CN112126693A - 岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星pcr鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。提取岩原鲤个体样本的基因组DNA；进行PCR扩增：岩原鲤亲子鉴定用引物组中的20对微卫星引物的每对引物的正向引物的5’端标记上荧光物质，利用上述引物组中的各标记荧光引物对获得的DNA基因组进行梯度PCR扩增，扩增产物在测序仪上进行毛细管电泳，读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型数据；岩原鲤家系的亲子鉴定分析：基于基因型数据进行亲本和子代数据分析，根据子代基因型和亲本基因型之间的相关性，确定子代与亲本间的亲子关系。本发明方法简单、快捷、高效、经济，可在岩原鲤繁殖群体的家系管理、群体遗传变异研究和增殖放流效果评估提供技术途径。
Description
技术领域
本发明涉及鱼类育种和分子标记技术领域，涉及一种基于微卫星标记对岩原鲤进行亲子鉴定的技术，具体涉及岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。
背景技术
岩原鲤(Procypris rabaudi Tchang)属鲤形(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鲤亚科(Cypininae)，原鲤属(Procypris)，地方名岩鲤、黑鲤、岩鲤巴等。分布于宜昌以上长江干流及支流，是一种栖居于岩石缝间的底层鱼类，以嘉陵江、岷江和金沙江较多，现为四川、重庆等地的野生名贵经济鱼类之一。由于岩原鲤分布区域相对狭窄，种群数量小，再加上过度捕捞、长江水域污染，以及长江上游干支流筑坝建闸等原因，导致岩原鲤适宜栖息地大规模缩减，造成了岩原鲤野生资源日益枯竭，已被《中国濒危动物红皮书》列为易危物种，为增殖保护这一名贵鱼类资源，需对岩原鲤进行人工增殖放流，开展种资资源保护、恢复与资源增殖研究非常重要。
多年来，有关岩原鲤营养特性、人工养殖和繁殖技术等的研究已非常成熟，增殖放流的规模大，区域广。仅以金沙江溪洛渡向家坝水电站珍稀特有鱼类增殖放流站为例，自2008-2019年的12年里，累计放流超过64.7万尾，占放流总量的36.6％。此外，金沙江中游金沙、观音岩、龙开口等鱼类增殖站均有放流该种类，还有四川、重庆、云南、贵州等省市持续开展了岩原鲤鱼类增殖放流，因此，长江流域年放流的岩原鲤苗种可达到百万尾规模。因此，面对多省份、多机构的岩原鲤放流亲本来源于不同家系，如何快速有效辨别不同的岩原鲤家系及来源，探究各放流机构对该区域岩原鲤资源量的增殖效果贡献，已成为岩原鲤种群资源恢复的重要研究课题之一。
微卫星(Microsatellite)是一类广泛存在于真核生物基因组中的具有高度变异性的简单重复DNA序列。它具有按照孟德尔方式分离、多态信息含量丰富、呈共显性遗传等特点，可简便快速的基因型检测，是一种广泛应用的遗传学分子标记。同时，由于微卫星标记的使用简单、结果稳定、费用低廉，已经在亲子鉴定中有较多的应用。目前，尚未发现将微卫星标记应用于岩原鲤亲子鉴定的研究报道。本发明旨在基于微卫星标记建立岩原鲤的亲子鉴定技术，可在岩原鲤繁殖群体的家系管理、种质鉴定、群体遗传变异研究和增殖放流效果评估提供技术途径。
发明内容
本发明涉及一种基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法。
本发明采用的技术方案如下：
提供基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定用引物组，分别为：Prora002、Prora003、Prora048、Prora050、Prora054、Prora055、Prora066、Prora071、Prora074、Prora075、Prora079、Prora085、Prora089、Prora093、Prora096、Prora098、Prora100、Prora102、Prora103、Prora106引物，各引物序列如下表：
按上述方案，每对引物的正向引物的5’端标记有荧光物质，所述的荧光物质选自FAM或HEX。
按上述方案，20个位点分成10个组合；10个组合分别如下：组合1为Prora002引物和Prora106引物，组合2为Prora089引物和Prora003引物，组合3为Prora048引物和Prora103引物，组合4为Prora066引物和Prora071引物，组合5为Prora074引物和Prora055引物，组合6为Prora085引物和Prora100引物，组合7为Prora096引物和Prora075引物，组合8为Prora093引物和Prora050引物，组合9为Prora098引物和Prora054引物，组合10为Prora102引物和Prora079引物。
提供一种基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定试剂盒，包括Taq酶PCR预先混合液、上述岩原鲤亲子鉴定用的引物组，其中Taq酶PCR预先混合液主要成分为0.1U/μl Taq DNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mM MgCl2，以及0.4mM dNTPs；岩原鲤基因组DNA的浓度为30-50ng/uL。
按上述方案，所述的岩原鲤亲子鉴定试剂盒还包括双蒸水。
提供一种微卫星PCR鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取岩原鲤个体样本的基因组DNA；
(2)PCR扩增：将岩原鲤亲子鉴定用引物组中的的20对微卫星引物)中的正向引物的5’端标记上荧光物质，利用上述引物组中的各对引物对步骤(1)获得的DNA基因组进行梯度PCR扩增，扩增产物在测序仪上进行毛细管电泳，读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型数据；
(3)岩原鲤家系的亲子鉴定分析：基于步骤(3)获取的基因型数据转换成生物软件能够读取的格式，进行亲本和子代数据分析，根据子代基因型和亲本基因型之间的相关性，确定子代与亲本间的亲子关系。
按上述方案，所述的步骤(1)为：将岩原鲤亲本的鳍条和子代鱼苗个体，采用高盐提取法获得每个个体的基因组DNA，保存备用
按上述方案，所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touch down)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。
按上述方案，所述的PCR反应体系为：5.0uL Taq酶PCR预先混合液(主要成分为0.1U/μl Taq DNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mM MgCl2，以及0.4mM dNTPs)、1.0uL模板基因组DNA(浓度30-50ng/uL)、上下游扩增引物各0.4uL(浓度10uM)，加3.2uL ddH2O至总体积10uL。
按上述方案，步骤(2)中的测序为对如下各组合：组合1(Prora002和Prora106)、组合2(Prora089和Prora003)、组合3(Prora048和Prora103)、组合4(Prora066和Prora071)、组合5(Prora074和Prora055)、组合6(Prora085和Prora100)、组合7(Prora096和Prora075)、组合8(Prora093和Prora050)、组合9(Prora098和Prora054)、组合10(Prora102和Prora079)，进行组合测序。本发明根据PCR产物大小进行组合，将20个微卫星位点引物分成10个组合，其中各引物组合内PCR产物相互不干扰，稳定且清晰，将其扩增的PCR产物混合为一个基因型分析样品，相比单个微卫星PCR扩增的基因型分析样品，具有省时高效、经济节约的优点；
本发明基于精心筛选的20个多态性微卫星位点，开展荧光标记微卫星引物，进行PCR扩增实验，获取亲本和子代的微卫星分型信息，获得家系中亲本和子代的基因型数据，最后开展亲子鉴定分析，分析亲本和子代基因型间的相关性，从而确定子代与亲本间的亲子关系关系。
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
(1)本发明利用荧光标记的微卫星位点与毛细管电泳技术相结合，依据高通量测序的微卫星分型，对岩原鲤家系进行了亲子分析；
(2)本发明根据PCR产物大小的范围，将20个引物进一步分成10个小组合，既保证了微卫星分型数据的准确、互不干扰，而且按照扩增产物大小进行优化组合，将标记两种不同颜色荧光物质(如FAM、HEX)的引物扩增的PCR产物混合为一个基因型分析样品，相比单个微卫星PCR扩增的基因型分析样品，双重PCR的基因型分析具有省时高效、经济节约的优点。
(3)本发明提供的微卫星位点引物针对的20个多态性微卫星位点，主要为三碱基、四碱基或五碱基重复单元的位点，其扩增效果稳定、清晰，为后期数据规整提供了较客观的依据。
(4)本发明的建立为岩原鲤繁殖群体的家系管理、群体遗传变异研究和增殖放流效果评估提供了一种新的技术手段。
附图说明
图1为组合1(位点Prora002和Prora106)微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为144/148、212/217)、父本Q01(基因型分别为144/148、212/217)、母本Q03F(基因型分别为144/148、212/212))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；
图2为组合5(位点Prora074和Prora055)微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为178/183、243/243)、父本Q01(基因型分别为173/183、238/243)、母本Q03F(基因型分别为173/178、243/243))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；
图3为组合10(位点Prora102和Prora079)微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为170/170、279/282)、父本Q01(基因型分别为167/170、279/282)、母本Q03F(基因型分别为170/170、282/282))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律。
具体实施方式
实施例：
下面结合实例，对本发明作进一步说明。
岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法，其步骤是：
(1)提取岩原鲤个体样本的基因组DNA：将经过人工配对获取的家系4尾亲本和86尾子代鱼苗的样品取出来，按照高盐法提取基因组DNA。具体步骤为：剪取0.5g左右的鳍条组织(子代鱼苗个体用全部鱼苗用做)，用双蒸水洗净保存样品沾附的酒精，充分剪碎，放入1.5mL离心管中；向离心管中加入500μL的细胞裂解液和6μL的蛋白酶K，在55℃水浴过夜消化，前30分钟摇动数次；加500μL氯化钠(4.5mol/L)，300μL氯仿，摇床中速混匀20分钟，在13000rpm，10℃下离心10分钟；转移上清液到新管(大概850μL左右)，加595μL无水异丙醇，摇床中速混匀20分钟，在13000rpm，10℃下离心10分钟，倒掉上清；加500μL 75％的乙醇，在55℃水浴消化5分钟，在13000rpm，10℃下离心20分钟，倒掉上清；将离心管置于超净工作台中干燥1小时，加入50～100μL的TE 8.0，4℃过夜溶解DNA，放置于-20℃冰箱保存备用。
(2)多态性微卫星位点引物的获得：对20个微卫星位点设计合成系列上、下游引物，并分别对8个岩原鲤个体(步骤(1)提取的基因组DNA)进行PCR扩增，筛选出扩增稳定、结果清晰，特异性强、杂合度高的引物。其PCR反应体系为：5.0uL 2×Power Taq PCR预先混合液(主要成分为0.1U/μl Taq DNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mM MgCl2，以及0.4mMdNTPs)、1.0uL模板基因组DNA(浓度30-50ng/uL)、上下游扩增引物各0.4uL(浓度10uM)，加3.2uL ddH2O至总体积10uL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touch down)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。获得的PCR产物进行定量稀释后，取1ulPCR稀释产物，加入7ul甲酰胺(含4‰荧光内标LIZ500)变性后，在ABI 3730xl DNA测序仪上进行毛细管荧光电泳检测和基因分型。本发明中的20对可用岩原鲤微卫星引物：Prora002、Prora106、Prora089、Prora003、Prora048、Prora103、Prora066、Prora071、Prora074、Prora055、Prora085、Prora100、Prora096、Prora075、Prora093、Prora050、Prora098、Prora054、Prora102、Prora079。有关岩原鲤微卫星位点，重复单元、引物序列及退火变性信息，请见表1；
表1 20个微卫星位点信息表
本发明对每对引物进行了具体验证，结果表明各引物均符合孟德尔分离定律，其中：以位点组合1(位点Prora002和Prora106)，组合5以及组合10为例进行具体分析如下：图1为组合1(位点Prora002和Prora106)的微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为144/148、212/217)、父本Q01(基因型分别为144/148、212/217)、母本Q03F(基因型分别为144/148、212/212))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；图2为组合5(位点Prora074和Prora055)微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为178/183、243/243)、父本Q01(基因型分别为173/183、238/243)、母本Q03F(基因型分别为173/178、243/243))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律；图3为组合10(位点Prora102和Prora079)微卫星分型图(依次为子代个体Z05(基因型分别为170/170、279/282)、父本Q01(基因型分别为167/170、279/282)、母本Q03F(基因型分别为170/170、282/282))，子一代两个等位基因分别来自父本和母本，符合孟德尔分离定律。
(3)荧光标记的微卫星引物进行PCR扩增：将步骤(2)中的20对微卫星引物按照PCR产物大小，两对引物组合成一个组合，共计组成10个组合，将每个组合中的两个引物的正向引物的5’端分别标记FAM和HEX荧光物质，利用标记荧光引物对步骤(1)获得的DNA基因组进行梯度PCR扩增，其PCR反应体系为：5.0uL 2×Power Taq PCR预先混合液(主要成分为0.1U/μL Taq DNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mM MgCl2，以及0.4mM dNTPs)、1.0uL模板基因组DNA(浓度30-50ng/uL)、上下游扩增引物各0.4uL(浓度10uM)，加3.1uL ddH2O至总体积10uL。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touch down)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。获得的PCR产物进行定量稀释后，取1ul PCR稀释产物(可按下表中的引物组合将两个不同颜色荧光引物获得的PCR产物混合上样)，加入7ul甲酰胺(含4‰荧光内标LIZ 500)变性后，在ABI 3730xl DNA测序仪上进行毛细管荧光电泳检测，采用软件读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型的原始数据。依据测序仪获得的分型结果，利用软件GeneMarker v 2.2.0(Holland and Parson，2011)读取个体等位基因大小，并依据微卫星的重复单元组成进行人工校正。
引物组合如下：
(4)岩原鲤家系的亲子鉴定分析：对步骤(3)获取的人工校对后的基因型数据，利用软件Cervus 3.0.7(Kalinowski et al.,2010)对亲本和子代数据进行等位基因频率计算、模拟分析和亲子关系分析，通过待测子代与亲本间的基因型似然率(log Likelihoodratio，LOD)值来分析其相关性，并在95％置信水平下，确定待测子代与亲本间的关系。结果显示，对双亲未知时单亲本而言，20个位点的非亲权累积排除概率(NE-1P)为0.96143838；对已知单亲基因型时的另一亲本而言，20个位点的非亲权累积排除概率(NE-2P)为0.99762913；当双亲未知时的父母本组合而言，20个位点的非亲权累积排除概率(NE-PP)为0.99995034。岩原鲤20个微卫星位点遗传多样性和排除概率信息，详见表2。为确保鉴定结果准确，依据LOD值大于0，且与家系记录数据相一致，才能确认为亲子关系。结果显示，86尾子代中有80尾子代个体确认了亲子关系，鉴定准确率为93.02％。以上结果表明，利用本发明的基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其方法能高效快捷实现岩原鲤家系的亲子鉴定分析、种质管理和增殖放流效果评估的要求。
表2.岩原鲤20个微卫星位点遗传多样性和非亲权排除概率信息
注：样本量为86尾；偏离哈迪温伯格平衡检验，***极显著，NS，不显著，ND，不确定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所
<120>岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星PCR鉴定方法
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora074 F
<400> 17
TGCTTTGTTCTGTTTGAGTCTG
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora074 R
<400> 18
CTCTTTTCAGCTTCATTTCCA
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora075 F
<400> 19
CCTCGCCATCTTTCACATTT
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora075 R
<400> 20
AAAGTTGGATGCAATAGTGGAC
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> Prora079 F
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TTGCAATCAAGCTGTTGTCAG
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora079 R
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GGCCCTTGTGTTTCCTCATA
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora085 F
<400> 23
TTCTAGCTGAAAGGCCTCAAA
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora085 R
<400> 24
TTTTCATTGTTATCTTTCATTGTTATC
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora089 F
<400> 25
CCTTTAAGTGAATGTTAATGGATGC
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora089 R
<400> 26
ACAAAACACATTCTTTGTCAACTTTT
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora093 F
<400> 27
TGGGATATGGCTCATAACCTTAG
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora093 R
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TGCAGCACATTACTGAGGATG
<210> 29
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora096 F
<400> 29
CCCCAAACTTTTGGATAGCA
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora096 R
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GGGGTTCTCAAGATGGGTCT
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora098 F
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GCTGTGTTGTGGGCTCTGTA
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora098 R
<400> 32
TGGTGACACACTCACCACCT
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora100 F
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TGGTCAGGTCTCCTGCTAAGA
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora100 R
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TGAAGAAACGGCAATTAACACA
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora102 F
<400> 35
TTCTTCAACCCAATTCCTGC
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora102 R
<400> 36
TGCATAGCAGCAGAGGCTAA
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora103 F
<400> 37
TTTCAATGAACCATAGACAGACAGA
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora103 R
<400> 38
TAGCTCCCATCAGTGCCTCT
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora106 F
<400> 39
AGTTGCTTTGCAACGATTTG
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Prora106 R
<400> 40
TCATCTCTCTAATTGTCACACGTC
Claims (10)
1.基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定用引物组，其特征在于：分别为：Prora002、Prora003、Prora048、Prora050、Prora054、Prora055、Prora066、Prora071、Prora074、Prora075、Prora079、Prora085、Prora089、Prora093、Prora096、Prora098、Prora100、Prora102、Prora103、Prora106引物，各引物序列如下表：
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：每对引物的正向引物的5’端标记有荧光物质，所述的荧光物质选自FAM或HEX。
3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定用引物组分成10个组合；10个组合分别如下：组合1为Prora002引物和Prora106引物，组合2为Prora089引物和Prora003引物，组合3为Prora048引物和Prora103引物，组合4为Prora066引物和Prora071引物，组合5为Prora074引物和Prora055引物，组合6为Prora085引物和Prora100引物，组合7为Prora096引物和Prora075引物，组合8为Prora093引物和Prora050引物，组合9为Prora098引物和Prora054引物，组合10为Prora102引物和Prora079引物。
4.一种基于微卫星标记的岩原鲤亲子鉴定试剂盒，包括Taq酶PCR预先混合液、权利要求1所述的岩原鲤亲子鉴定用的引物组，其中Taq酶PCR预先混合液主要成分为0.1U/μl TaqDNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mM MgCl2，以及0.4mM dNTPs。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述的岩原鲤亲子鉴定试剂盒还包括双蒸水。
6.一种微卫星PCR鉴定方法，包括以下步骤：
(1)提取岩原鲤个体样本的基因组DNA；
(2)PCR扩增：将岩原鲤亲子鉴定用引物组中的的20对微卫星引物)中的正向引物的5’端标记上荧光物质，利用上述引物组中的各对引物对步骤(1)获得的DNA基因组进行梯度PCR扩增，扩增产物在测序仪上进行毛细管电泳，读取每个个体的等位基因大小，获取基因分型数据；
(3)岩原鲤家系的亲子鉴定分析：基于步骤(3)获取的基因型数据进行亲本和子代数据分析，根据子代基因型和亲本基因型之间的相关性，确定子代与亲本间的亲子关系。
7.根据权利要求6所述的微卫星PCR鉴定方法，其特征在于：所述的PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃→52℃梯度温度(touch down)退火30s，72℃延伸30s，进行10个循环；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行22个循环；最后72℃再延伸20min。
8.根据权利要求6所述的微卫星PCR鉴定方法，其特征在于：所述的PCR反应体系为：5.0uL Taq酶PCR预先混合液(主要成分为0.1U/μl Taq DNA聚合酶、2X PCR反应缓冲液、3mMMgCl2，以及0.4mM dNTPs)、1.0uL岩原鲤基因组DNA、上下游扩增引物各0.4uL(浓度10uM)，加3.2uL ddH2O至总体积10uL。
9.根据权利要求6所述的微卫星PCR鉴定方法，其特征在于：所述的步骤(1)为：将岩原鲤亲本的鳍条和子代鱼苗个体，采用高盐提取法获得每个个体的基因组DNA，保存备用；岩原鲤基因组DNA的浓度为30-50ng/uL。
10.根据权利要求6所述的微卫星PCR鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中的测序为对如下各组合：组合1(Prora002和Prora106)、组合2(Prora089和Prora003)、组合3(Prora048和Prora103)、组合4(Prora066和Prora071)、组合5(Prora074和Prora055)、组合6(Prora085和Prora100)、组合7(Prora096和Prora075)、组合8(Prora093和Prora050)、组合9(Prora098和Prora054)、组合10(Prora102和Prora079)，进行组合测序。
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