TWI425095B - 鑑定蘭嶼豬品種之微衛星標記群組及方法 - Google Patents

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Description

鑑定蘭嶼豬品種之微衛星標記群組及方法
本發明係關於一種鑑定蘭嶼豬品種之微衛星標記組合，及其鑑定方法。
蘭嶼豬是臺灣原生種小型豬(miniature pig)，原棲息於臺灣東南端的蘭嶼島，為當地原住民飼養之小耳品種豬隻。其頭部為長型、四肢短而強健、耳朵小而向上直立、背部略凹且長有剛毛、毛色呈黑色，肋骨數為14對，22週齡公豬重僅17.95±6.53kg，22週齡母豬重僅16.21±6.29kg，出生活仔豬數約5.6頭(張等，1998b)，成豬之體重約為75公斤重。經畜產試驗所臺東種畜繁殖場進一步選拔與育種，於2003年選育出(完成品種登記)具黑白斑紋毛色之蘭嶼花斑豬與2002年選育出全白毛色之蘭嶼豬(賓朗豬)。
國立臺灣大學畜牧系(國立臺灣大學動物科學技術系之前身)於1975年自蘭嶼島引入小耳種公豬1頭、母豬3頭；此外，臺灣省畜產試驗所臺東種畜繁殖場亦於1980年自蘭嶼島另行引入小耳種公豬4頭、母豬16頭進行飼養。隨後利用自然配種方式，維持15公45母之規模，以建立醫學研究用迷你豬基礎族群。1987年時，行政院農委會將這些引種至臺灣的蘭嶼豬保種族群納入國家級保種族群(張等，1998b)，目前由國立臺灣大學農業試驗場與臺灣省畜產試驗所臺東種畜繁殖場，分別進行異地保種。
蘭嶼豬具有獨特的遺傳組成，其粒線體D環(D-loop)與其它歐亞豬種(包含小型豬)的遺傳距離甚大；因此，以蘭嶼豬模擬進行人體醫學實驗會與使用其它小型豬的情形有極大的不同，易言之，蘭嶼豬具有其它實驗研究用豬種無法摹擬之醫學實驗動物的潛力。未來若蘭嶼豬成為廣泛使用的實驗動物，則其品種之遺傳鑑定與遺傳品質監控會變得相當重要。
近五十年來，有許多與多型性有關之遺傳分子標記已被應用於探討物種間之遺傳關係與品種鑑定，包括利用等位基因酶、DNA序列多型性、以及DNA重複序列多型性來進行關鑑定及研究。而本發明係提供一種利用DNA重複序列多型性來進行品種鑑定的方法，以及其所使用的微衛星標記組合。
在真核生物的染色體中散布著許多串聯重複序列(tandemly-repeated sequence)，這些序列是由特定單位序列重複多次所構成，依其序列組成長度可分為衛星DNA(satellite DNA，可達5Mb)、迷你衛星DNA(minisatellite DNA，常為14至100個核苷酸之串聯重複序列所組成，總長度約為0.5~3kb)與微衛星DNA(microsatellite DNA，常為1至6個核苷酸之串聯重複序列所組成，總長度約為20~200bp)。由於許多串聯重複序列具有高度多型性，且散布於各染色體之特定區域，所以常被做為物種的遺傳分子標記，用於基因定位、親緣鑑定及遺傳關係探討等用途。
微衛星DNA的突變率高，所以在個體間具高度多型性，廣被作為不同物種、同種物種間遺傳親緣與親子間之親緣鑑定分子標記。本發明係以螢光標定引子，再對不同個體之同一微衛星標記進行增幅，並對增幅片段進行毛細管電泳，再依其結果計算出受試個體之間的遺傳距離，並建構族群親緣樹，以鑑定個體或族群間之遺傳關係。
因此，本發明係提供一種鑑定蘭嶼豬品種之微衛星標記組合，其包含下列微衛星標記：SW024、SW72、SW122、SW857、SW911、SW951、IGF1、S0002、S0005、S0068、S0155、S0215、S0218、S0225、S0226、S0227、S0228、S0355及S0386。
本發明並提供一種鑑定蘭嶼豬品種之方法，其包括下列步驟：(a)提供豬隻之基因體DNA樣本；(b)鑑定前述基因體DNA中微衛星標記的多型性，其中前述微衛星標記包含SW024、SW72、SW122、SW857、SW911、SW951、IGF1、S0002、S0005、S0068、S0155、S0215、S0218、S0225、S0226、S0227、S0228、S0355及S0386；(c)由前述微衛星標記之多型性分析結果鑑定前述豬隻與蘭嶼豬之親緣關係。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法係使用聚合酶連鎖反應來鑑定前述微衛星標記的多型性。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法係使用建構親緣樹的方式來鑑定前述豬隻與蘭嶼豬之親緣關係。
在本發明之較佳實施態樣中，前述方法係進一步包含下列獨特對偶基因：SW024之重複片段長度為118bp；SW911之重複片段長度為163bp；SW951之重複片段長度為136bp；S0002之重複片段長度為174bp；S0068之重複片段長度為244bp；S0155之重複片段長度為166bp；S0218之重複片段長度為188bp；S0225之重複片段長度為174bp；S0226之重複片段長度為176bp；S0227之重複片段長度為238bp；S0227之重複片段長度為258bp；S0228之重複片段長度為227bp；S0355之重複片段長度為272bp；或S0355之重複片段長度為276bp。
本發明係使用螢光標定之19對微衛星標記引子，對7個豬種共242頭豬的基因體DNA(genomic DNA)樣本進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)反應，獲得增幅的微衛星標記重複片段，之後進行毛細管電泳，測定各個個體之微衛星標記多型性與特徵，再利用軟體(包括MSA、Structure、CERVUS等)進行估算，得出基因型頻率、遺傳距離、個體親緣分類樹、及各基因座之雜合度與獨特之對偶基因等，而用於個體類緣關係之比較。
試驗豬種與來源
本發明所用的蘭嶼豬檢體分別自國立臺灣大學生物資源暨農學院附設農業試驗場採集5頭及行政院農業委原會畜產試驗所臺東種畜繁殖場採集39頭(共44頭)，桃園豬(Taoyuan pig)檢體分別採集自高雄種畜繁殖場6頭及農委會畜產試驗所種原庫30頭(共36頭)，梅山豬(Meishan pig)檢體分別採集自高雄種畜繁殖場7頭及農委會畜產試驗所種原庫30頭(共37頭)，此外，32頭藍瑞斯豬(Landrace pig)檢體、31頭約克夏豬(Yorkshire pig)檢體、30頭盤克夏豬(Berkshire pig)及32頭杜洛克豬(Duroc pig)檢體均採集自農委會畜產試驗所種原庫。豬隻品種共7種，總計242頭個體，如下表1所示。
豬隻血液採集
本發明之豬隻血液樣本，分別自上表1當中242隻豬進行頸靜脈竇採血，採血前先以1mL EDTA(濃度0.5M pH 8.0)充份潤濕20mL針筒壁，每一隻豬採集30mL的血液，採集完畢注入含EDTA之採血管中(BD VacutainerTM K3EDTA,USA)後，盡快置入冰桶冷藏。
製備基因體DNA
前述血液樣本各取10mL，以QIAamp DNA Blood Maxi套組(QIAGEN,USA)，依套組內所附之說明書來抽取基因體DNA，並將所得基因體DNA載入0.6%洋菜膠體，於0.5×TBE緩衝液中以100V電泳分離，而後以其電泳環帶構型(pattern)確定基因體DNA品質後，將之保存於-20℃冰箱中。
微衛星標記之引子設計
由19對豬基因組中之15對染色體中選出19個微衛星標記，包括SW024、SW72、SW122、SW857、SW911、SW951、IGF1、S0002、S0005、S0068、S0155、S0215、S0218、S0225、S0226、S0227、S0228、S0355及S0386。並使用MWG biotech公司(MWG Biotech,England)所合成的引子，藉由PCR增幅出來的序列片段長度來分析各微衛星標記的多型性，其中各引子之5’端標定有螢光物質。其序列如下表2所示：
聚合酶連鎖反應
聚合酶連鎖反應係使用Taq DNA聚合酶(Amersham Biosciences,USA)與PTC-200 Programmable Thermal Controller(MJ Research Inc,USA)來進行。首先在滅菌1.5ml微量離心管中加入11.105μL滅菌去離子水、1.5μL Taq DNA聚合酶10×緩衝液(內含500mM KCl、15mM MgCl2 及100mM Tris-HCl)、0.45μL前述微衛星標記引子(4.5pmole)、0.375μL 8mM dNTP及0.12μL Taq DNA聚合酶(5U/μL，含50mM Tris-HCl、0.1mM乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)及5mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT))，震盪使其混合均勻。之後分別在PCR用之96孔反應盤(Sorenson Bioscience,USA)的各個孔洞中加入14μL前述混合液，再加入1μL基因體DNA(50ng/μL)，PCR總反應體積為15μL。輕輕拍動反應盤使其混合均勻後，於4℃以2000rpm之轉速離心2分鐘，使盤中反應液下沈至孔洞下方，以利反應之進行。最後在PTC-200上蓋及底盤加熱至95℃時置入前述反應盤，以進行PCR反應，其作用條件如下：
步驟一：95℃，5分鐘×1循環；
步驟二：95℃，30秒；48-62℃(依表2所列之煉合溫度進行)，30秒：72℃，45秒；
步驟二重覆37循環；
步驟三：72℃，7分鐘×1循環。
各微衛星標記之多型性的判讀
從前述聚合酶連鎖反應的產物中各取3μL進行毛細管電泳，再使用MEGABACE 1000自動定序儀(Amersham Biosciences,USA)及軟體Genetic-profiler Version 2.2(Amersham Biosciences,USA)定序並判讀個體豬隻之各個微衛星標記所擴增DNA片段長度的多型性，亦即兩個對偶基因座上串聯重複序列之重複次數的多寡造成長度之多型性。其中使用螢光標記ET-400(Amersham Biosciences,USA)作為對偶基因長度之校正標準。
建構鄰接樹(neighbor joining tree，NJ tree)
依據前述19個微衛星標記的多型性，以MSA軟體計算出估算出前述242受試個體豬隻之間的遺傳距離-ln(proportion of shared allele)，並利用MEGA3軟體建構出鄰接樹(見Kumar et al., 2000)，結果顯示前述7個豬種都會形成獨立之分支，如第一圖所示。
對偶基因比較
另外，並依據前述19個微衛星標記的多型性進一步比較蘭嶼豬、桃園豬、梅山豬、藍瑞斯豬、約克夏豬、杜洛克豬與盤克夏豬的對偶基因，發現蘭嶼豬具有14個獨特的對偶基因，分別座落於12個基因座上。
下表3係列出本發明之實驗所使用的44頭保種蘭嶼豬及其對偶基因比較。其中有效對偶基因數(effective allele number)係指所採用的微衛星標記在一基因座上之對偶基因數目必須高於某對偶基因數，如此所採用之微衛星標記才適合做為族群遺傳多型性分析；而獨特對偶基因(private allele)係指某族群或品種所擁有之微衛星標記在一基因座上之對偶基因是獨特的，在其它品種並未被發現。
在受試的242頭個體中，有4頭豬隻個體被分至與其品種不符之分支，分別為梅山豬2頭、約克夏豬1頭與盤克夏豬1頭，顯示此4頭豬隻個體可能有其他豬種基因滲入，且本發明之鑑定方法確實可將所有受試的蘭嶼豬與其他豬種區隔開來。另外，臺東種畜繁殖場的39頭蘭嶼豬與臺灣大學農業試驗場的5頭蘭嶼豬仍各自區分成不同的兩個小分支，此結果可能是因兩個族群採集時間不同與多年的分離飼養，而分別形成不同的基因型頻率，進而導致個體間遺傳距離差異。在此次分析中，豬隻個體被分至其所屬品種分支之正確率為98.4%，顯示本發明根據前述19組微衛星標記基因座之-1n(proportion of shared allele)遺傳距離所進行之鄰接樹分析，對前述豬種具有高度之鑑別度。
現今蘭嶼豬業已開發為生物醫學研究用之中大型實驗動物，並已廣為各大醫院及研究中心採用，作為生物醫學研究的動物模型。未來研究學者或實驗動物育種公司一定會將蘭嶼豬與其他小型豬進行雜交育種，育成新品系實驗用豬。因此蘭嶼豬與其它豬種雜交可能性會越來越大。未來，蘭嶼豬若更進一步成為國際交流之實驗動物，其品種之遺傳監控與遺傳品質鑑定更顯重要。本發明開發之微衛星標記及其獨特對偶基因除了可以做為蘭嶼豬產銷履歷上之遺傳標記認證外，更可做為遺傳監控標記。
第一圖係本發明242頭受試個體豬隻之根據19個微衛星標記多型性所估算-ln遺傳距離所建構出來的鄰接樹，顯示前述7個豬種都會形成獨立之分支。圖中以英文標註並以括號加註中文之標記，為混入與所屬品種不符之個體。

Claims (4)

  1. 一種鑑定蘭嶼豬品種之方法，其包括下列步驟：(a)提供豬隻之基因體DNA樣本；(b)鑑定前述基因體DNA中微衛星標記的多型性，其中前述微衛星標記包含SW024、SW72、SW122、SW857、SW911、SW951、IGF1、S0002、S0005、S0068、S0155、S0215、S0218、S0225、S0226、S0227、S0228、S0355及S0386；(c)由前述微衛星標記之結果鑑定前述豬隻與蘭嶼豬之親緣關係。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其係使用聚合酶連鎖反應來鑑定前述微衛星標記的多型性。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其係使用建構親緣樹的方式來鑑定前述豬隻與蘭嶼豬之親緣關係。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含下列獨特對偶基因：SW024之重複片段長度為118bp；SW911之重複片段長度為163bp；SW951之重複片段長度為136bp；S0002之重複片段長度為174bp；S0068之重複片段長度為244bp；S0155之重複片段長度為166bp；S0218之重複片段長度為188bp；S0225之重複片段長度為174bp；S0226之重複片段長度為176bp；S0227之重複片段長度為238bp；S0227之重複片段長度為258bp；S0228之重複片段長度為227bp；S0355之重複片段長度為272bp；或 S0355之重複片段長度為276bp。
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