CN103243158B

CN103243158B - 一种小麦ssr指纹图谱构建方法

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Publication number: CN103243158B
Application number: CN201310119954.XA
Authority: CN
Inventors: 李汝玉; 张晗; 段丽丽; 王东建; 孙加梅; 郑永胜; 王雪梅; 李华
Original assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: CROP Research Institute of Shandong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-04-08
Filing date: 2013-04-08
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2033-04-08
Also published as: CN103243158A

Abstract

本发明公开了一种小麦SSR指纹图谱构建方法，属于农业的小麦育种与应用技术领域。它首先提取供试品种的DNA，然后用如序列表SEQ ID No.1～26所示的13对基本核心SSR荧光标记引物和如序列表SEQ ID No.27～50所示的12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种DNA进行PCR扩增；PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测或者五色荧光毛细管电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱。本发明可以在实验室根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定小麦品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。

Description

一种小麦SSR指纹图谱构建方法

技术领域

本发明涉及一种小麦SSR指纹图谱构建方法，属于农业的小麦育种与应用技术领域。

背景技术

小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一。经过长期的发展，已经成为世界上分布最广、面积最大、总产最高、贸易额最多、营养价值最高的粮食作物之一。全世界有43个国家，有35%-40%的人口以小麦为主要粮食。小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素B，是一种营养丰富、经济价值较高的商品粮。因此对商用种子品种的鉴别尤为重要。

目前我国对小麦品种进行鉴定主要方法是按照GB/T19557.2《植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南小麦》进行田间测定来鉴定的。这种方法存在的主要问题是运用田间测定，鉴定结果易受环境因素的影响，也常出现不同测试人员对某些性状的认识存在偏差，导致判定结果不一致的问题，同时田间测定周期长，不能及时、快捷地为新品种侵权案件提供鉴定依据。测试性状多、工作量大，无法适用大量品种的测试需求。

利用分子标记技术建立DNA指纹图谱（fingerprint）是鉴别品种、品系的有力工具。品种DNA指纹数据库的构建在小麦品种纯度及真实性鉴定、品种权登记保护、区试及审定品种质量监控等方面具有重要应用价值，对理清我国小麦种质的亲缘关系、杂种优势群划分、种质创新及新品种选育具有重要指导意义。目前用于绘制植物DNA指纹图谱的标记技术主要有RAPD、RFLP、AFLP、SSR等。简单重复序列（Simple sequence repeat,SSR）也叫微卫星（Microsatellites），是第二代基于PCR技术的分子标记技术。与其它分子标记相比，SSR标记具有多态信息含量高、共显性遗传、技术简单、重复性好、特异性强等特点，已被广泛应用于植物遗传研究和育种实践中。

发明内容

本发明的目的在于：针对目前对大麦品种进行鉴定方法只能在大田里进行，且工作量大等一系列问题，提供一种小麦SSR指纹图谱构建方法，并利用所构建的SSR指纹图谱进行品种鉴定。

本发明的目的是这样实现的：一种小麦SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于，所述的荧光标记SSR引物包括13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物，其中，13对基本核心SSR荧光标记引物为Xgwm155-3A、Xgwm357-1A、Xgwm610-4A、Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhw129-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarc14-6B、Xcfd76-6D、Xcfa2028-7A、Xwmc73-7B，其序列依次如序列表SEQ ID No.1～26所示；12对扩展核心SSR荧光标记引物为Xcfd28-1D、Xbarc7-2B、Xgwm296-2D、Xgwm2-3A、Xcau2-4A、Xgwm495-4B、Xbarc1-5A、Xbarc4-5B、Xgdm43-5D、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D，其序列依次如序列表SEQ ID No.27～50所示。

具体步骤如下：

（1）提取供试品种样品的DNA；

（2）用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增，PCR扩增采用25μL的反应体积，含dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg²⁺），MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

（3）PCR产物经电泳检测构建小麦品种的SSR指纹图谱

a.变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，60W恒功率电泳1.5h，银染显色；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。

b.毛细管电泳

将FAM（蓝色）和HEX（绿色）荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA（黑色）和ROX（红色）荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1μL加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上；瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集。以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0；多个位点的数据整合在一起形成不同大白菜品种的SSR指纹图谱。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。

本发明所构建的SSR指纹图谱如表4所示。

利用SSR指纹图谱进行小麦品种鉴别：依据25对荧光标记引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种，形成鉴定结果。

本发明的优点在于：可以在实验室，根据SSR位点的多态性，利用PCR扩增、凝胶电泳和毛细管电泳技术鉴定小麦品种，在时间上充分提高了试验效率，具有快速、准确、操作方便等优势，并且鉴定结果不易受环境影响。

附图说明

图1是92份小麦品种基于25对核心SSR引物的品种聚类图；

图2是引物Xcfa2155-5A对部分小麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

具体实施方式

实施例1

1）DNA提取

表192份小麦品种

采用CTAB法提取供试品种样品的DNA：取幼嫩组织混合样0.2g，放入1.5mL离心管中，在液氮中研碎。或将种子研碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加入400μL，混匀样品。将离心管置于65℃金属浴或水浴锅中，保温30min后取下。向离心管中加入400μL24:1氯仿-异戊醇（V/V），振荡混匀。10000g离心10min。将上清液200μL转入另一只1.5mL离心管，加入400μL-20℃预冷无水乙醇沉淀DNA。10000g离心1min，弃上清液，加入500μL乙醇-乙酸铵溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100μLTE（pH8.0）溶液溶解DNA，检测DNA浓度。-20℃保存。

其中，DNA提取液的配方为分别称取20.0g十六烷基三乙基溴化铵和81.82g氯化钠，加入40mL乙二胺四乙酸二钠盐溶液（pH8.0）（B.1.3）、100mL1mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸溶液（pH8.0）(B.1.4)和10.0g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入800ml去离子水，65℃水浴中加热溶解，冷却后定容至1000mL。在103.4kPa（121℃）条件下灭菌20min。于4℃保存。

2）核心引物选择

通过分析引物在染色体上的分布、多态性水平、PCR扩增稳定性和扩增产物带型，选择了能够同时满足普通变性胶电泳检测和毛细管荧光检测两种技术平台的引物25对，作为小麦品种鉴定的核心引物。

表2 13对SSR基本核心引物

表3 12对SSR扩展核心引物

3）利用25对核心SSR引物对供试品种模板进行PCR扩增

PCR扩增采用25μL的反应体积，含每种dNTP0.25mmol/L，正向引物、反向引物各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0单位，1×PCR缓冲液（不含Mg²⁺），MgCl₂1.5mmol/L，样品DNA10-40ng。反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，65℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

4）毛细管电泳荧光检测

a）PCR产物样品准备

将FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍。分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合，从混合液中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上。除待测样品外，每个SSR位点还应同时包括3～4个参照品种的扩增产物。

注：不同荧光标记的扩增产物的最适稀释倍数最好通过预试验确定。

b)分析毛细管电泳结果，根据参照品种的扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小。纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小，小片段在前，大片段在后。无效等位变异记录为0/0（表4）。

依据25对引物的检测结果进行判定：品种间差异位点数≥3为不同品种；品种间差异位点数<3为近似品种，形成鉴定结果；比较92份品种的指纹数据，发现任两个品种间的差异位点数都大于3，说明这25对核心引物可以有效的把这些品种鉴别开；利用NTSYS软件进行品种聚类，分析品种间的遗传关系（图1）。

实施例2

利用25对核心引物（见表2、表3）对92份小麦供试品种（见表1）进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测。试验具体操作步骤如下：

1）DNA提取：同实施例1。

2）PCR扩增：同实施例1。

3）变性PAGE电泳

a.预电泳

将胶板安装于电泳槽上，向上槽中加入约800mL预热至65℃的0.25×TBE缓冲液，使其超过凝胶顶部约3cm，向下槽中加入800mL1×TBE缓冲液。在60W恒功率下，预电泳10～20min。

b.样品制备

在25μL PCR样品中加入10μL上样缓冲液,混匀。在水浴锅或PCR仪上95℃变性5min，取出，迅速置于碎冰上。

c.电泳

用注射器吸取缓冲液冲洗凝胶顶端几次，清除气泡和聚丙烯酰胺碎片。将鲨鱼齿梳子梳齿端插入凝胶1～2mm。每一个加样孔点入2～3μL样品。除待测样品外，还应同时加入参照品种扩增产物。在50～80W恒功率下电泳，使凝胶温度保持在约50℃。电泳约1.5～2.5h（电泳时间取决于扩增片段的大小范围）。电泳结束后，小心分开两块玻璃板，取下凝胶附着的长玻璃板准备固定。具体功率大小根据电泳槽的规格型号和实验室室温设定。

d.银染

（1）固定：将凝胶附着的长玻璃板置于塑料盒中，加入1000mL银染固定液，使固定液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动20～30min。

（2）漂洗：取出玻璃板，在去离子水中漂洗1～2次，每次2min。

（3）染色：将玻璃板置放入1000mL染色液中，使染色液没过凝胶，在摇床上轻轻晃动30min。

（4）漂洗：在去离子水中快速漂洗，时间不超过10s。

（5）显影：将玻璃板在预冷的显影液中轻轻晃动至出现清晰带纹。

（6）定影：将凝胶在固定液中定影5min。

（7）漂洗：在去离子水中漂洗1min。

e．结果记录

纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X，其中X为该位点等位变异的大小；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异。小片段在前，大片段在后。无效等位变异的大小记录为0/0。从图中可以看出引物的多态性好，能够很好的鉴别品种（图2）。

表4小麦SSR指纹图谱

表4（续）

注：表4中列标题为引物。

Claims

1.一种小麦SSR指纹图谱构建方法，包括提取供试品种DNA、用荧光标记SSR引物进行PCR扩增，电泳检测和指纹图谱构建，其特征在于，所述的荧光标记SSR引物包括13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物，其中，13对基本核心SSR荧光标记引物为Xgwm155-3A、Xgwm357-1A、Xgwm610-4A、Xgwm513-4B、Xcfd84-4D、Xcfa2155-5A、Xbhw129-5B、Xcfd8-5D、Xgwm570-6A、Xbarc14-6B、Xcfd76-6D、Xcfa2028-7A、Xwmc73-7B，其序列依次如序列表SEQ ID No.1～26所示；12对扩展核心SSR荧光标记引物为Xcfd28-1D、Xbarc7-2B、Xgwm296-2D、Xgwm2-3A、Xcau2-4A、Xgwm495-4B、Xbarc1-5A、Xbarc4-5B、Xgdm43-5D、Xgwm617-6A、Xgwm219-6B、Xcfd33-6D，其序列依次如序列表SEQ ID No.27～50所示；所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测。

2.如权利要求1所述的一种小麦SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述电泳检测为五色荧光毛细管电泳检测，具体为：将FAM和HEX荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，TAMRA和ROX荧光标记的PCR产物稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液，从混合液中吸取1微升加入0.1 微升LIZ500分子量内标和8.9微升去离子甲酰胺加入到DNA分析仪专用深孔板孔中；然后将其在PCR仪上95 ℃变性5 min，取出，立即置于碎冰上，冷却10 min以上；瞬时离心10 s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳检测，用GENEMAPPER进行图像分析和数据采集；以pBR322DNA/MspI为DNA分子量标准，纯合位点的等位变异大小数据记录为X/X；杂合位点的等位变异数据记录为X/Y，多个位点的数据整合在一起形成不同小麦品种的SSR 指纹图谱。

3.如权利要求2所述的一种小麦SSR指纹图谱构建方法，其特征是，所述用13对基本核心SSR荧光标记引物和12对扩展核心SSR荧光标记引物分别对供试品种模板DNA进行PCR扩增；PCR扩增采用25微升的反应体系，含dNTP 0.25 mmol/L、正向引物0.4 微摩尔/升、反向引物0.4 微摩尔/升、Taq DNA聚合酶1.0单位、不含Mg²⁺的1×PCR缓冲液、MgCl₂1.5mmol/L和样品DNA 10-40 ng；反应程序为：94℃预变性4 min；94℃变性45 s，65℃退火45 s，72℃延伸45 s，每循环降1℃，共15个循环；94℃变性45 s，50℃退火30 s，72℃延伸45 s，共30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。