CN113621709A - 黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法，该方法包括：1）保留黄河鲤鱼父本或母本的DNA；2）对黄河鲤鱼父本或母本进行放流；3）在放流的水域捕捞流放的黄河鲤鱼并提取被捕捞所有黄河鲤鱼的DNA；4）利用黄河鲤鱼微卫星标记引物对捕捞得到的黄河鲤鱼的DNA进行双重PCR扩增；5）将得到的扩增产物进行电泳分离；统计PCR扩增产物的基因型，根据基因分型结果用CERVUS3.0计算平均排除概率和候选亲本LOD值，确定捕捞个体中放流个体的数量；统计该水域放流个体的占比，评价该次黄河鲤鱼的放流效果。本发明具有准确性好、效率高以及具有巨大的实用价值的优点。
Description
技术领域
本发明属于动物分子遗传学领域，涉及一种黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法。
背景技术
增殖放流就是用人工方式向海洋、江河、湖泊等公共水域放流水生生物苗种或亲体的活动。有些濒危的物种，就是现在水里面很少的、受到保护的这些品种，通过增殖放流的方式可以增加它的数量，起到了对这些濒危物种的保护作用。增殖放流同时可以改善水质和水域的生态环境。根据放流的品种不一样，它的作用也不一样，比如现在放流的一些滤食性的品种，如一些鱼类、贝类，它们可以滤食水中的藻类和浮游生物，通过这种作用可以净化和改善水质。这几年大规模放流水生生物经济物种，放流之后，过一段时间它长大之后渔民再去捕捞，渔民捕捞的产量效益都得到了很大的提高。
微卫星标记，也叫做短串联重复序列(STRs)，是由长度为2-7个碱基的核苷酸序列重复构成的多态性DNA标记，由于重复单位的重复次数在个体间呈高度可变性，因此在同一个基因位点创造了多个不同的等位基因。微卫星分析通常被用来创建遗传图谱，连锁分析以及对遗传性状的追踪。因此，微卫星标记技术已用于家畜禽物种鉴定、性别鉴定、个体识别或群体识别，以及用于建立肉制品溯源系统。但是该技术还没有用于鱼类个体识别。
黄河鲤鱼体态丰满，肉质肥厚，细嫩鲜美，营养丰富。黄河鲤同淞江鲈鱼，兴凯湖鱼、松花江鲑鱼被共誉为我国四大名鱼。黄河是我国第二大河流，全长约5464公里，黄河滩生长着大量的野生杂草可作为鱼类饲料，这些都是发展渔业生产的优越条件。也是历史上盛产优质黄河鲤的主要原因。近些年，黄河鲤鱼的数量有所下降。黄河鲤鱼的增殖放流可以有效解决黄河鲤数量下降的问题。但是黄河鲤的放流效果至今没有科学的评价方法。
发明内容
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种准确性更好，效率也会更高，具有巨大的实用价值的黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种黄河鲤鱼微卫星标记引物，其特征在于：所述黄河鲤鱼微卫星标记引物包括4组微卫星标记引物，4组微卫星标记引物的序列及退火温度分别是：
一种基于如前所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物扩增得到的黄河鲤鱼微卫星标记物。
一种基于如前所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物对黄河鲤鱼的放流效果进行评价的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)保留被放流黄河鲤鱼父本或母本的DNA于-80℃冰箱；
2)对黄河鲤鱼父本或母本进行放流；
3)在放流的水域捕捞步骤2)黄河鲤鱼并提取被捕捞所有黄河鲤鱼的DNA；
4)利用权利要求1所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物对步骤3)所捕捞得到的黄河鲤鱼的DNA进行双重PCR扩增；
5)将步骤4)得到的扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；根据各个个体的基因分型结果用CERVUS3.0计算平均排除概率和候选亲本LOD值，确定捕捞个体中放流个体的数量；统计该水域放流个体的占比，评价该次黄河鲤鱼的放流效果。
作为优选，本发明在步骤3)中的PCR试剂是：PCR mix 15ul，上下游引物各1ul，DNA模板3ul，超纯水3ul，前述的黄河鲤鱼微卫星标记引物中每组黄河鲤鱼微卫星标记引物的两对引物的上下游引物各0.5-2ul，Taq酶0.1-0.5ul，DNA模板1-5ul，超纯水10-15ul；
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度60℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
基于如前所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物在测量黄河鲤鱼个体之间的亲缘关系时的应用。
本发明的优点是：
本发明提供了一种黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法，该黄河鲤鱼微卫星标记引物涉及4组(8对)黄河鲤鱼微卫星标记引物，该方法是基于微卫星标记引物所得到的双重PCR反应体系。本方法提供的微卫星具有高度的多态性和稳定，可以在黄河鲤鱼中扩出清晰的条带。本方法利用分子手段辅助或替代传统标记手段评价黄河鲤鱼放流的效果，准确性更好，效率也会更高，具有巨大的实用价值。
附图说明
图1是微卫星标记不同引物PCR凝胶电泳图；
图2是双重微卫星不同引物PCR凝胶电泳图。
具体实施方式
本发明在于提供一种黄河鲤鱼的放流效果评价方法。具体实施方式如下：
实施例1
黄河鲤鱼DNA的提取
1)取黄河鲤鱼鳍条组织0.5g，剪碎置于1.5mL Eppendorf管中，标编号，先后加入450uL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCI，lmmol/L EDTA，pH8.0)、35uL SDS(10％)，最后加入15uL蛋白酶K(0.2％)颠倒混匀。
2)提前打开水浴锅，加适量水，设定温度为55℃，待水温恒定后将混匀后的放入55℃水浴锅中，每隔30min取出颠倒混匀一次，直到溶液澄清透明，大约需要2h。
3)取出，加入RnaseA l ul，置于水浴锅37℃温浴1h。
4)取出Eppendorf管，加入等体积(约700uL)Tris饱和酚，在DNA混合仪上振荡混匀30min，注意不可左右振荡。
5)将Eppendorf管置于离心机，设定4℃下12000r/min离心10min，结束后使用移液枪将上清液转移入另一个干净的Eppendor管中，标编号。
6)在上清液中加入等体积酚仿醇混合物(苯酚、氯仿、异戊醇体积比为25：24：1)，置于DNA混合仪上振荡混匀15min。重复步骤5)。
7)在上清液中加入等体积氯仿约500ul，置于DNA混合仪上振荡混匀15min后，重复步骤5)。
8)在上清液中加入-20℃预冷的无水乙醇lmL沉淀DNA，离心机12000r/min离心5min后去上清液。
9)先加入70％乙醇洗涤两次，再加入无水乙醇洗涤一次，干燥后加入200uL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCI，lmmol/L EDTA，pH8.0)，溶解充分。用分光光度仪检测浓度，然后将各DNA样品稀释成50ng/uL的工作液。
实施例2
筛选微卫星标记
从NCBI下载鲤鱼基因组，利用微卫星搜索软件对鲤鱼基因组进行微卫星位点筛选，设置好搜索条件，每个重复单元不少于重复7次，每个重复单元为两碱基、三碱基和四碱基。成功从鲤鱼基因组中筛选出1000个微卫星位点。利用引物设计软件对这1000个微卫星位点序列设计引物。
利用实施例1提取的黄河鲤鱼DNA筛选这1000对微卫星标记引物，筛选出条带清晰，多态性高的位点。建立PCR反应体系为25ul：10mmol/L dNTP 1ul，10xbuffer 2.5ul，25mmol/L MgCl2 2ul，8p mol/ul两侧引物各0.75ul，5U/ul Taq DNA聚合酶0.2ul，50ng/ul的黄河鲤鱼DNA模板2ul，用超纯水补足至25ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s，72℃45s，30个循环；72℃延伸7min；产物置于4℃保存。将PCR产物放置于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳150分钟，电压为220V。然后对聚丙烯酰胺胶进行银染，然后拍照。选择条带清晰，多态性高的微卫星标记位点。如图1所示，图片中的结果显示这些引物为结果较好的引物。
实施例3
双重PCR微卫星标记筛选
根据实施例2的筛选出来的微卫星引物的PCR产物大小，把两个PCR产物大小有区别的微卫星标记随机组成一组双重PCR反应体系，建立PCR反应体系为25ul：10mmol/L dNTP2ul，10xbuffer 4ul，25mmol/L MgCl2 3ul，两对8p mol/ul两侧引物各0.75ul，5U/ul TaqDNA聚合酶0.5ul，50ng/ul的DNA模板2ul，用超纯水补足至25ul。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，复性30s，72℃45s，30个循环；72℃延伸7min；产物置于4℃保存。将PCR产物放置于10％聚丙烯酰胺凝胶电泳150分钟，电压为220V。然后对聚丙烯酰胺胶进行银染，然后拍照。选择条带清晰，多态性高的双重PCR反应组合，如图2所示。图2中的两对引物都是条带清晰，多态性高的位点，并且该两个位点组合后不产生冲突，没有引物二聚体，产生的PCR产物互不影响。最终从实施例2中筛选出的微卫星引物中再筛选出4组配合较好的双重PCR引物组合，如表1所示。
表1
实施例4
利用双重PCR体系确定捕捞的黄河鲤鱼的基因型
对所有的捕捞的黄河鲤鱼进行取样，提取DNA。用实施例3筛选出来的双重PCR标记引物对所有黄河鲤鱼DNA分别进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺胶电泳。然后进行银染。根据银染结果确定每个黄河鲤鱼的基因型。结果如表2所示。表2的第一行是被捕捞黄河鲤鱼个体的身份代码，比如2256为该黄河鲤鱼的身份代码，其中，346/350表示正反两条条带大小。第一列为本发明提供的8个微卫星位点。
表2黄河鲤鱼的基因型
| 2256 | 8866 | 5768 | 8865 | 6889 | |
| HHLY1 | 346\350 | 324\328 | 330\340 | 340\344 | 350\350 |
| HHLY2 | 460\466 | 452\456 | 454\454 | 452\458 | 450\450 |
| HHLY3 | 242\250 | 240\244 | 234\238 | 234\234 | 244\250 |
| HHLY4 | 360\370 | 366\374 | 376\378 | 360\368 | 372\372 |
| HHLY5 | 260\260 | 268\268 | 262\274 | 264\264 | 266\274 |
| HHLY6 | 450\450 | 444\456 | 444\448 | 450\458 | 454\454 |
| HHLY7 | 230\230 | 232\232 | 226\234 | 222\228 | 220\234 |
| HHLY8 | 480\486 | 480\490 | 476\484 | 480\488 | 490\498 |
实施例5
黄河鲤鱼放流效果评价
1)保留被放流黄河鲤鱼父本或母本的DNA于-80℃冰箱；
2)待放流半年后，在放流的水域用刺网进行捕捞黄河鲤，回捕放流水域的黄河鲤鱼156尾，提取这156尾黄河鲤鱼的DNA，并提取父本和母本DNA；
3)利用要求1所示的本方法提供的4组黄河鲤鱼微卫星标记的双重PCR反应体系中的微卫星引物对156尾黄河鲤鱼和父母本进行PCR扩增，方法中PCR试剂为：PCR mix 15ul，上下游引物各1ul，DNA模板3ul，超纯水3ul。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度60℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存；
4)把PCR扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；
5)根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；
6)根据各个个体的基因分型结果用CERVUS3.0计算确定捕捞个体中有10尾为被放流黄河鲤鱼父本或母本子代的数量；
7)统计该水域放流个体的占比，评价该次黄河鲤鱼的放流效果，占比的计算方法为(被放流黄河鲤鱼父本或母本子代的数量/捕捞个体数量)×100％。即回捕黄河鲤鱼中，放流个体占比为6.4％。
序列表
<110> 武汉中科瑞华生态科技股份有限公司
广州草木蕃环境科技有限公司
中国科学院水生生物研究所
<120> 黄河鲤鱼微卫星标记引物及黄河鲤鱼的放流效果评价方法
<141> 2021-07-09
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacacactca ctcacacac 19
Claims (5)
1.一种黄河鲤鱼微卫星标记引物，其特征在于：所述黄河鲤鱼微卫星标记引物包括4组微卫星标记引物，4组微卫星标记引物的序列及退火温度分别是：
2.一种基于如权利要求1所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物扩增得到的黄河鲤鱼微卫星标记物。
3.一种基于如权利要求1所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物对黄河鲤鱼的放流效果进行评价的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
1)保留被放流黄河鲤鱼父本或母本的DNA于-80℃冰箱；
2)对黄河鲤鱼父本或母本进行放流；
3)在放流的水域捕捞步骤2)黄河鲤鱼并提取被捕捞所有黄河鲤鱼的DNA；
4)利用权利要求1所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物对步骤3)所捕捞得到的黄河鲤鱼的DNA进行双重PCR扩增；
5)将步骤4)得到的扩增产物在聚丙烯酰胺胶上进行电泳分离；根据分离结果统计PCR扩增产物的基因型；根据各个个体的基因分型结果用CERVUS3.0计算平均排除概率和候选亲本LOD值，确定捕捞个体中放流个体的数量；统计该水域放流个体的占比，评价该次黄河鲤鱼的放流效果。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中的PCR试剂是：PCR mix15ul，上下游引物各1ul，DNA模板3ul，超纯水3ul，权利要求1中的黄河鲤鱼微卫星标记引物中每组黄河鲤鱼微卫星标记引物的两对引物的上下游引物各0.5-2ul，Taq酶0.1-0.5ul，DNA模板1-5ul，超纯水10-15ul；
PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火温度60℃复性30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃延伸10min；4℃保存。
5.基于权利要求1所述的黄河鲤鱼微卫星标记引物在测量黄河鲤鱼个体之间的亲缘关系时的应用。
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| JP2006067854A (ja) * | 2004-08-31 | 2006-03-16 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | マダイ由来マイクロサテライトｄｎａ及びそれらを用いた個体識別法 |
| KR20090069898A (ko) * | 2007-12-26 | 2009-07-01 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | 넙치 미세위성마커를 이용한 개체식별 및 친자확인 방법 |
| CN111394478A (zh) * | 2020-04-27 | 2020-07-10 | 西安理工大学 | 一种pcr微卫星引物及其用于大黄鱼亲子鉴定的方法 |
| CN112126693A (zh) * | 2020-11-09 | 2020-12-25 | 水利部中国科学院水工程生态研究所 | 岩原鲤亲子鉴定试剂盒及其微卫星pcr鉴定方法 |
| CN112795663A (zh) * | 2021-02-07 | 2021-05-14 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 用于区分黄河鲤鱼与非黄河鲤鱼鲤属的引物对组合物、试剂盒及方法 |
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2021
- 2021-07-09 CN CN202110782011.XA patent/CN113621709B/zh active Active
Patent Citations (5)
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| 陈建军: "黄河鲤性别特异片段的鉴定与性腺差异cDNA文库的构建及相关ESTS功能分析", 中国博士优秀学位论文全文数据库农业科学辑, pages 052 - 1 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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