CN105543381B - 一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的ssr引物ssr81及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81，所述引物SSR81包括上游引物SSR81‑F和下游引物SSR81‑R，所述上游引物SSR81‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SSR81‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了一种夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记，重复性好、特异性强。该方法利用上述SSR引物，能准确、快速、便捷、有效的鉴定夏冠一号节瓜杂交种子纯度。

Description

一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81及 鉴定方法

技术领域

本发明属于杂交种子纯度鉴定技术领域，具体涉及一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81及鉴定方法。

背景技术

种子是重要的农业生产资料，种子质量优劣直接影响农业生产效果。种子纯度是衡量种子质量的重要指标，建立可靠、便捷的种子纯度检测方式，对于准确快速评价种子质量，保证种子生产者、销售者和使用者的利益具有重要意义。

“夏冠一号”节瓜是广东省农业科学院蔬菜研究所选育杂交一代节瓜品种。其杂交种生产过程中，父母本自交系按照一定比例分行种植，并与其他品种或者类型的节瓜、冬瓜保持1000M以上的隔离距离；母本植株开花前要去除母本上所有雄花，并利用昆虫等传粉媒介或者人工辅助授粉的方式，取父本雄花对母本雌花进行杂交授粉，获得杂交种子。造成杂交种子不纯的原因可能有：制种时母本田间去雄不及时或不彻底，从而造成母本自交导致的生物学混杂；田间没有做好隔离措施使其他品种的花粉混入导致的生物学混杂；收获前父本没有及时拔出或收获后晾晒加工时其他品种混入造成的机械混杂。因此在进行杂交种子销售前必须进行纯度鉴定，鉴定结果符合国家对杂交种子纯度标准的方能出售给客户。

随着分子生物学的发展，分子标记法在杂交种种子纯度鉴定中应用越来越广泛，并逐渐替代了鉴定周期长、鉴定结果易受环境影响的传统的形态鉴定法、物理化学鉴定法、生化标记鉴定法等。分子标记包括AFLP(扩增片段长度多态性)标记、RAPD(随机引物扩增多态性)标记、SRAP(相关序列扩增多态性)标记、RFLP(限制性片段长度多态性)标记等，其中SSR标记呈共显性遗传，且多态性丰富，重复性好，结果稳定可靠，且所需DNA样品量少，提取方法简便，是目前广泛应用的分子标记技术。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81，该引物能产生母本特异性标记和父本特异性标记(即共显性标记)，重复性好、特异性强。

本发明的目的还在于提供一种夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，该方法利用上述SSR引物，能准确、快速、便捷、有效的鉴定夏冠一号节瓜杂交种子纯度。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81，所述引物SSR81包括上游引物SSR81-F和下游引物SSR81-R，所述上游引物SSR81-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SSR81-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

引物SSR81的上游引物SSR81-F和下游引物SSR81-R的具体核苷酸序列分别如下：

SSR81-F：5’-GACAGAATTGGGGGTTTGTG-3’(SEQ ID NO.1)；

SSR81-R：5’-TCAACAGCAGTTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO.2)。

这组引物SSR81标记带型清晰、重复性好，经特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，分析结果得知：引物SSR81能产生181bp的母本特异性标记SSR81₁₈₁以及188bp的父本特异性标记SSR81₁₈₈。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：一种夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取节瓜子叶的基因组DNA；

(2)以节瓜子叶的基因组DNA为模板，采用上述引物SSR81进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳；

(4)对凝胶电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，其中引物SSR81能产生181bp的母本特异性标记SSR81₁₈₁以及188bp的父本特异性标记SSR81₁₈₈，根据凝胶电泳结果，计算种子纯度。

在上述夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法中：

步骤(2)中PCR扩增时，20μL的反应体系包括：1μL浓度为150ng·μL^-1的节瓜子叶的基因组DNA，2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer，1.5μL的浓度为2.5mM的dNTPs，1μL浓度为0.25mmol·L^-1的上游引物SSR81-F，1μL浓度为0.25mmol·L^-1的下游引物SSR81-R，1μL Taq酶，12.5μL ddH₂O。

步骤(2)中PCR扩增时的扩增程序为：95℃预变性3min后，94℃变性45s，68℃退火1min，72℃延伸1min，6个循环，其中退火温度每个循环降2℃；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，8个循环，其中退火温度每个循环降1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

步骤(3)中凝胶电泳采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明中的SSR引物SSR81在杂种一代中能同时产生母本特异性标记和父本特异性标记，且特异性强；

(2)本发明的方法可将”夏冠一号”节瓜杂交种子与其亲本区分开来，快速检测出杂交种子的纯度；

(3)本发明方法具有准确、快速、成本低、鉴定周期短操作简便等优点，能够代替传统杂交种子纯度鉴定的方法，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1中夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定中引物SSR81的PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中M：100bp Ladder Ⅰ分子量标准；P₁：母本(夏冠母本)，P₂：父本(夏冠父本)；F₁：商品种夏冠一号；

图2为实施例3中从遂溪所取第1-46个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图3为实施例3中从遂溪所取第47-92个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图4为实施例3中从遂溪所取第93-108个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图5为实施例3中从遂溪所取第139-169个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图6为实施例3中从遂溪所取第170-189个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图7为实施例3中从遂溪所取第190-230个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图8为实施例3中从遂溪所取第231-276个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种；

图9为实施例3中从遂溪所取第277-294个商品种“夏冠一号”样品单株，圆圈代表与母本带型一致的假杂种。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供的用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81的筛选过程如下：

根据冬瓜转录组测序结果设计的引物若干对在亲本(夏冠一号父本，夏冠一号母本)及F1(夏冠一号杂交种)间进行筛选，选出共显性差异标记条带的引物SSR81，该标记带型清晰、重复性好，序列如下所示：

SSR81-F：5’-GACAGAATTGGGGGTTTGTG-3’(SEQ ID NO.1)；

SSR81-R：5’-TCAACAGCAGTTGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO.2)。

以节瓜基因组DNA为模板，使用上述SSR引物SSR81进行PCR扩增—对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳—特异性片段(聚丙烯酰胺非变性胶)回收DNA—PCR扩增—琼脂糖胶回收—TA克隆测序后，分析结果得知：引物SSR81能产生181bp的母本特异性标记SSR81₁₈₁以及188bp的父本特异性标记SSR81₁₈₈。

实施例2

本实施例提供的夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，包括以下步骤：

(1)提取节瓜子叶的基因组DNA

实验材料为”夏冠一号”节瓜杂交实验种及其父本(夏冠一号父本)、母本(夏冠一号母本)子叶，提取子叶DNA步骤如下：

①取一片子叶放入2mL离心管中，加入液氮用研磨杵研磨，在液氮快蒸干时迅速加入800μL 2％CTAB提取液，混匀后置于65℃水浴45min(每隔10min摇匀一次)；

②静置至室温后，加入800μL的氯仿：异戊醇(24:1)，轻柔混匀，静置2min后离心，12000rmp，15min，取上清(约510μL)转移至新的1.5mL离心管；

③加入上清液1/3体积的NaAc(3mol/L)，加入上清液1.5倍体积的无水乙醇(-20℃预冷)，轻柔混匀后置于-20℃30min-1h；

④12000rmp，离心10min，弃上清；

⑤向离心管中加入75％乙醇(预冷的)洗涤DNA沉淀2次，再用无水乙醇洗1次，放在超净工作台上吹干；

⑥加入50μL TE(或ddH₂O)溶解。

(2)以节瓜子叶的基因组DNA为模板，采用实施例1中设计出的引物SSR81进行PCR扩增SSR-PCR扩增

PCR体系(20μL)

PCR扩增的程序为：95℃预变性3min后，94℃变性45s，68℃退火1min，72℃延伸1min，6个循环(退火温度每个循环降2℃)；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，8个循环(退火温度每个循环降1℃)；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳即AGE凝胶电泳检测

①将PCR产物加入4μL 6×Loading buffer，甩下后涡旋混匀；

②取2μL扩增产物用8％(质量百分含量)非变性PAGE胶电泳，180V稳压60min；

③将PAGE胶拆下，先用蒸馏水洗一遍，再用0.1％AgNO₃溶液染色10min；

④用蒸馏水洗2遍，再用2％NaOH、0.04％Na₂CO₃、0.4％甲醛显色10min，显色后用自来水洗两遍，然后在灯箱上拍照分析。

2.4扩增结果

对于夏冠一号节瓜杂交商品种引物SSR81扩增出181bp和188bp两条带；父本(夏冠一号父本)扩增出188bp的条带；母本(夏冠一号母本)扩增出181bp的条带(见图1)。

回收特异条带，送生工公司测序。181bp、188bp条带的序列如SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4所示，分别与母本、父本扩增产物的序列相符。

实施例3

采用实施例2的方法对需要鉴定纯度的夏冠一号节瓜杂交种进行田间种植和取样，样品共计294株，对其单株依次编号，提取单株DNA进行检测(见图2-9)，检测结果：杂交种子213株，母本81株，种子纯度为72.45％，与田间检测结果一致。

以上列举具体实施例对本发明进行补充说明，需要指出的是，以上实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表本发明的保护范围，其他人根据本发明的提示做出的非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于夏冠一号节瓜杂交种子纯度鉴定的SSR引物SSR81，其特征是：所述引物SSR81包括上游引物SSR81-F和下游引物SSR81-R，所述上游引物SSR81-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物SSR81-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是包括以下步骤：

(1)提取节瓜子叶的基因组DNA；

(2)以节瓜子叶的基因组DNA为模板，采用权利要求1中的引物SSR81进行PCR扩增；

(3)对PCR扩增产物进行凝胶电泳；

(4)对凝胶电泳结果进行分析，只有同时具有亲本特异性条带的单株才为真正的杂交种，缺少其中的任意一条带记为假杂种，其中引物SSR81能产生181bp的母本特异性标记SSR81₁₈₁以及188bp的父本特异性标记SSR81₁₈₈，根据凝胶电泳结果，计算种子纯度。

3.根据权利要求2所述的夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时，20μL的反应体系包括：1μL浓度为150ng·μL^-1的节瓜子叶的基因组DNA，2μL含Mg²⁺的10×PCR buffer，1.5μL的浓度为2.5mM的dNTPs，1μL浓度为0.25mmol·L^-1的上游引物SSR81-F，1μL浓度为0.25mmol·L^-1的下游引物SSR81-R，1μL Taq酶，12.5μL ddH₂O。

4.根据权利要求2所述的夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是：步骤(2)中PCR扩增时的扩增程序为：95℃预变性3min后，94℃变性45s，68℃退火1min，72℃延伸1min，6个循环，其中退火温度每个循环降2℃；94℃变性30s，58℃退火1min，72℃延伸1min，8个循环，其中退火温度每个循环降1℃；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环后，72℃终延伸7min，4℃保存。

5.根据权利要求2所述的夏冠一号节瓜杂交种子纯度的鉴定方法，其特征是：步骤(3)中凝胶电泳采用质量百分含量为8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。