CN113373243B - 一种家猪家系划分及亲子鉴定试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于家畜分子生物技术领域，提供一种家猪家系划分及亲子鉴定试剂盒及方法，该试剂盒及方法特异性地选择家猪尤其是安庆六白猪14个SSR位点，并合成相应位点引物，通过对98头安庆六白猪的耳组织DNA进行毛细管电泳检测，统计、计算各位点有效等位基因数，杂合度，多态信息含量，遗传距离，排除率，获取家猪尤其是安庆六白猪家系划分，并进行亲子鉴定。14个微卫星位点累积排除概率达99％。本研究所选取的14个微卫星位点在安庆六白猪群体中均具有多态性，可作为有效的遗传标记应用于家猪尤其是安庆六白猪群体家系划分、亲子鉴定等生产实践中。
Description
技术领域
本发明属于家畜分子生物技术领域，涉及一种家猪家系划分及亲子鉴定试剂盒及方法。
背景技术
猪种资源保护工作依赖于地方保种场开展，在生产过程中存在多次引种、系谱及生产信息的记录不清等情况导致存栏猪亲缘关系不清晰，近交风险升高，直接导致了优质种猪家系数量下降，品种纯度及遗传多样性降低，严重影响优质种猪种质资源保存和产业发展。因此，准确的亲缘关系对制定猪的配种计划、避免近交发生以及留种选择、加快育种进程有着重要意义。
简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)是一类有着2-6bp大小重复多次的微卫星位点，广泛存在于生物体基因组中，有着特异性较强，基因组覆盖度高，遗传标记丰富，符合孟德尔遗传规律呈共显性等特点。
目前，利用SSR技术针对家猪家系划分和亲子鉴定报告甚少，尤其是针对安徽特有种质资源的安庆六白家系划分及亲子鉴定未见报道。因此，开展家猪尤其是安庆六白猪的家系划分及亲子鉴定对进一步开展安庆六白猪育种、挖掘其潜力和保护品种资源，具有十分重要的试验和生产意义。
发明内容
本发明的目的在于针对目前家猪尤其是安庆六白猪种质资源保护方面的空白，利用SSR分子标记技术对安庆六白猪群体遗传多样性进行分析，并探索出一种基于SSR标记的安庆六白猪家系划分及亲子鉴定方法，以助力于安庆六白猪种质资源保护及产业开发。
本发明提供一种家猪家系划分及亲子鉴定试剂盒，所述试剂盒包括14个SSR位点，所述SSR位点分别为位于第1条染色体的S0155微卫星座、位于第2条染色体的SW240微卫星座、位于第3条染色体的SW72微卫星座、位于第4条染色体的S0227微卫星座；位于第5条染色体的SW963微卫星座；位于第6条染色体的SW122微卫星座；位于第7条染色体的S0101微卫星座；位于第8条染色体的S0225微卫星座；位于第11条染色体的S0386微卫星座；位于第12条染色体的S0090微卫星座；位于第15条染色体的S0355微卫星座；位于第16条染色体上的S0026微卫星座；位于第17条染色体上的SW24微卫星座；位于性染色体上的SW2156微卫星座。
进一步地，所述14个SSR位点PCR扩增所需的引物如下所述：S0155微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物序列如SEQ ID NO.2所示；SW240微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；SW72微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；S0227微卫星座正向引物序列如SEQID NO.7所示，反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；SW963微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；SW122微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.11所示，反向引物序列如SEQ ID NO.12所示；S0101微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.13所示，反向引物序列如SEQ ID NO.14所示；S0225微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.15所示，反向引物序列如SEQ ID NO.16所示；S0386微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.17所示，反向引物序列SEQ ID NO.18所示；S0090微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.19所示，反向引物序列如SEQ ID NO.20所示；S0355微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.21所示，反向引物序列如SEQ ID NO.22所示；S0026微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.23所示，反向引物序列如SEQ ID NO.24所示；SW24微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO.25，反向引物序列如SEQ ID NO.26所示；SW2156微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.27所示，反向引物序列如SEQ ID NO.28所示。
进一步地位点S0155、SW963、S0386荧光标记为5`-FAM，位点SW240、SW72、SW122、SW24、S0026荧光标记为5`-HEX，位点S0227、S0101、S0090、S0355荧光标记为5`TAMRA；位点S0155、SW240、SW72、S0227、SW963、S0101、S0225、S0386、S0090、S0355、SW24的PCR退火温度为55℃，位点SW122的PCR退火温度为58.5℃，位点SW2156退火温度为60℃。
进一步地，所述试剂盒为25μL反应体系，包括1μL上游引物，1μL下游引物，1μL mixdNTR，2.5μL包括MgCl2Taq Buffer，0.5μL Taq酶，19μL ddH2O。
进一步地，所述14个SSR位点可应用于安庆六白猪。
本发明还提供一种家猪家系划分及亲子鉴定方法，以上述试剂盒合成SSR引物进行PCR从而进行家系划分及亲子鉴定。
进一步地，鉴定方法具体步骤如下所述：(1)样品采集；(2)DNA提取：采用北京艾德莱生物科技公司组织基因组DNA快速提取试剂盒进行猪DNA提取；(3)SSR引物序列合成；(4)PCR扩增；(5)PCR产物毛细管电泳检测；(6)数据处理及结果分析。
进一步地，步骤(6)数据处理及结果分析具体步骤为：使用POPgene3.2软件对微卫星位点多态性进行等位基因数目、有效等位基因数、观测纯和度、期望纯和度、观测杂合度、期望杂合度、香农指数、Hard-Weinberg平衡指标分析；使用PIC_Cale0.6软件进行多态信息含量计算；利用DiploidDate程序对个体间的Nei氏遗传距离进行计算并获得，以非加权组平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)构建的亲缘聚类图。
进一步地，所述家猪为安庆六白猪；所述DNA采集位点位于猪耳。
进一步地，步骤(4)PCR过程为：、95℃预变性3分钟；30秒94℃变性，30秒60℃退火，30秒72℃延伸，10个循环；30秒94℃变性，30秒55℃退火，30秒72℃延伸，35个循环；8分钟72℃修复延伸。
本发明具有如下优点：
1.针对安庆六白猪家系划分和亲子鉴定方面的空白，特异性地选择14个SSR位点，通过合成引物进行PCR，获取SSR标记信息的家系划分与生产记录相符，因此，可以通过分子鉴定快速获得安庆六白猪的家系判断。选择的14个微卫星位点的NE-1P、NE-2P、NE-PP累积排除率均在99％以上，满足生产实践中不同个体间亲子鉴定要求。
2.选择的14个位点分属不同染色体，彼此间连锁可能性较小；14个微卫星位点在安庆六白猪群体中等位基因型分布具有特异性。
3.本方法DNA采集位点为猪耳，可以以最小伤害获得猪的DNA，有利于生产实践。根据本方法基于14个SSR位点合成引物对进行PCR，可以提高家猪尤其是安庆六白猪育种准确性，加快其育种进程，具有良好的应用前景和经济效益。
附图说明
图1荧光标记5`-FAM下S0155位点65号样本电泳结果
图2荧光标记5`-HEX下SW122位点8号样本电泳结果
图3荧光标记5`-TAMRA下S0090位点95号样本电泳结果
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行具体阐述。
实施例1：
1材料方法：
1.1样品采集
本发明共采集98头份纯种安庆六白猪耳组织样本，由安徽省花亭湖绿色食品开发有限公司提供(安徽省安庆市太湖县晋熙镇程岭村)。耳样保存于装有500μL 75％酒精的1.5mL离心管中，带回实验室后于-20℃条件下保存。
1.2 DNA提取
安庆六白猪组织DNA采用艾德莱生物科技公司(北京)组织基因组DNA快速提取试剂盒进行提取，提取后的DNA样品使用紫外分光光度计进行浓度及纯度检查，质量合格的DNA样品存放在-80℃环境下备用。
1.3微卫星位点选择及引物设计
本发明选择的14个位点信息如表1所示，根据位点信息合成对应位点引物序列，位点信息及引物序列详见表1。
表1微卫星位点及引物信息
1.4 PCR扩增体系及反应条件
PCR反应采用25μL反应体系，包括1μL上游引物，1μL下游引物，1μL dNTR(mix)，2.5μL Taq Buffer(with MgCl2)，0.5μL Taq酶，19μL ddH2O；PCR程序设定为：95℃预变性(3min)，10循环(94℃变性(30sec)，60℃退火(30sec)，72℃延伸(30sec))，35循环(94℃变性(30sec)，55℃退火(30sec)，72℃延伸(30sec))，72℃修复延伸(8min).
1.5 PCR产物毛细管电泳检测
使用ABI3730xl基因测序仪对PCR产物进行毛细管电泳，使用Genemapper软件读取分析毛细管电泳结果，判断各样本在每个微卫星位点上的等位基因大小及基因型。
1.6数据处理及分析
整理各微卫星位点在安庆六白猪个体中基因型。使用POPgene3.2软件对微卫星位点多态性进行以下信息分析：等位基因数目(Number of alleles)，有效等位基因数(Effective number of alleles)，观测纯和度(Observed homozygote)，期望纯和度(Expected homozygote)，观测杂合度(Observed heterozygosity)、期望杂合度(Expectedheterozygosity)、香农指数(Shannon's Information index)、Hard-Weinberg平衡等指标(Hard-Weinberg equilibrium test)，使用PIC_Cale0.6软件进行多态信息含量计算(polymorphism information content)。本发明将每个样本视为一个群体，利用DiploidDate程序对个体间的Nei氏遗传距离进行计算，并获得以非加权组平均法(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)构建的亲缘聚类图。使用CERVUS 3.07软件计算14个微卫星位点无效等位基因频率(nullallele frequency)及非排除率(combined exclusion probability)，排除率计算方法为1-非排除率。
2结果与分析
2.1安庆六白猪14个微卫星位点遗传多样性分析
本发明共选用14个微卫星位点对98个安庆六白猪个体进行遗传多样性分析。部分微卫星位点PCR产物毛细管电泳结果如图1、2、3所示：如65号样本在S0155位点电泳结果只存在一个峰(161bp)，说明为纯合子；8号样本SW122位点电泳结果存在两个峰(111/118bp)，为杂合子；95号样本在S0090位点存在两个峰为杂合子。
各微卫星位点在安庆六白猪群体中等位基因及基因型频率平见表2(按片段大小从低到高排序分别命名为等位基因A至等位基因L)。
表2 14个微卫星位点在安庆六白猪群体中等位基因及基因频率统计
14个位点共检测出119个等位基因，平均每个位点等位基因数为8.5，其中S0255位点等位基因数最多(n＝12)，片段范围为167bp-191bp，SW72位点等位基因数最少(n＝5)，片段范围为99bp-113bp。在14个位点中，SW72位点B等位基因(100bp)在安庆六白猪群体中等位基因频率最高为0.4323；S0255位点L等位基因(191bp)在安庆六白猪群体中等位基因频率最低为0.0052。各位点等位基因频率大于0.1的等位基因型数量为2-5个。
安庆六白猪14个微卫星位点遗传多样性分析见表3。各位点有效等位基因数处于3.1927-7.1078，平均有效等位基因数为4.8161，其中S0026位点有效等位基因数最少，SW2156位点有效等位基因数最多。各位点观测纯合度处于0.1684-0.6421之间，其中SW240位点观测纯合度值最小，SW963位点观测纯合度值最大。各位点期望纯合度处于0.3579-0.8316，其中SW963位点期望纯合度值最小，SW240位点期望纯合度值最大。各位点观测杂合度范围在0.1358-0.3097之间，SW2156位点观测杂合度值最小，S0026位点观测杂合度值最大。各位点期望杂合度范围在0.6903-0.8626之间，S0026位点期望杂合度值最低，S0255位点期望杂合度值最高。
表3 14个微卫星位点在安庆六白猪群体中遗传信息分析
注：Na(观察等位基因数)；Ne(有效等位基因数)；Hom(Obs)观测纯合度；Hom(Exp)期望纯合度；Het(Obs)观测杂合度；Het(Exp)期望杂合度；I：香农指数；PIC多态信息含量；H-W：Hard-Weinberg平衡检测，**表示位点未达到H-W动态平衡，无**标记表示位点已达到H-W动态平衡。
各位点香农指数处于1.3263-2.1314之间，SW72位点的香农指数值最低，SW2156位点的香农指数值最高。各位点多态信息含量范围在0.6444-0.8424之间，S0026位点的多态信息含量值最低，S0255位点的多态信息含量最高。各位点经过卡方检验以研究其是否处于Hard-Weinberg动态平衡，经计算S0155，S0227，SW963，SW122，S0255，S0386，S0355，SW2156不处于Hard-Weinberg动态平衡；SW240，SW72，S0101，S0090，SW24，S0026已处于Hard-Weinberg动态平衡。
2.2基于SSR标记的家系划分及亲缘鉴定
根据Nei氏遗传距离运算结果构建98头安庆六白猪的亲缘关系树，可发现本实施例样本可分为7个类群，与该保种场保种群的家系组成记录相符。部分样本间的Nei氏遗传距离、遗传一致度系数见表4，结果可知遗传一致度系数与遗传距离系数之间呈负相关。
表4 1-12样本Nei氏遗传距离及遗传一致系数
注释：表上方为遗传一致度系数，表下方为遗传距离系数。
14个微卫星位点非排除率见表5。当一个候选亲本和子代的基因型已知(NE-1P)，各位点排除率在0.276-0.419，14个位点累计排除率为0.9995；一个已知亲本、性别不同的另一个候选亲本和子代的基因型已知(NE-2P)，各位点排除率在0.448-0.713，14个位点累计排除率为0.9999；候选父母双方和子代基因型已知(NE-PP)，各位点排除率在0.626-0.887，14个位点累计排除率为0.9999。
本发明选取的14个微卫星位点在安庆六白猪群体中共观测到119个等位基因，每个位点平均等位基因数为8.500±2.1031；平均有效等位基因数为4.8162±1.3217。安庆六白猪微卫星位点平均有效等位基因数高于安徽省其他地方猪种(圩猪、皖南黑猪、皖南花猪)，也高于部分省外地方猪种如枫泾猪、撒坝猪、大河猪、巴马香猪。检测各位点的Ne/Na比值，发现S0355位点Ne/Na比值最高，为0.7138；SW24位点比值最低，为0.3614，说明S0355位点各等位基因在安庆六白猪群体中分布较为均匀。此外，S0227位点在安庆六白猪群体中的等位基因数为7个，在泰国地方猪中只检测出4个等位基因，安庆六白猪其他微卫星位点与墨西哥无毛猪、古巴克里奥尔猪、伊比利亚猪等猪种相比，等位基因数也有所差异。这表明14个位点等位基因在安庆六白猪群体中分布存在特异性。
表5 14个微卫星位点排除概率
| Loci | NE-1P | NE-2P | NE-PP | NE-I | NE-SI | F(Null) |
| S0155 | 0.419 | 0.6 | 0.79 | 0.929 | 0.625 | 0.0115 |
| SW240 | 0.534 | 0.7 | 0.874 | 0.96 | 0.662 | 0.0019 |
| SW72 | 0.278 | 0.448 | 0.626 | 0.858 | 0.564 | -0.0080 |
| S0227 | 0.344 | 0.522 | 0.708 | 0.896 | 0.597 | 0.0741 |
| SW963 | 0.431 | 0.61 | 0.8 | 0.932 | 0.629 | 0.3810 |
| SW122 | 0.456 | 0.632 | 0.814 | 0.94 | 0.64 | -0.0060 |
| S0101 | 0.408 | 0.588 | 0.782 | 0.923 | 0.618 | 0.0055 |
| S0255 | 0.552 | 0.713 | 0.879 | 0.963 | 0.669 | 0.2350 |
| S0386 | 0.343 | 0.524 | 0.719 | 0.896 | 0.592 | 0.2846 |
| S0090 | 0.379 | 0.56 | 0.75 | 0.913 | 0.611 | 0.0353 |
| S0355 | 0.482 | 0.655 | 0.831 | 0.947 | 0.65 | 0.1759 |
| SW24 | 0.351 | 0.537 | 0.744 | 0.901 | 0.589 | 0.0410 |
| S0026 | 0.276 | 0.453 | 0.643 | 0.859 | 0.557 | 0.0173 |
| SW2156 | 0.562 | 0.722 | 0.887 | 0.929 | 0.625 | 0.1713 |
| 累计排除率 | 0.9995 | 0.9999 | 0.9999 | 0.9999 | 0.9999 |
有效等位基因数、多态信息含量、杂合度是研究群体遗传变异的重要指标，Hardy-Weinberg动态平衡则可反映群体的迁移，选择等情况。杂合度可以用来度量群体的变异程度，杂合度值越低，说明该群体遗传变异少，多样性低。安庆六白猪14个微卫星位点平均期望杂合度值为0.7824±0.0573，在国内地方猪中处于中等水平。多态信息含量可作为衡量位点多态性的指标之一，若多态信息含量值高，则代表位点在群体中杂合子的比例较高，其遗传潜力也越大。14个微卫星位点在安庆六白猪群体中多态信息含量值都高于0.5，其平均多态信息含量值为0.74±0.06。当某遗传位点达到H-W动态平衡时，其等位基因频率及基因型频率在群体中可稳定遗传。本发明中，14个微卫星位点在安庆六白猪群体中有S0155等八个位点未达到H-W动态平衡，SW240等六个位点达到H-W动态平衡。本发明共选择14个微卫星位点进行多态性检测，且各位点分属不同染色体，彼此间连锁可能性较小。根据微卫星结果绘制的遗传距离聚类图可将98头安庆六白猪区分为7个家系，与其保种群构建之初的引种记录一致，说明本发明的可信度较高。本发明所选择的14个微卫星位点的NE-1P、NE-2P、NE-PP累积排除率均在99％以上，满足生产实践中不同个体间亲子鉴定要求。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 一种家猪家系划分及亲子鉴定试剂盒及方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgttctctgt ttctcctctg tttg 24
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<211> 27
<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (8)
1.一种安庆六白猪家系划分及亲子鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增14个SSR位点的引物，所述14个SSR位点分别为位于第1条染色体的S0155微卫星座、位于第2条染色体的SW240微卫星座、位于第3条染色体的SW72微卫星座、位于第4条染色体的S0227微卫星座；位于第5条染色体的SW963微卫星座；位于第6条染色体的SW122微卫星座；位于第7条染色体的S0101微卫星座；位于第8条染色体的S0225微卫星座；位于第11条染色体的S0386微卫星座；位于第12条染色体的S0090微卫星座；位于第15条染色体的S0355微卫星座；位于第16条染色体上的S0026微卫星座；位于第17条染色体上的SW24微卫星座；位于性染色体上的SW2156微卫星座；
所述14个SSR位点PCR扩增所需的引物如下所述：S0155微卫星座正向引物序列如SEQID NO. 1所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 2所示；SW240微卫星座正向引物序列如SEQ IDNO. 3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示；SW72微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 6所示；S0227微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 7所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 8所示；SW963微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 9所示，反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；SW122微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO.11所示，反向引物序列如SEQ ID NO.12所示；S0101微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 13所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 14所示；S0225微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 15所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 16所示；S0386微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 17所示，反向引物序列SEQ ID NO. 18所示；S0090微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 19所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 20所示；S0355微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 21所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 22所示；S0026微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 23所示，反向引物序列如SEQ ID NO.24所示；SW24微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 25，反向引物序列如SEQ ID NO. 26所示；SW2156微卫星座正向引物序列如SEQ ID NO. 27所示，反向引物序列如SEQ ID NO. 28所示。
2.权利要求1所述的鉴定试剂盒，其特征在于：位点S0155、SW963、S0386荧光标记为5`-FAM，位点SW240、SW72、SW122、SW24、S0026荧光标记为5`-HEX，位点S0227、S0101、S0090、S0355荧光标记为5`TAMRA；位点S0155、SW240、SW72、S0227、SW963、S0101、S0225、S0386、S0090、S0355、SW24的PCR退火温度为55℃，位点SW122的PCR退火温度为58.5℃，位点SW2156退火温度为60℃。
3.权利要求2所述的鉴定试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为25μL反应体系，包括1μL上游引物，1μL下游引物，1μL mix dNTR，2.5μL 包括MgCl2Taq Buffer，0.5μL Taq酶，19 μLddH2O。
4.一种安庆六白猪家系划分及亲子鉴定方法，其特征在于：以权利要求3所述试剂盒中SSR引物序列进行PCR从而进行家系划分及亲子鉴定。
5.权利要求4所述的家系划分及亲子鉴定方法，其特征在于，具体步骤如下所述：（1）样品采集；（2）DNA提取：采用北京艾德莱生物科技公司组织基因组DNA快速提取试剂盒进行猪DNA提取；（3）SSR引物序列合成；（4）PCR扩增；（5）PCR产物毛细管电泳检测；（6）数据处理及结果分析。
6.权利要求5所述的家系划分及亲子鉴定方法，其特征在于：步骤（6）数据处理及结果分析具体步骤为：使用POPgene3.2软件对微卫星位点多态性进行等位基因数目、有效等位基因数、观测纯和度、期望纯和度、观测杂合度、期望杂合度、香农指数、Hard-Weinberg平衡指标分析；使用PIC_Cale0.6软件进行多态信息含量计算；利用DiploidDate程序对个体间的Nei氏遗传距离进行计算并获得，以非加权组平均法构建的亲缘聚类图。
7.权利要求6所述的家系划分及亲子鉴定方法，其特征在于：所述样品采集位点为猪耳。
8.权利要求7所述的家系划分及亲子鉴定方法，其特征在于：步骤4）PCR过程为：95℃预变性3分钟； 30秒94℃变性，30秒60℃退火，30秒72℃延伸，10个循环；30秒94℃变性，30秒55℃退火，30秒72℃延伸，35个循环；8分钟72℃修复延伸。
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