CN111394478A - 一种pcr微卫星引物及其用于大黄鱼亲子鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PCR微卫星引物，包括引物位点1～10，引物位点的引物序列及退火温度。本发明还公开了一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，首先，选择适宜的大黄鱼待测样品，提取大黄鱼待测样品的DNA；采用PCR微卫星引物位点1～10对大黄鱼待测样品的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；在体积百分数为12％的聚丙烯酰胺胶上对PCR扩增产物进行电泳分离；最后统计PCR微卫星引物位点1～10中PCR扩增产物的基因型；根据基因型进行大黄鱼待测样品之间的亲子鉴定。解决了现有的大黄鱼近亲交配、种群遗传多样性下降的问题。
Description
技术领域
本发明涉及大黄鱼亲子鉴定技术领域，具体涉及一种PCR微卫星引物，本发明还涉及上述PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法。
背景技术
大黄鱼，体延长，侧扁，体长约40～50cm，金黄色，尾柄细长，鳞较小，背鳍起点至侧线间具8～9行鳞，椎骨25～27枚。平时栖息较深海区，4-6月向近海洄游产卵，秋冬季又向深海区迁移。大黄鱼的鳔能发声，渔民常借此估测鱼群的大小，是我国一种重要的经济鱼类。我国沿海大黄鱼的产卵场约10个，有江苏的吕泗洋，浙江的岱衢洋、大戢洋、猫头洋、大目洋及洞头洋，福建的官井洋、东引渔场，广东的南澳渔场和硇洲岛渔场。大黄鱼一生能多次重复产卵，生殖期中一般排卵2～3次。怀卵量与个体大小成正比，由10～275万粒不等，一般为20～50万粒。卵浮性，球形，卵径1.19～1.55毫米，卵膜光滑，有一无色油球，直径为0.35～0.46毫米。受精卵在水温18℃时约经50小时孵出仔鱼。各地方群的年龄组成不同，各群中个体的寿命、性成熟年龄也不相同。大黄鱼最大个体全长可达755毫米，重3.8千克。
近年来，由于过度捕捞、水利工程建设等人类活动，大黄鱼的资源量急剧下降。从受威胁程度、遗传多样性、物种价值等方面进行定量评估来看，大黄鱼被列为低危鱼类。微卫星标记是目前研究濒危动物保护遗传学中最理想的一类方式。微卫星具有多态性高、共显性遗传、遍布整个基因组等优势，广泛应用于动物遗传性研究。亲子鉴定，是指运用生物学、遗传学以及有关学科的理论和技术，根据遗传性状在子代和亲代之间的遗传规律，判断被控的父母和子女之间是否亲生关系的鉴定。
在大黄鱼遗传育种的研究过程中，苗种的来源比较杂乱，仅采用物理和形态进行个体比较很难区分不同的来源。传统方法是在对大黄鱼大规模的群体选育或家系选育时，会对大黄鱼个体打标进行区别，但是标容易脱落，造成大黄鱼个体混乱，在实施的过程中有很大的限制。为了明确大黄鱼在群体选育或家系选育时个体亲本的具体信息，急需一种有效的大黄鱼亲子鉴定方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种PCR微卫星引物，解决了现有的大黄鱼近亲交配、种群遗传多样性下降的问题。
本发明的另一目的是提供上述PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，解决了现有的大黄鱼近亲交配、种群遗传多样性下降的问题。
本发明所采用的一种技术方案是一种PCR微卫星引物，包括引物位点1～10，引物位点的引物序列及退火温度如下所示：
本发明所采用的另一种技术方案是上述一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，具体按照以下步骤实施：
步骤1，选择适宜的大黄鱼待测样品，提取大黄鱼待测样品的DNA；
步骤2，采用PCR微卫星引物位点1～10对大黄鱼待测样品的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3，在体积百分数为12％的聚丙烯酰胺胶上对PCR扩增产物进行电泳分离；
步骤4，统计PCR微卫星引物位点1～10中PCR扩增产物的基因型；根据基因型进行大黄鱼待测样品之间的亲子鉴定。
本发明的特点还在于：
PCR扩增的反应体系：
总体积PCR反应体系25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl21.5μL，PCR反应体系的上下游引物各1μL，Taq酶0.4μL，DNA模板3μL，超纯水15.1μL。
PCR扩增的程序为：
95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。
步骤3中，聚丙烯酰胺胶为非变性聚丙烯酰胺胶。
步骤4中，采用BIO-PROFIL软件进行基因型分型，采用CERVUS软件计算累计排除概率。
本发明的有益效果是：
(1)、本发明一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，可以快速进行大黄鱼个体之间的亲子鉴定，继而确定个体之间的亲缘关系，避免了群体之间近亲繁殖；本发明提供的PCR微卫星引物和反应体系具有高度的多态性和稳定性，具有巨大的实用价值。
(2)、本发明一种PCR微卫星引物，将其建立大黄鱼亲子鉴定技术，可以有效防止近亲交配，避免某些大黄鱼亲本过度繁殖所带来的种群遗传多样性下降的风险；本发明一种PCR微卫星引物使得大黄鱼资源量得以较快恢复与增殖，从而更好的保护大黄鱼。
附图说明
图1是本发明一种PCR微卫星引物筛选PCR扩增产物的电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提出了一种PCR微卫星引物，其特征在于，包括引物位点1～10，引物位点的引物序列及退火温度如下所示：
本发明还提出了上述PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，选择适宜的大黄鱼待测样品，提取大黄鱼待测样品的DNA；
步骤2，采用PCR微卫星引物位点1～10对大黄鱼待测样品的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
其中，PCR扩增的反应体系：
总体积PCR反应体系25μL，，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，PCR反应体系的上下游引物各1μL，Taq酶0.4μL，DNA模板3μL，超纯水15.1μL；
PCR扩增的程序为：
95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；
步骤3，在体积百分数为12％的聚丙烯酰胺胶上对PCR扩增产物进行电泳分离；聚丙烯酰胺胶为非变性聚丙烯酰胺胶；
本发明一种PCR微卫星引物位点筛选PCR扩增产物的电泳图，如图1所示，从图1可以得出，PCR微卫星引物位点扩增出的基因型条带清晰，稳定性高，可以应用于大黄鱼的遗传多样性分析。
步骤4，统计PCR微卫星引物位点1～10中PCR扩增产物的基因型；根据基因型进行大黄鱼待测样品之间的亲子鉴定；
采用BIO-PROFIL软件进行基因型分型，采用CERVUS软件计算累计排除概率。
实施例
(1)大黄鱼待测样品的DNA提取
具体按照以下步骤实施：
步骤1、采集大黄鱼亲本鳍条样本2尾(雌雄各1尾，按1：1进行繁殖)及相应的子代个体样本10尾，剪取鳍条或其他组织样本5mg，经双蒸水洗涤后，用小剪刀充分剪碎，放入1.5mL离心管a中，加入500μL裂解液，在55℃下消化5～8h，在消化期间加入10μL蛋白酶k溶液；
步骤2、将体积比为25:24:1的酚、氯仿和异戊醇混合均匀，得到混合液，在离心管a中加入500μL的混合液，采用静音混合仪将离心管a内的溶液混合均匀，再将离心管a装入离心机，以8000rpm离心10min，取上层液至离心管b中，弃滤液；
步骤3、重复步骤2，2～3次，直至两相分界面处无明显的变性蛋白质；
步骤4、在离心管b中加入1000μL的冷无水乙醇，缓慢颠倒混匀，置于-20℃下沉淀40min；
步骤5、采用静音混合仪将离心管b缓慢颠倒，混合均匀，将离心管b装入离心机，以12000rpm离心10min，吸弃上清液，再在离心管b加入800μL，体积分数为70％的乙醇清洗，以12000rpm离心10min，吸弃上清；
步骤6、将离心管b置于超净工作台内风干，加入约50μL TE，室温溶解，待溶解后，用体积分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测大黄鱼待测样品的DNA浓度，将其浓度稀释至100ng/μL，置于-20℃冰箱中保存，备用。
(2)一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法
步骤1，采用PCR微卫星引物位点1～10对大黄鱼待测样品的DNA(浓度为100ng/μL，取1～2μL)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
PCR扩增的反应体系：
总体积PCR反应体系25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl21.5μL，上、下游引物各1μL，Taq酶0.4μL，DNA模板3μL，超纯水15.1μL；
PCR扩增的程序为：
95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存；
步骤2，在质量百分数为12％的聚丙烯酰胺胶上对PCR扩增产物进行电泳分离；
步骤3，亲子鉴定
统计PCR微卫星引物位点1～10中PCR扩增产物的基因型，如表1所示；根据上述基因型对大黄鱼待测样品之间进行亲子鉴定。
具体用到的软件为Cervus3.0软件，计算亲本和子代的累计排除概率，通过模拟10000个子代和10对亲本，置信度为95％时，10个PCR微卫星引物位点的理论鉴定率达到了99.9％。根据本实验的微卫星基因型，在置信度为95％时，全部子代都能找到亲本。因此，本发明提供的PCR微卫星引物位点和亲子鉴定方法能够实现大黄鱼的亲子鉴定。
表1、大黄鱼的基因型数据
从表1可以得出，利用本发明的PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，能高效快捷实现大黄鱼家系的亲子鉴定分析，准确率为100％，满足大黄鱼种质鉴定、家系管理和人工增殖放流效果评估的要求。
序列表
<110> 西安理工大学
<120> 一种PCR微卫星引物及其用于大黄鱼亲子鉴定的方法
<130> 2020
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agggccaagt gattacatt 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 17
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<400> 5
catccagtgc cagtaaacgg 20
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<211> 22
<212> DNA
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<211> 17
<212> DNA
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<212> DNA
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gctgaggctt cttggctgt 19
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<400> 19
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<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
accgtggtga tgaagtgtag 20
Claims (6)
1.一种PCR微卫星引物，其特征在于，包括引物位点1～10，所述引物位点的引物序列及退火温度如下所示：
2.如权利要求1所述的一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：
步骤1，选择适宜的大黄鱼待测样品，提取所述大黄鱼待测样品的DNA；
步骤2，采用所述PCR微卫星引物位点1～10对大黄鱼待测样品的DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
步骤3，在体积百分数为12％的聚丙烯酰胺胶上对所述PCR扩增产物进行电泳分离；
步骤4，统计PCR微卫星引物位点1～10中所述PCR扩增产物的基因型；根据所述基因型进行大黄鱼待测样品之间的亲子鉴定。
3.根据权利要求2所述的一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系：
总体积PCR反应体系25μL，10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 0.5μL，MgCl2 1.5μL，所述PCR反应体系的上下游引物各1μL，Taq酶0.4μL，DNA模板3μL，超纯水15.1μL。
4.根据权利要求3所述的一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：
95℃预变性3min；95℃变性30s，退火温度56℃复性30s，72℃延伸30s，进行30个循环；最后72℃延伸10min；4℃保存。
5.根据权利要求2所述的一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，步骤3中，所述聚丙烯酰胺胶为非变性聚丙烯酰胺胶。
6.根据权利要求2所述的一种PCR微卫星引物用于大黄鱼亲子鉴定的方法，其特征在于，步骤4中，采用BIO-PROFIL软件进行基因型分型，采用CERVUS软件计算累计排除概率。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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