CN101921866A - 一种利用ssr核心引物鉴定棉花品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用SSR标记进行棉花品种鉴定的方法，属于生物技术领域。利用32份国家和山东省已经审定的棉花品种作为样本材料，对棉花分子标记数据库中已经公布的2000对SSR引物进行多态性筛选，最终确立了11对引物为棉花品种鉴定的首选核心引物，11对首选核心引物理论上可以区分419904个品种，且出现指纹图谱相同的概率为2.38×10^-6。利用11对核心引物构建了32份审定品种的DNA指纹数据库，并利用该数据库对匿名取样品中A和山东省2009年25份区试品系真实性进行了指纹鉴定，其鉴定结果与田间试验结果完全一致。本发明所建立的SSR-DNA指纹技术可快速、准确的鉴定棉花品种。

Description

一种利用SSR核心引物鉴定棉花品种的方法

(一)技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种利用SSR(简单重复序列，SimpleSequence Repeat，简称SSR)分子标记鉴定棉花新品种的方法。

(二)背景技术

准确、快速进行农作物品种的鉴定，对于农作物品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷等方面均有重要作用。作物品种鉴定方法可分为形态学鉴定、蛋白质指纹技术和DNA(脱氧核糖核酸，Deoxyribonucleic acid，简称DNA)指纹技术三个主要鉴定方法。

形态学鉴定方法简便、经济，但存在周期长、费工费时，调查性状受栽培条件及环境因素影响，人为观察误差较大等缺陷。而且检测结果相对滞后，难以及时监控市场上的种子质量问题和解决品种侵权等纠纷。并且随着农作物品种遗传基础狭窄，仅仅利用传统的形态学方法进行农作物品种鉴定也愈来愈困难。

蛋白质是基因表达的产物，品种间的遗传差异形成蛋白质的多态性，通过电泳技术得到多态性的蛋白质指纹图谱，即蛋白质指纹鉴定技术。由于直接测定的是蛋白质，具有快速、准确性高、重复性好的优点。1991年，国际种子检验协会把蛋白质电泳方法正式定为标准的品种鉴定方法，从而使蛋白质指纹鉴定技术在品种真实性鉴定和种子纯度检验上占有重要地位。根据蛋白质的特性，可将检验方法分为同工酶电泳和种子贮藏蛋白电泳两大类，然而，同工酶分析结果常常因为所选择的酶多少和种类不同存在偏差。此外，作为基因表达的最后产物，同工酶不能完全显示品种间的多态性，对于亲缘关系比较密切的自交系及其杂交种难以鉴定。蛋白质是基因表达的直接产物，具有组织特异性、可利用数量少、多态性低的特点，因而对亲缘关系较近的品种难以鉴别。

DNA指纹技术是指能够反映生物个体或种群间基因组中DNA位点差异的一种分子生物学技术。目前，DNA分子标记技术已经发展到数十种，主要可分为以下四大类：第一类是以Southern杂交为基础的分子标记技术，如限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，简称RFLP)。第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)为基础的分子标记技术。它又分为两类，一类是使用随机引物进行扩增，主要指随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphic DNA，简称RAPD)。另一类是采用特定引物进行扩增，主要有序列特异性扩增区(Sequence characterized amplifiedregion，简称SCAR)、序列标记位点(sequence-tagged site，简称STS)、SSR。第三类是基于PCR与酶切相结合的DNA分子标记技术。它又分为两类，一类是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增，如扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment length polymorphism，简称AFLP)。另一类是先扩增，再酶切扩增片段，检测酶切片段的长度多态性，如酶切扩增多态性序列(CleavedAmplified Polymorphism Sequences，简称CAPS)。第四类是基于单核甘酸多态性的DNA分子标记技术，如单核甘酸多态性(Single-nucleotide polymorphism，简称SNP)。它们具有直接以DNA的形式表现，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；数量极多，遍布整个基因组；多态性高，无需人为创造等位变异；表现为中性，不影响目的性状的表达等优点。国际植物品种权保护组织(The International Union for the Protection of New Varieties of Plants，简称UPOV)在2005年在生物化学和分子生物学技术(Biochemical and MolecularTechniques，简称BMT)测试指南草案中(Guidelines(proj.3)，3-6)，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR和SNP，其中SSR标记技术比较成熟。

SSR是基于PCR技术的分子标记，具有以下5个优点：(1)以孟德尔方式遗传，呈共显性；(2)数量丰富，覆盖整个染色体组；(3)每个位点均有许多等位形式，多态性丰富，信息含量高；(3)利用PCR技术分析，对DNA数量及质量要求不高；(4)实验程序简单，结果重复性好；(5)每个位点由引物序列顺序决定，便于不同实验室相互交流合作。目前已经利用SSR标记构建马铃薯、玉米、水稻、小麦的DNA指纹库(Moisan等，2005 Potato Research，48(2-3)：191-200；王风格等，2007，分子植物育种，5(1)：128-132；程本义等，2008，杂交水稻，18(5)：319-320；李根英等，2006，作物学报，32(12)：1771-1778)，在我国以SSR标记为基础的玉米和水稻的品种鉴定DNA指纹技术已经形成国家标准(NYT 1432-2007《玉米品种鉴定DNA指纹方法》和NYT 1433-2007《水稻品种鉴定DNA指纹方法》)。但在我国，目前棉花品种的鉴别仍然是形态学结合蛋白质指纹技术鉴定方法，因此急需利用SSR核心引物构建棉花品种DNA指纹数据库，它在棉花区试品系的鉴定、品种保护、假种辨别、产权纠纷等领域具有广阔的应用前景。

(三)发明内容

本发明以32份国家和山东省已经审定的棉花品种作为样本材料，利用棉花分子标记数据库(Cotton Marker Database，简称CMD)中已经公布的2000对SSR引物进行多态性筛选，以筛选出适合棉花品种鉴定的SSR核心引物，构建棉花品种的指纹数据，对匿名取样品种和2009年参加山东省区试的品系进行真实性鉴定。

32份国家和山东省已经审定的棉花品种，采用SDS(十二烷基磺酸钠，Sodium dodeyl fulfate，简称SDS)法提取棉花干种子的DNA，2000对SSR引物对32份棉花品种DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物采用6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denaturing Polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)作为检测平台，统计每个引物的多态性信息量(Polymorphism information Content，简称PIC)，每对SSR位点的多态性信息量按PIC＝1-∑fi²公式计算，其中fi为i位点的基因频率(Smith et al.，1997，Theor.Appl.Genet.，95(1-2)：163-173.)。以条带清晰，易于统计，多态性好，稳定性好作为核心引物的标准，2000对引物中26对(表1)引物符合核心引物的筛选标准，其占总引物数量的1.3％，其余引物没有多态性，这26对引物覆盖了棉花的22条染色体。

表1经过筛选26对多态性高的SSR引物

注：1、^aF：正向引物     ^bR：反向引物

2、NAU，Nanjing Agricultural University，缩写NAU；BNL，BrookhavenNational Laboratory，美国布克海文国家实验室，缩写BNL

根据这26对引物对32份审定品种扩增的带型，构建棉花DNA指纹数据库，利用引物依次递减的原则，对32份审定品种进行非加权组平均法(unweightedpair grouping method with arithmetic mean，简称UPGMA)聚类分析(图2、3、4)，11对核心引物(图3)和26对核心引物(图2)所反映的32份审定品种间DNA水平的差异基本吻合，当引物减少到8对(图4)时候，每个大类别所包含的品种有大的变化，且品种间遗传相似系数也有较大的差别，所以将11对核心引物确定为首选核心引物(表1中编号1-11)，11对首选核心引物理论上可以区分419904个品种，且出现指纹图谱相同的概率为2.38×10^-6。

利用11对首选核心引物对匿名取样品种的真实性进行了指纹鉴定，结果表明该品种DNA指纹图谱与为鑫秋4号棉花品种图谱一致，与匿名取样品种完全相符。利用11对核心引物，获得参加2009年山东省区域试验25份参试品系的DNA指纹数据库，将25份参试品系的DNA指纹数据库和32份审定品种数据库进行聚类(图6)，结果表明：省区试4号和鲁棉研37遗传相似系数为1，省区试15号和邯棉559遗传相似系数为1，为同一品种。这与田间鉴定结果一致。

在实验室中利用11对核心引物对匿名取样品种真实性的进行检测，其检测时间仅需1-2天即可完成，对2009年山东省棉花区域试验的25份参试品系的检测时间仅需3-5天即可完成，并且其检测结果快速、准确。在棉花品种市场流通过程中的产权纠纷和假冒伪劣品种的辨别上可以提供快速、准确的检测结果。

(四)附图说明：

图1表1中编号2对应的引物在32份审定品种中扩增出的等位基因片段的银染图

图2利用26对SSR引物指纹数据库对32份审定品种聚类结果

图3利用11对SSR引物指纹数据库对32份审定品种聚类结果

图4利用8对SSR引物指纹数据库对32份审定品种聚类结果

图5匿名取样棉花品种(A)的真实性聚类分析

图62009年山东省区域试验棉花品系的真实性聚类分析

注：图中号码1-32为32份审定品种对应的编号，号码33-57为25份山东省区试棉花品系对应的编号

(五)具体实施方式

本发明的具体实施按照以下步骤进行(实施步骤中使用的化学试剂均为市售试剂)：

步骤1棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选：

表2数据库利用的32份审定棉花品种

编号	品种名称	编号	品种名称	编号	品种名称	编号	品种名称
								1	鲁棉研28	9	山农圣棉1号	17	晋棉38	25	银棉8号
2	鲁棉研29	10	冠棉4号	18	鲁棉研30	26	山农圣杂3号
								3	鲁棉研32	11	邯棉559	19	鲁棉研33	27	德杂1号
4	鲁棉研36	12	银瑞361	20	鲁棉研34	28	鲁RH-2
								5	鲁棉研37	13	中植棉2号	21	鲁棉研38	29	银棉2号
6	鑫秋1号	14	鲁垦棉33	22	嘉星5号	30	滨职棉1号
								7	鑫秋4号	15	sGK958	23	瑞杂816	31	鑫秋2号
8	嘉星1号	16	邯5158	24	邯杂154	32	中棉所70

注：其中1、2、6、9、11、12、13、16、18、20、22、23、24、25、26、29、31、32对应的18个品种为国家审定品种，其余14个品种为山东省审定品种。

1、DNA提取

以32份国家和山东省审定的品种为材料(表2)，采用SDS法提取棉花种子的DNA：

A.棉花干种子的种皮去掉，与石英砂混合粗研磨，之后加入液氮细研磨，转移到2mL离心管中加入1mL DNA提取液[200mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，288mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，0.5％SDS(W/V)]混匀，60℃水浴10min，偶尔振荡2～3次。

B.水浴结束后，13200r/min离心5min。

C.取800ul上清转入新的离心管，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1，v/v)，温和翻转50次以上至充分混合均匀。

D.13200r/min离心5min。

E.取600ul的上清液，并加入0.6-1.0倍体积-20℃预冷的的异丙醇，并静置于-20℃下1h以上。

F.用钩状物挑取每个样品中的絮状DNA沉淀，用75％的乙醇和无水乙醇各洗一次。

G.倒掉酒精风干，加400ul ddH2O溶DNA，4℃保存待用。

将溶解好的DNA溶液13200r/min离心1min，取上清DNA溶液保存上述方法提取的基因组DNA利用Eppendorf BioPhotometer生物分光光度计测量DNA的浓度和纯度，-20℃长期保存。OD260/OD280的数值在1.7-2.1之间均可以满足SSR反应的需要。DNA使用的时，使用双蒸水将DNA浓度均稀释到25ng/ul。

2、PCR扩增

总体积为20ul，加入量依此为10×PCR buffer 2ul，25mM Mg²⁺1.2ul，2.5mMdNTP 1.6ul，10uM Forward Primer 1ul，10uM Reverse Primer 1ul，5U/ul Taq DNAPolymerase 0.2ul，25ng/ul DNA 2ul，ddH₂O 11ul。

反应程序采用能提高PCR反应过程中特异性和灵敏性的Touchdown-PCR程序(Darren et al.，2008，nature Protocols，9(3)：1452-1456)进行，反应程序为：95℃3min；20个循环(94℃30s，65-55℃30s，72℃45s，每个循环降0.5℃)；15个循环(94℃30s，55℃30s，72℃45s)；72℃7min；4℃保存。

3、PCR产物的检测

6％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为检测平台，

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂的配制方法如下：

①10×TBE Buffer(2L)

Trisbase            216g

Boric acid(硼酸)    110g

0.5M EDTA(pH 8.0)        74.5ml

②6％Acr-Bis soulation(2L)

ACR(丙烯酰氨)            114g/2L

Bis(甲叉聚丙烯酰氨)      6g/2L

10×TBE                  100ml/2L

urea                     840.8g/2L

③10×Loading Buffer(50ml)：

98％Formamide(甲酰胺)    49ml(100％)

10mM EDTA(pH 8.0)        1ml(0.5M pH8.0)

0.25％Brph Blue(溴酚蓝)  0.125g

0.25％X.cynol(二甲基苯菁)0.125g

④0.5M EDTA(pH8.0)

186.1g Na2EDTA-2H2O容于800ml H2O中，用固体NaOH调pH至8.0定容至1000ml，高温灭菌，室温保存。

⑤2％Repel Silance

500ml 95％乙醇，加入10ml Repel silance

⑥0.5％Binding Silance

500ml 95％乙醇，加入2.5ml Binding Silance

(2)变性聚丙烯酰胺胶板的制备：

A.耳朵板经洗涤剂清洗、自来水冲洗、双蒸水冲洗后，晾干；用无水或95％乙醇擦拭，晾干；然后涂上2％Repel(剥离硅烷)并用细纸涂匀，干燥。

B.平板用同样的方法清洗擦拭后，涂上0.5％Binding(亲和硅烷)并用细纸涂匀，干燥。

C.平板、压条、耳朵板按从下到上的顺序进行组装，用夹子固定；

D.胶的配制：取6％Acr-Bis溶液60ml，加入140ul 10％AP(过硫酸铵)(-20℃可长期保存)，70ul TEMED(N，N，N，N-四甲基二乙胺)迅速混匀。

E.灌胶：把胶液瓶(或用注射器代替)沿胶口来回移动缓缓灌入，辅以轻轻敲打。待胶液流动至底部，在灌胶口轻轻插入梳子，两侧及顶部用大号装订夹夹好，待胶凝固后上板电泳。

胶版可以在前一天的晚上做好，待第二天使用，胶凝固完全。在气温高、天气干燥的时候，过夜保存的胶版会出现底部胶稍微的皱缩，但并不影响实验的效果。

(3)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

A.预电泳：胶凝聚好后，除去装订夹及梳子，清洗灌胶口处碎胶。与电泳装置组装好后，1/2×TBE约750ml加入电泳仪下槽，1/3×TBE约700ml加入电泳仪上槽，清除胶面的碎胶及气泡。60W恒功率预电泳20-30min：2000V，100A，60W(恒定)。

B.样品变性：电泳前，在PCR产物中加入7ul 10×Loading Buffer；4ulMarker(pBR322DNA/MspI)加入10ul ddH₂O和7ul 10×LoadingBuffer；PCR产物和Marker在95℃条件下变性5min后迅速放入冰水混合物中，10min后点样。

C.加样：待胶板预电泳20min左右时停止预电泳，使用胶头滴管彻底清除点样空隙的碎胶及气泡，插入梳子，开始点样，每个点样孔2-5ul，点样量可根据带型的清晰度进行适当调整。

D.电泳：60W恒功率电泳1-2h，电泳时间根据等位基因片段的大小进行调整。

(4)快速银染法显带

A.从垂直板电泳槽上，取下胶板并撬开，将带胶的平板玻璃板放入1000ml矿泉水中漂洗15s。然后在放入0.1％AgNO₃中染色8-10min。0.1％AgNO₃配方：1.5g硝酸银+1500ml矿泉水，充分混匀。

B.从0.1％AgNO₃取出平板玻璃板，再用1000ml矿泉水漂洗两次，每次洗5s。

C.显影事先取30.0g NaOH，加入1500ml矿泉水，混匀，制成显影液。在将漂洗好的胶放入显影液中之前1-2min加入4ml甲醛，在显影过程中密切观察显影效果和背景的深浅。注意显影时尽量不要摇动，以免PAGE从玻璃面上脱落。

D.当DNA带已经清晰显出来后，马上从显影液中取出胶，在矿泉水中漂洗2次，洗去胶面上的NaOH溶液，室温晾干即可读胶。

4、带型的读取

各引物对应扩增出的等位基因依据分子量从大到小依次按1，2，3......进行编号，对于数据统计过程中出现的新等位基因，按上述规则插入或追加并编号，原有等位基因编号可能依此变化。在相同迁移率位置上有带记为1和无带记为0。将带型的有无转化为1和0数字组成的指纹数据，在记录过程中，参照MarkerpBR322DNA/MspI带型，统计主要带型，忽略弱杂带型，统计稳定且易于分辨的条带。品种1到品种32的带型读取结果如表3所示。将同一个品种在不同的引物所产生的指纹数据串联起来就组成了该品种的指纹数据库。

表3品种1到品种32的带型读取结果

5、数据统计分析

在获得不同品种的指纹数据后，利用NTSYS-pc软件(version 2.10e)计算Dice遗传相似性系数GS＝2a/(2a+b+c)，其中，a为任意两品种共享谱带数，b和c为相应两品种间的差异条带，用UPGMA法进行聚类分析。

利用数目依次减少的核心引物(26对，11对，8对)在32份审定品种产生的指纹数据进行UPGMA聚类分析(依次为图2，图3，图4)，在不同的遗传相似系数时，32份品种均能分为五大类，当核心引物减少到11对时，每个大类别所包含的品种(除邯5158)及品种间的遗传相似系数具有较高的一致性(图3和图2)。

当引物减少到8对时候，每个大类别所包含的品种已经发生了大的变化，并且品种间遗传相似系数也有相对较大的差别(图4和图2)。11对核心引物和26对核心引物所反映的32份审定品种间DNA水平的差异基本相吻合，所以将11对核心引物确定为首选核心引物。

步骤2利用棉花品种指纹数据库进行棉花品种鉴定

1、匿名取样品种(A)的指纹鉴定。利用11对首选核心引物对匿名取样品种(A)的DNA进行扩增，获得了11对引物对A品种的指纹数据。将A品种和32份审定品种进行聚类，A品种和鑫秋4号遗传相似系数为1，判定A品种就是鑫秋4号(图5)，经证实A品种为鑫秋4号，说明11对首选核心引物对A品种的指纹分析结果完全与事实相符。

2、32份审定品种的系谱来源分析。山农圣棉1号(常规种)为山农圣杂3号(杂交种)后代优良单株系统选育的品种，其遗传相似系数大于0.9(图3)。银瑞361(常规种)为SGK321系统选育，鲁RH-2(杂交种)其亲本之一为K321，SGK321和K321均来自石远321，具有共同的遗传基础，银瑞361和鲁RH-2遗传相似系数为0.96(图3)。鲁棉研29为鲁735系×168系杂交后代系谱法选育而成，鲁棉33为组合1106系/49系F1代，1106系为735系与鲁棉研18号杂交后代选系，两者有共同的遗传基础鲁735系，鲁棉研29(常规种)和鲁棉研33(杂交种)相似系数为0.9以上(图3)。鑫秋1号为中棉9418×GK12杂交后代系统选育而成，冠棉4号为系鄂棉品系67008选系9806与GK12杂交后系统选育，邯5158为邯93-2×GK12选系邯9598后代系统选育而成，鲁垦棉33系垦721(鲁棉1号系选)与垦655(GK12选系)杂交后系统选育，鑫秋4号为鑫秋1号变异株系统选育，鑫秋1号、冠棉4号、邯5158、鲁垦棉33、鑫秋4号拥有共同的遗传基础材料GK12，聚为一类，遗传相似系数大于0.8(图3)。依据32份审定品种的指纹数据进行的聚类分析结果和品种来源的系谱分析结果基本相吻合，也就是说11对核心引物所反映的品种间DNA水平上的差异与品种来源的系谱分析结果基本吻合。

3、山东省2009年区试品系真实性鉴定。利用11对核心引物，获得参加2009年山东省区域试验25份参试品系(表4)的DNA指纹数据库，将25份参试品系的DNA指纹数据库和32份审定品种数据库进行聚类(图6)，结果表明57份品种(系)在遗传系数为0.67时聚为一类，省区试4号和鲁棉研37遗传相似系数为1，省区试15号和邯棉559遗传相似系数为1，为同一品种。鉴定结果与田间鉴定结果一致。

表4  2009年山东省区试25份棉花品系

编号	品系	编号	品系	编号	品系	编号	品系
								33	省区试1号	40	省区试8号	47	省区试15号	54	省区试22号
34	省区试2号	41	省区试9号	48	省区试16号	55	省区试23号
								35	省区试3号	42	省区试10号	49	省区试17号	56	省区试24号
36	省区试4号	43	省区试11号	50	省区试18号	57	省区试25号
								37	省区试5号	44	省区试12号	51	省区试19号
38	省区试6号	45	省区试13号	52	省区试20号
								39	省区试7号	46	省区试14号	53	省区试21号

Claims (1)

1.一种利用SSR核心引物鉴定棉花品种的方法，其特征在于由棉花干种子提取基因组DNA，利用11对SSR核心引物：NAU1167，NAU2026，NAU1269，NAU2257，NAU1103，BNL1694，NAU5046，NAU2083，NAU2277，NAU1043，NAU3468构建32份审定棉花品种的DNA指纹数据库，将测试品种或品系DNA指纹数据和已构建的棉花品种DNA指纹数据库中的数据进行UPGMA聚类分析，依据品种间Dice遗传相似系数可对测试品种或品系的真实性作出判断，遗传相似系数为1的为同一品种。

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