CN104846088B - 一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法 - Google Patents

一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法，包括如下步骤：将同一品种的水稻以阵列的形式进行种植，其中任一株的水稻标记为R a C b ；当水稻生长到孕穗期时，取同一行中每株水稻的叶片组织，再取同一列中每株水稻的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA；进行SSR‑PCR扩增得到扩增产物，再进行电泳分离和染色；根据扩增产物的带型，将2对或2对以上SSR引物扩增得到异型带的第a行和第b列的交叉点确定为疑似异型株；再根据混合样品在同一引物上异型带大小或者根据交叉点对应单株的SSR指纹图谱以判定真正异型株。本发明比以表型性状为基础的水稻品种一致性测试更简便、快速，减少工作量，提高效率，降低成本。

Description

一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法
技术领域
本发明涉及品种检测技术领域，尤其涉及一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法。
背景技术
品种纯度是衡量品种质量的一个重要指标，指品种在特征特性方面典型一致的程度，即具有本品种典型特征的植株数占供检本作物样品植株数的百分率。其与品种DUS测试中的一致性测定中的异形株率表示法相一致。随着分子标记技术研究的迅猛发展，DNA检测方法在品种纯度鉴定中已经得到广泛应用。国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT测试指南草案中将SSR简单序列重复标记(SSR标记)和单核苷酸多态性标记(SNP标记)推荐为适合构建品种指纹图谱数据库的两项技术，并认为SSR标记是目前最为成熟的技术。我国DUS测试体系于2009年启动了“DUS测试品种、信息DNA测试技术研究”项目，完成了包括水稻在内的14种农业植物品种DNA指纹图谱鉴定技术和数据采集研究。
毫无疑问，SSR及其他分子标记在品种鉴定和DUS测试的近似品种筛选方面较常规的形态学筛选有着明显优势。然而，由于当前SSR及其他分子标记是对单株或单粒种子进行鉴定，与品种群体形态学观测相比，并无明显优势。以水稻为例，建立在400株单株样本上的一致性判定对于分子标记检测来说，其工作量、效率和成本都是难以接受的。因此，亟需建立一种高通量快速的分子标记检测方法，以解决当前品种纯度和一致性分子检测所存在的工作量大、效率低和成本高等问题。
而二维DNA混合取样方法首次见于2002年在杂交水稻亲本特异SSR引物对相应亲本种子的DNA混合样本进行扩增，根据亲本特征指纹条带对混合样本的遗传纯度进行测定中。到现在为止，还没有一种利用常规SSR引物，应用二维DNA混合取样法进行常规水稻品种纯度和一致性快速鉴定的方法。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明的主要目的是克服当前品种纯度和一致性鉴定中，利用SSR标记单株测定方法工作量大、成本高和效率低的问题，提供一种快速、简便和准确检测常规水稻品种纯度和一致性的方法。
本发明提出的一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法，包括如下步骤：
S1、将同一品种的水稻以阵列的形式进行种植，共有i行依次标记为Ra，共有i列依次标记为Cb，a＝1,2,3,…i，b＝1,2,3,…i，i取正整数，其中任一株的水稻标记为RaCb；
S2、当水稻生长到孕穗期时，取相同重量的第a行中每株水稻的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；再取相同重量的第b列中每株水稻的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb；
S3、将DNAa和DNAb分别进行SSR-PCR扩增得到扩增产物a和扩增产物b，将扩增产物a进行电泳分离和染色，将扩增产物b进行电泳分离和染色；
S4、根据扩增产物a和扩增产物b的带型，将2对或2对以上SSR引物扩增得到异型带的第a行和第b列的交叉点确定为疑似异型株；再根据混合样品在同一引物上异型带大小或者根据交叉点对应单株的SSR指纹图谱以判定真正异型株。
优选地，S1中，i＝10。
优选地，S2中，当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb。
本发明的技术方案在保持目前SSR分子标记方法的DNA提取、PCR扩增、电泳、染色、等位基因条带分析不变的前提下，利用常规水稻品种的各单株按阵列定位编号后进行种植。在水稻孕穗期时，将同行i个单株和同列i个单株剪取每个单株第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，等量混合后，应用CTAB法提取DNA，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行PCR扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。根据SSR扩增产物的带型，将2对或2对以上SSR引物扩增得到异型带的行和列的交叉点确定为疑似异型株，根据混合样品在同一引物上异型带大小或者根据交叉点对应单株的SSR指纹图谱确定真正异型株。
以100个样本(10×10)为例，这种测定方法与传统SSR标记方法相比，原本需进行100次样品的DNA提取以及PCR扩增反应可缩减为20次，节约了80％的时间、人力和资金。
本发明可用2i个混合样品代表i2个单样，直观地根据12个常用SSR引物对常规水稻进行标记，以此判断异型株，避免了DUS形态学测试方法周期长、环境因子影响大等弊端，也克服了当前SSR标记单株测定方法成本高、工作量大、效率低等问题，最终达到常规水稻新品种纯度和一致性的快速、简便和准确测定的目的。
本发明的有益效果具体表现在以下四点：
1、本发明将同行或同列植株叶片组织等质量混合后提取DNA，以此DNA为模板进行SSR标记，与前人研究的以单株DNA为模板进行SSR标记有区别；
2、本发明使用的是经过反复验证的可成功用于水稻品种特异性鉴定的SSR引物，研究对象是常规水稻品种，与前人研究的采用杂交水稻亲本系特异引物对相应亲本进行二维DNA混合取样的SSR标记方法在使用的引物上有区别，可应用于水稻常规稻和杂交稻亲本品种的纯度和一致性判定；
3、本发明将2对或2对以上SSR引物扩增得到异型带的行和列的交叉点确定为疑似异型株，其检测结果与基于表型性状的常规检测结果吻合度达99％以上，可用于常规水稻品种纯度和一致性测试，与前人研究的使用二维DNA混合取样的SSR标记方法检测种子遗传纯度有区别，前者与常规形态学测试相关联，后者代表的是DNA水平上的遗传纯度；
4、本发明根据混合DNA样品在同一引物上异型带大小，或者基于交叉点对应单株SSR指纹图谱对疑似异型株进行排查，与前人相关研究中仅使用单株SSR指纹图谱来排查疑似异型株相区别。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
将水稻常规品种楚粳27的植株按10行×10列种植，对各单株按行列定位编号；当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。具体扩增引物如下：
对SSR扩增产物进行分析后发现：引物RM72、RM336和RM471在第6行(R6)及第9列(C9)上扩增到异型条带；R19在第2行(R2)及第3列(C3)上扩增到异型条带；RM85、RM219和RM71在第2行(R2)、第6行(R6)、第3列(C3)及第9列(C9)上扩增到异型条带；即初步将具异型带的行和列交叉点R2C3、R2C9、R6C3和R6C9确定为疑似异型株。
进一步分析发现，第2行(R2)、第9列(C9)、第6行(R6)和第3列(C3)在同一对引物RM85和RM71上扩增后得到的异型带带型不同，故可确定交叉点R2C9和R6C3上的植株为非异型株。
除对异型带大小进行分析外，提取交叉点R2C3、R2C9、R6C3和R6C9上对应单株(疑似异型株)的DNA，SSR标记后同样得出R2C9和R6C3为非异型株，R2C3和R6C9为异型株。
而应用常规DUS测试方法对田间植株进行测试，同样得到R2C3和R6C9为异型株的结论。
实施例二
将水稻常规品种岫粳12的植株按10行×10列种植，对各单株按行列定位编号；当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。
对SSR扩增产物进行分析后发现，引物RM583和RM19在第5行(R5)及第1列(C1)上扩增到异型条带；RM85、RM72和RM311在第7行(R7)及第6列(C6)上扩增到异型条带；RM71和RM471在第5行(R5)、第7行(R7)、第1列(C1)及第6列(C6)上扩增到异型条带；即初步将具异型带的行和列交叉点R5C1、R5C6、R7C1和R7C6确定为疑似异型株。
进一步分析发现，第5行(R5)和第6列(C6)，以及第7行(R7)和第1列(C1)在同一对引物RM71和RM471上扩增后得到的异型带带型不同，故可确定交叉点R5C6和R7C1上的植株为非异型株。
除对异型带大小进行分析外，提取交叉点R5C1、R5C6、R7C1和R7C6上对应单株(疑似异型株)的DNA，SSR标记后同样得出R5C6和R7C1为非异型株，R5C1和R7C6为异型株。
而应用常规DUS测试方法对田间植株进行测试，同样得到R5C1和R7C6为异型株的结论。
实施例三
将水稻常规品种云粳优1号的植株按10行×10列种植，对各单株按行列定位编号；当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。
对SSR扩增产物进行分析后发现，引物RM71、RM471和RM336在第8行(R8)及第4列(C4)上扩增到异型条带；即初步将具异型带的行和列交叉点R8C4确定为疑似异型株。
提取交叉点R8C4上对应单株(疑似异型株)的DNA，SSR标记后得出R8C4为异型株。
而应用常规DUS测试方法对田间植株进行测试，同样得到R8C4为异型株的结论。
实施例四
将水稻常规品种滇屯502的植株按10行×10列种植，对各单株按行列定位编号；当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。
对SSR扩增产物进行分析后发现，引物RM71、RM274、RM219和RM311在第3行(R3)及第7列(C7)上扩增到异型条带；即初步将具异型带的行和列交叉点R3C7确定为疑似异型株。
提取交叉点R3C7上对应单株(疑似异型株)的DNA，SSR标记后得出R3C7为异型株。
应用常规DUS测试方法对田间植株进行测试，同样得到R3C7为异型株的结论。
实施例五
将水稻常规品种滇陇201的植株按10行×10列种植，对各单株按行列定位编号；当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb，应用CTAB法提取DNA，应用农业行业标准《水稻品种鉴定SSR标记法》(NY/T 1433-2014)中公布的A组12个SSR标记对混合提取得到的DNA进行扩增，并对扩增产物进行电泳和染色。
对SSR扩增产物进行分析后发现，引物RM583、RM471、RM274、RM336和RM311在第9行(R9)及第3列(C3)上扩增到异型条带；即初步将具异型带的行和列交叉点R9C3确定为疑似异型株。
提取交叉点R9C3上对应单株(疑似异型株)的DNA，SSR标记后得出R9C3为异型株。
应用常规DUS测试方法对田间植株进行测试，同样得到R9C3为异型株的结论。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种检测常规水稻品种纯度和一致性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将同一品种的水稻以阵列的形式进行种植，共有i行依次标记为Ra，共有i列依次标记为Cb，a＝1,2,3,…i，b＝1,2,3,…i，i取正整数，其中任一株的水稻标记为RaCb；
S2、当水稻生长到孕穗期时，取相同重量的第a行中每株水稻的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；再取相同重量的第b列中每株水稻的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb；
S3、将DNAa和DNAb分别进行SSR-PCR扩增得到扩增产物a和扩增产物b，将扩增产物a进行电泳分离和染色，将扩增产物b进行电泳分离和染色；
S4、根据扩增产物a和扩增产物b的带型，将2对或2对以上SSR引物扩增得到异型带的第a行和第b列的交叉点确定为疑似异型株；再根据混合样品在同一引物上异型带大小或者根据交叉点对应单株的SSR指纹图谱以判定真正异型株；
所述S1中，i＝10；
所述S2中，当水稻生长到孕穗期时，剪取第a行中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAa；剪取第b列中每株水稻的第一叶中段的长、宽均为1cm的叶片组织，混合后按照常规的CTAB法提取DNA，记为DNAb；
所述S3中，扩增引物如下：
编号 引物 引物序列(5’→3’) A01 RM583 正向：agatccatccctgtggagag反向：gcgaactcgcgttgtaatc A02 RM71 正向：ctagaggcgaaaacgagatg反向：gggtgggcgaggtaataatg A03 RM85 正向：ccaaagatgaaacctggattg反向：gcacaaggtgagcagtcc A04 RM471 正向：acgcacaagcagatgatgag反向：gggagaagacgaatgtttgc A05 RM274 正向：cctcgcttatgagagcttcg反向：cttctccatcactcccatgg A06 RM190 正向：ctttgtctatctcaagacac反向：ttgcagatgttcttcctgatg A07 RM336 正向：cttacagagaaacggcatcg反向：gctggtttgtttcaggttcg A08 RM72 正向：ccggcgataaaacaatgag反向：gcatcggtcctaactaaggg A09 RM219 正向：cgtcggatgatgtaaagcct反向：catatcggcattcgcctg A10 RM311 正向：tggtagtataggtactaaacat反向：tcctatacacatacaaacatac A11 RM209 正向：atatgagttgctgtcgtgcg反向：caacttgcatcctcccctcc A12 RM19 正向：caaaaacagagcagatgac反向：ctcaagatggacgccaaga
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