CN107180165B - 一种建立云瑞系列玉米品种dna分子标签的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，应用于品种分子鉴定及品种管理。其特征在于筛选鉴别云瑞系列玉米品种的4对核心引物和优化的PCR反应体系，进行品种DNA信息的数字化编码赋值，形成二维码表述，并标识于商品种子包装上，用于玉米优良品种种子的防伪和溯源。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种云瑞系列玉米品种DNA分子标签的建立，应用于品种分子鉴定及品种管理。
背景技术
云南隶属西南，属于我国西南山地玉米种植区，虽然云南省不是我国玉米主产省份，但拥有得天独厚的自然环境及气候资源，为玉米种质资源的选择提供了更多的可能性。云瑞系列新品种(系)是由云南省农业科学院选育的一系列在云南省最具代表性的玉米品种(系)，具有产量高、抗病、抗逆性强、品质优、综合性状良好等特点，社会效益和经济效益显著。该系列品种已在我国云南、四川、贵州、广西等周边省区累计推广4000多万亩。为广大农户所喜爱。
随着我国育种水平的不断提升，新育成品种不断涌现，但“品种同质化”现象也日趋严重，市场上“同源不同名”、“套牌品种”等现象屡见不鲜，对我国品种管理造成了很大麻烦，在打击原创育种的同时也给国家和农民利益造成很大的损害。因此，要解决这一难题，需建立起一种简便、快速、准确的品种识别及科学的种子管理方法。品种识别及科学的种子管理需要达到唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性的要求。
品种DNA分子标签即品种DNA身份信息标签，可作为品种特异识别的一个标准，是品种数字化管理的核心技术之一。
发明内容
为了能够准确、快速、方便的识别云瑞系列玉米品种，本发明提供一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法。
本发明的技术方案如下：
1.一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，包括(1)云瑞系列玉米品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集、(6)云瑞系列玉米品种DNA分子标签制作，在所述(2)PCR扩增中每一个云瑞系列玉米品种提取的基因组DNA，分别用引物bnlg1191、bnlg1940k7、umc2007y4、bnlg2305k4进行扩增，所述的引物bnlg1191由bnlg1191正向引物和bnlg1191反向引物组成，所述的bnlg1191正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，bnlg1191反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物bnlg1940k7由bnlg1940k7正向引物和bnlg1940k7反向引物组成，所述bnlg1940k7正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，bnlg1940k7反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述引物umc2007y4由umc2007y4正向引物和umc2007y4反向引物组成，所述umc2007y4正向引物的碱基序列如SEQID NO：5所示，umc2007y4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物bnlg2305k4由bnlg2305k4正向引物和bnlg2305k4反向引物组成，所述bnlg2305k4正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，bnlg2305k4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；
在所述(4)DNA指纹数据的获得中每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云瑞系列玉米品种4个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物bnlg1191、引物bnlg1940k7、引物umc2007y4、引物bnlg2305k4的引物顺序排列；
在所述(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中每一个云瑞系列玉米品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、单元识别代码、审定区域和审定的年份，所述的单元识别代码是用1、2、3……自然数中的任意数表示，且不同的云瑞系列玉米品种的单元识别代码均不相同；
所述(6)云瑞系列玉米品种DNA分子标签制作是将同一云瑞系列玉米品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
2.根据技术方案1所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，步骤(2)PCR扩增的反应体系为：10μL的反应体积，其中1μL 10×PCR反应缓冲液，0.6μL 25mmol/L MgCl2，0.8μL 2.5mmol/L dNTP溶液，0.25μL5μmol/L正向引物，0.25μL 5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，5.85μL超纯水，1μL样品DNA；PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延45min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
3.根据技术方案1或2所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，在步骤(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称。
4.根据技术方案3所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，在步骤(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括追溯网址。
5.根据技术方案1或2所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法构建的云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
6.根据技术方案3所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法构建的云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
7.根据技术方案4所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法构建的云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
与现有技术相比，本发明的有益效益：
1、本发明提出了4对鉴别云瑞系列玉米品种的特异性引物，实现了以广泛基因组覆盖度的最少引物鉴定云瑞系列玉米品种，能够用最少的引物构建所有云瑞系列玉米品种的DNA分子标签，减少了繁复的工作量和高昂的检测成本，能够把云瑞系列玉米品种与其它云南高原玉米品种鉴别开，同时还可以把云瑞系列玉米品种一一区分开。
2、本发明实现了云瑞系列玉米品种和其种子的双重防伪，达到品种识别及科学的种子管理的唯一性、可识别(鉴别)性、可追溯性,标识于商品种子包装上，用于云瑞系列玉米品种种子的防伪和溯源的一种信息化管理技术的关键技术。
3、本发明优化了PCR反应体系技术参数，现有PCR扩增体系并不适用于云瑞系列玉米品种，扩增出的条带不清晰甚至没有条带，本发明优化后的PCR反应体系能够抑制非特异性扩增，增加目的DNA产物的产率，使得云瑞系列玉米品种的扩增条带清晰可见，更易于胶片的观察和条带统计。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是bnlg1191正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是bnlg1191反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是bnlg1940k7正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是bnlg1940k7反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是umc2007y4正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是umc2007y4反向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：7所示的是bnlg2305k4正向引物的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：8所示的是bnlg2305k4反向引物的碱基序列。
附图说明
图1是实施例1采用本发明方法构建的云瑞系列云瑞508玉米品种DNA分子标签。
具体实施方式
术语：
追溯网址：是指云瑞系列玉米品种的生产经营者的网址。
本发明针对云瑞系列玉米品种，选取多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物作为核心引物。采用200个不同遗传背景的云南玉米品种对40余对玉米SSR引物进行筛选，筛选出4对多态性高、区分度好、数据容易统计、扩增重复性好、引物位点在染色体上均匀分布的SSR引物。30对引物对200个云南玉米品种进行扩增检测，得到DNA指纹图谱，通过数据分析确定9个云瑞系列玉米品种的指纹图谱进行分析，最后确定4对引物作为核心引物鉴别云瑞系列玉米品种。玉米为二倍体，DNA指纹数据以4个位点的等位变异片段大小数据表示，DNA指纹数据通毛细管荧光电泳读取。
表1 用于构建云瑞系列玉米品种DNA分子标签的引物信息
实例1 建立云瑞系列玉米品种云瑞508(滇审玉米2015036号)玉米品种DNA分子标签的方法
(1)云瑞系列玉米品种基因组DNA提取：
取云瑞508叶片约200-300mg置于2.0mL离心管，加液氮充分研磨。每管加入700μL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴60min并2-3颠倒混匀。每管加入等体积的三氯甲烷和异戊醇的混合液，三氯甲烷：异戊醇的体积比为24：1，充分混合后静置10min，在12,000rpm离心15min。吸取上清液转移至一新管，加入等体积0℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置30min后在4℃、12,000rpm离心10min，弃上清液，加入70％v/v乙醇，旋转2-3次后弃去乙醇溶液，并倒立于垫有滤纸的实验台上，室温放置10min以上。加入100μL超纯水1或00μL TE缓冲液，充分溶解后得基因组DNA样品，备用。
CTAB提取液：81.7g氯化钠和20.0g CTAB溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl 100mL，0.5mol/L EDTA 40mL，定容至1000mL，4℃贮存。
(2)PCR扩增
取步骤(1)获得的基因组DNA样品进行扩增，PCR扩增反应体系为：10μL的反应体积，其中，1μL 10×PCR反应缓冲液、0.6μL 25mmol/L MgCl2、0.8μL 2.5mmol/L dNTP溶液、0.25μL 5μmol/L正向引物，0.25μL 5μmol/L反向引物(各引物对合成时用荧光基团修饰)，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，5.85μL超纯水，1μL样品DNA。
PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延45min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
分别用引物bnlg1191、bnlg1940k7、umc2007y4、bnlg2305k4进行扩增，所述的引物bnlg1191由bnlg1191正向引物和bnlg1191反向引物组成，所述的bnlg1191正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，bnlg1191反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物bnlg1940k7由bnlg1940k7正向引物和bnlg1940k7反向引物组成，所述bnlg1940k7正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，bnlg1940k7反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述引物umc2007y4由umc2007y4正向引物和umc2007y4反向引物组成，所述umc2007y4正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，umc2007y4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物bnlg2305k4由bnlg2305k4正向引物和bnlg2305k4反向引物组成，所述bnlg2305k4正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，bnlg2305k4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；
(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测
将荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，分别从中吸取1μL加入到DNA分析仪专用深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将深孔板在PCR仪上95℃变性5min，取出，立即置于碎冰上，冷却10min以上。瞬时1000rpm离心10s后置放到DNA分析仪上进行毛细管电泳。对采集的数据采用GeneMapperV3.2数据分析软件进行分析，读出每个位点每份样品的等位变异大小数据。
(4)DNA指纹数据的获得
每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云瑞系列玉米品种在4个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物bnlg1191、引物bnlg1940k7、引物umc2007y4、引物bnlg2305k4的引物顺序排列；
云瑞508在4个位点上扩增出的片段大小(bp)分别为(按上述引物顺序排列)：
189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278，即为云瑞508的DNA指纹数据为：189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278。
分子标记数据为可替换或扩展项，有多态性更好的位点可以替换或补充。
(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集
云瑞508品种的基本商品信息数据如下：
作物种类：玉米
品种植物学类型：玉米
品种繁殖类型：常规种
品种名称：云瑞508
单元识别代码：1
审定区域和审定的年份：云南，2015年。
(6)云瑞系列玉米品种DNA分子标签制作
将步骤(4)获得的云瑞508的DNA指纹数据和步骤(5)采集的云瑞508品种的基本商品信息数据输入微微二维码生成器生成二维码图形即为云瑞508品种DNA分子标签，该品种DNA分子标签实现了使用者用普通设备(手机)快速识别种子真伪。
云瑞508玉米品种DNA分子标签的全部信息如下：
作物种类：玉米
品种植物学类型：玉米
品种繁殖类型：常规种
品种名称：云瑞508
单元识别代码：1
审定区域和审定的年份：云南，2015年。
DNA指纹数据：189/189、196/196、348/348、360/360、258/258、264/264、278/278。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所
<120> 一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法
<130> /
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
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<213> Artificial
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cgtttaagaa cggttgattg cattcc 26
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cgtcttgtct ccgtccgtgt g 21
Claims (5)
1.一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，包括(1)云瑞系列玉米品种基因组DNA提取、(2)PCR扩增、(3)PCR产物的毛细管电泳荧光检测、(4)DNA指纹数据的获得、(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集、(6)云瑞系列玉米品种DNA分子标签制作，其特征在于：在所述(2)PCR扩增中每一个云瑞系列玉米品种提取的基因组DNA，分别用引物bnlg1191、bnlg1940k7、umc2007y4、bnlg2305k4进行扩增，所述的引物bnlg1191由bnlg1191正向引物和bnlg1191反向引物组成，所述的bnlg1191正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：1所示，bnlg1191反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述引物bnlg1940k7由bnlg1940k7正向引物和bnlg1940k7反向引物组成，所述bnlg1940k7正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：3所示，bnlg1940k7反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；所述引物umc2007y4由umc2007y4正向引物和umc2007y4反向引物组成，所述umc2007y4正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，umc2007y4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：6所示；所述引物bnlg2305k4由bnlg2305k4正向引物和bnlg2305k4反向引物组成，所述bnlg2305k4正向引物的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，bnlg2305k4反向引物的碱基序列如SEQ ID NO：8所示；
在所述(4)DNA指纹数据的获得中每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据的获得是根据毛细管荧光电泳读出的该云瑞系列玉米品种4个位点的等位变异片段大小数据，纯合位点的等位变异记录为X/X，以X/X的形式表示其DNA指纹数据，杂合位点的等位变异记录为X/Y，以X/Y的形式表示其DNA指纹数据，其中X、Y为该位点上两个不同的等位变异片段大小数据，小片段在前，大片段在后，以两个片段大小记录；每一个云瑞系列玉米品种的DNA指纹数据X/Y或X/Y依次按引物bnlg1191、引物bnlg1940k7、引物umc2007y4、引物bnlg2305k4的引物顺序排列；
在所述(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中每一个云瑞系列玉米品种所采集的基本商品信息数据包括作物种类、品种植物学类型、品种繁殖类型、品种名称、单元识别代码、审定区域和审定的年份，所述的单元识别代码是用1、2、3……自然数中的任意数表示，且不同的云瑞系列玉米品种的单元识别代码均不相同；
所述步骤(6)云瑞系列玉米品种DNA分子标签制作是将同一云瑞系列玉米品种在步骤(4)获得的DNA指纹数据和在步骤(5)所采集的基本商品信息数据输入二维码生成器生成二维码图形即为云瑞系列玉米品种DNA分子标签；
步骤(2)PCR扩增的反应体系为：10μL的反应体积，其中1μL 10×PCR反应缓冲液，0.6μL25mmol/L MgCl2，0.8μL 2.5mmol/L dNTP溶液，0.25μL 5μmol/L正向引物，0.25μL 5μmol/L反向引物，0.25μL 2U/μL Taq DNA聚合酶，5.85μL超纯水，1μL样品DNA；PCR扩增的反应程序：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性40s，60℃退火35s，72℃延45min，共30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，其特征在于：步骤(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括生产经营者名称。
3.根据权利要求2所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法，其特征在于：步骤(5)云瑞系列玉米品种基本商品信息数据的采集中所采集的基本商品信息数据还包括追溯网址。
4.根据权利要求1或2所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法构建的云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
5.根据权利要求3所述的一种建立云瑞系列玉米品种DNA分子标签的方法构建的云瑞系列玉米品种DNA分子标签。
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