL97；CGCAGAAAAGGGATCAGACA/TCAGAGACACTGCAAAAGGGA(CT)11
引物对18：KSL92；GGTCTCTTTCCTCTGCCCTG/TCGCGTTCTGAAGTAGCCAT(CT)20
引物对19：KSL87；GCGGGATCGATACTTACCCT/ATCATCGACGGGCTTTTCTT(CT)17
引物对20：KSL51；CCCCTACCACCACCAAAGTC/TACCAAATGACATGCACCCC(ATG)10
引物对21：KSL32；CGGGGAGCATTTAGTGTGTG/AATTTGGGGTCCGATTTGAG(CT)14
引物对22：KSL26；GGGCTTTCTCTCCTTTCCTTT/AATTTGGATCCTGTCGAGGG(TC)16
3、DNA的扩增，如下表1：
94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸45sec，循环38次；最后72℃延伸10min。4℃保温待用。
表2.SSR扩增统计结果：
4.获取结球叶用莴苣的指纹图谱：
根据扩增带的强弱，以及清晰度确定遗传变异的带，淘汰假象带。在电泳图谱中进行比较，确定单态带和多态带。选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“1”和“0”分别记录条带的有无，在同一迁移距离上有带赋值“1”，无带赋值“0”。
实例2、结球叶用莴苣的SSR指纹图谱分析与应用：
根据22对引物的扩增结果，用(0，1)法绘制得出结球叶用莴苣的指纹图谱，如表3：
表3：结球叶用莴苣的指纹图谱(部分)
应用于品种鉴定时，将待鉴定品种的DNA，用22对引物经PCR产物扩增，将产物对应的条带填写入相应的(0,1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与上述的指纹图谱(表3)进行对比，可直接获得鉴定结果。
如某一品种经上述流程得出指纹为：
0100010000100100001000100000001000100000000010000000000000001001010000001000001010000010000100000000100001000001000000000100001000000100000
将此指纹与表3提供的指纹对比，则可知此品种为GJ-31。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (3)

1.一种鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，采用SSR分子标记法对结球叶用莴苣进行品种鉴定，所述的SSR分子标记法在结球叶用莴苣多态性研究中，其专用引物如下：
(1)SML026
(2)SML022
(3)SML021
(4)SML015
(5)SML013
(6)SML002
(7)SML001
(8)SH86
(9)SH66
(10)SH49
(11)SH43
(12)SH42
(13)KSL271
(14)KSL173
(15)KSL123
(16)KSL115
(17)KSL97
(18)KSL92
(19)KSL87
(20)KSL51
(21)KSL32
(22)KSL26
用所述专用引物获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，并用所述专用引物获取待鉴定品种的指纹，将待测品种的指纹与所述的SSR指纹图谱进行对比，获得鉴定结果。
2.根据权利要求1所述的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，通过以下方法获取结球叶用莴苣SSR指纹图谱，包括以下步骤：
A、以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用所述专用引物进行PCR扩增；
B、将步骤A中得到的扩增产物进行毛细管电泳，分别记录品种中SSR片段的长度；
C、按照电泳的峰值图读数，有峰记为1，无峰记为0，根据(0,1)数据矩阵，构建SSR指纹图谱。
3.根据权利要求2所述的鉴定结球叶用莴苣品种的方法，其特征在于，应用于品种鉴定时，将待鉴定品种的DNA用所述专用引物经PCR产物扩增，将产物对应的条带填写入相应的(0,1)标记表中得出待测品种的指纹，而后将待测品种的指纹与上述的SSR指纹图谱进行对比，直接获得鉴定结果。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103194537A (zh) * 2013-03-13 2013-07-10 山东省农业科学院作物研究所 一种大白菜ssr指纹图谱构建方法

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