CN114592070A - 一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，包括以下步骤：(1)黄鳍鲷全同胞家系建立；(2)黄鳍鲷亲本和子代基因组DNA提取；(3)多态性微卫星引物筛选；(4)荧光标记8重PCR体系开发和扩增；(5)微卫星位点基因分型及家系鉴定：(5.1)确定亲本和家系个体在各微卫星位点上对应的基因型；(5.2)家系鉴定。该方法首次在黄鳍鲷上利用荧光修饰的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，鉴定准确率高，快速，成本低。还公开了上述方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定、分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择方面的应用。
Description
技术领域
本发明属于鱼类遗传育种技术领域，具体涉及一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法及应用。
背景技术
黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)，又称为黄脚立、赤翅、鲛腊鱼、黄鳍棘鲷。属于鲈形目鲷科鲷属鱼类。体长椭圆形，扁而窄，体高，头部尖，尾双叉形。背鳍、臀鳍、臀鳍、尾鳍的下叶为黄色，背鳍有11根鳍棘。黄鳍鲷适应能力强，海水、咸淡水均生长良好，所以在养殖业中占有重要地位。黄鳍鲷的分布贯穿印度西太平洋，从波斯湾沿着印度海岸到菲律宾，从澳大利亚到日本，我国主要分布广东、福建、广西等沿海城市。黄鳍鲷繁殖亲本主要是野生捕捞或培养数代的种群，没有经过人工选育，其生长速度、抗病能力和其它养殖性能等还未达到良种化的程度，适应集约化养殖能力较弱。因此，尽快开展黄鳍鲷良种选育工作对于黄鳍鲷种群保护和满足当前健康养殖业的迫切需要具有极其重要的意义。
在鱼类遗传育种研究中，清晰的系谱信息对于家系的选育和亲本的管理至关重要。传统的水产动物选择育种中，养殖单位需要对不同的家系进行分养来维持家系信息，所需水体大且不便管理。尤其需要考虑的是，每个分养池之间在环境因子上会存在一些差异，不同的环境因素会使育种相关的遗传参数估计产生偏差。此时可以把不同家系混养在一起，但是需对所有家系进行非常复杂的标记。在混合养殖群体中保持家系信息，大多数畜牧上的研究以物理标记为手段，而物理标记对于水产动物存在操作繁琐、对生长有一定影响及对幼体伤害较大等局限性。分子标记的出现使得混养亲缘关系的鉴定成为可能，以微卫星分型为基础的亲子鉴定技术是目前水产动物系谱确认中应用最广泛最可靠的手段之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，该方法首次在黄鳍鲷上利用荧光修饰的多态微卫星标记建立了亲子鉴定平台，鉴定准确率高，快速，成本低。
本发明的目的还在于提供上述黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定、分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择方面的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)黄鳍鲷全同胞家系建立
利用养殖的黄鳍鲷作为亲本，进行人工繁殖，建立全同胞家系分养，从每个家系中选取仔鱼，作为家系鉴定的样本；
(2)黄鳍鲷亲本和子代基因组DNA提取
选取步骤(1)中黄鳍鲷亲本和仔鱼的鳍条组织，提取亲本和子代的基因组DNA，保存待用；
(3)多态性微卫星引物筛选
从黄鳍鲷转录组测序中筛选获得8个微卫星位点Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y8、Y9、Y10，根据8个微卫星位点，设计8对微卫星引物，分别为引物对Y1、引物对Y2、引物对Y3、引物对Y4、引物对Y6、引物对Y8、引物对Y9和引物对Y10；
(4)荧光标记8重PCR体系开发和扩增
将步骤(3)中筛选出来的8对引物，设计成一个8重PCR体系，在8对引物的正向引物的5’端分别用FAM(蓝色)、HEX(绿色)、TAMRA(粉红)三种不同的荧光基团进行修饰，采用荧光PCR反应对步骤(2)中亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增；
(5)微卫星位点基因分型及家系鉴定
(5.1)确定亲本和家系个体在各微卫星位点上对应的基因型
将步骤(4)中8重PCR扩增产物在测序仪上进行分型；
(5.2)家系鉴定
对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
在上述黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法中：
优选的，步骤(2)中采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。
优选的，步骤(3)中所述引物Y1、引物对Y2、引物对Y3、引物对Y4、引物对Y6、引物对Y8、引物对Y9、引物对Y10的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～16所示。
优选的，步骤(4)中8重PCR体系包括：浓度为10μmol/L的引物对Y1 0.5μL、浓度为10μmol/L的引物对Y2 0.3μL、浓度为10μmol/L的引物对Y3 0.4μL、浓度为10μmol/L的引物对Y4 0.5μL、浓度为5μmol/L的引物对Y6 0.5μL、浓度为5μmol/L的引物对Y8 0.6μL、浓度为5μmol/L的引物对Y9 0.6μL、浓度为5μmol/L的引物对Y10 0.4μL、浓度为100ng/μL的DNA 3μL、ddH2O 6.2μL、
PCR StarMix 12μL、总计25μL。
优选的，步骤(4)中在引物对Y1、引物对Y2、引物对Y3的正向引物的5’端标记荧光物质FAM，在引物对Y4、引物对Y6的正向引物的5’端标记荧光物质HEX，在引物对Y8、引物对Y9、引物对Y10的正向引物的5’端标记荧光物质TAMRA。
优选的，步骤(4)中PCR扩增时，PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
优选的，步骤(5.1)中将步骤(4)中8重PCR扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarker V1.5软件读取每个样品的基因型。
优选的，步骤(5.2)中采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，该结果与已知的实际家系信息进行比较，最终判断家系鉴定的成功。
优选的，步骤(5.2)中采用软件CERVUS 3.0对亲本基因型和子代基因型进行分析时，采用软件CERVUS 3.0计算亲本基因型和子代基因型在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据LOD值鉴定每个家系个体的父母本。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：上述方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定、分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明利用微卫星标记与多重荧光PCR技术的结合，筛选了8个高度多态性微卫星位点，并设计了8对引物，组建了一个8重荧光PCR体系，通过测序仪分型，对黄鳍鲷家系进行个体识别和亲子关系鉴定；
(2)本发明一次可以检测8个位点，相对于简单的单位点检测，效率提高，费用下降为原来八分之一左右；
(3)本发明可应用于黄鳍鲷混养家系的鉴定，在生产中不需要将各家系子代分开饲养，节约了水体和人工管理，降低了成本，同时克服了环境因素所造成的误差，使得亲子鉴定技术可以再生产中大力推广；
(4)本发明选择的微卫星位点等位基因数目较多，多态性高，可以用于黄鳍鲷的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定，也能够用于分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例提供的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)黄鳍鲷家系的建立
从阳江和大亚湾两个地方收集雌雄黄鳍鲷亲本各10尾，进行人工催产繁殖，雌雄配比1:1，建立10个全同胞家系。剪取每个家系亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，并做好家系信息记录，于-20℃保存备用。将10个家系放于循环水系统中分开养殖，待鱼苗孵出45天后，从每个家系中随机选取10尾鱼，用无水乙醇固定，作为家系鉴定的样本。
(2)黄鳍鲷亲本和子代基因组DNA提取；
将亲本和子代的鳍条组织分别放于2mL的离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μL的细胞裂解液(Tris-HCl 100mM，pH 8.0；EDTA 50mm/L，pH 8.0；SDS 1％，pH 8.0；NaCl125mM)，在每个管中加入浓度为20mg/mL的蛋白酶K9μL，放入60℃水浴锅中水浴2-4h，每隔半小时摇动下离心管，直到组织充分裂解。将离心管冷却至室温，加入200μL 7.5M的醋酸铵，充分摇匀，放置于4℃冰箱内冷却5min，12,000rpm 4℃离心10min，取500mL上清液至新1.5mL离心管。加入600mL异丙醇，充分混匀，室温下沉淀1-2min，12,000rpm 4℃离心10min，弃去异丙醇。加入70％的酒精洗涤DNA，12,000rpm 4℃离心5min，弃去70％的酒精。加入无水乙醇，12,000rpm 4℃离心5min，弃去无水乙醇，反复几次，室温干燥约30min，加入100μL双蒸水溶解DNA。用NanoDrop ND-1000紫外分光光度计检测DNA浓度和质量，将各DNA样品稀释至100ng/μL。
(3)多态性微卫星标记筛选：
利用从黄鳍鲷高通量测序分析获得的8个微卫星位点Y1，Y2，Y3，Y4，Y6，Y8，Y9，Y10，在30个黄鳍鲷个体中进行扩增，最终选择8对条带清晰，多态性高的引物作为家系鉴定的引物，设计成一个8重PCR体系，本发明8对微卫星引物分别为：引物对Y1，引物对Y2，引物对Y3，引物对Y4，引物对Y6，引物对Y8，引物对Y9，引物对Y10。
在上述8对微卫星引物的正向引物5’端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，相同荧光修饰的引物扩增出的片段大小范围不相同，具体如下表1所示，
表1.黄鳍鲷8重PCR组合的引物序列及荧光物质
注：F表示正向引物，R表示反向引物，所有荧光物质均标记在正向引物的5’端。
(4)8重PCR条件的开发和扩增
将上述筛选出来的8对引物，组成一个8重PCR，每一对引物的正向引物5’端标记荧光物质，其中：引物对Y1、引物对Y2、引物对Y3标记荧光物质FAM(蓝色)；引物对Y4、引物对Y6标记荧光物质HEX(绿色)；引物对引物对Y8、引物对Y9、引物对Y10标记荧光物质TAMRA(粉红)。8重PCR体系总体系具体见表2：
表2.黄鳍鲷亲子鉴定PCR反应体系
PCR反应程序设定：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR结束后，取5μL在琼脂糖凝胶上电泳检测，送至商业公司采用ABI 3730XL进行基因型分型。
(5)微卫星位点基因分型及亲子鉴定分析
扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarkerV1.5软件读取个体的基因型，采用软件CERVUS 3.0计算亲本和子代在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据LOD值鉴定每个家系个体的父母本(见表3)。
表3. 8个微卫星位点的遗传多样性统计及排除概率
| Primer名称 | k | HO | HE | PIC | Excl 1 | Excl 2 | HW | F(Null) |
| Y1 | 20 | 0.916 | 0.915 | 0.890 | 0.338 | 0.281 | NS | -0.0043 |
| Y2 | 14 | 0.894 | 0.893 | 0.852 | 0.422 | 0.266 | NS | -0.0215 |
| Y3 | 13 | 0.892 | 0.891 | 0.870 | 0.385 | 0.235 | NS | -0.0158 |
| Y4 | 17 | 0.908 | 0.906 | 0.884 | 0.366 | 0.217 | NS | +0.0079 |
| Y6 | 10 | 0.842 | 0.841 | 0.849 | 0.321 | 0.269 | NS | +0.0074 |
| Y8 | 16 | 0.905 | 0.902 | 0.867 | 0.389 | 0.247 | NS | +0.0289 |
| Y9 | 12 | 0.890 | 0.888 | 0.866 | 0.377 | 0.231 | NS | +0.0258 |
| Y10 | 14 | 0.894 | 0.892 | 0.888 | 0.378 | 0.239 | NS | +0.0278 |
注：k为等位基因数目，Ho为观察杂合度，HE为期望杂合度，PIC为多态含量，Excl 1为双亲未知时排除率，Excl 2为已知单亲时排除率，HW为哈迪温伯格平衡检验，NS表示偏离不显著，F(Null)表示无效等位基因频率。
(5)家系鉴定结果
在使用CERVUS 3.0模拟分析中，用10对亲本模拟产生10000个子代，在80％和95％的置信区间范围内亲子鉴定成功率均可达到100％，在实际鉴定的10个家系100个个体中，有1例没有找到真正的母本父本，发生错配。从候选亲本中找到真正父母亲的概率为99％，能够满足遗传育种中系谱分析和家系管理的要求。
以上结果表明，本发明的微卫星8重荧光PCR方法在斜带石斑鱼家系的亲子鉴定中稳定，准确，能满足斜带石斑鱼种质鉴定、家系管理和增殖放流效果评估的要求。
上面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以上具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)黄鳍鲷全同胞家系建立
利用养殖的黄鳍鲷作为亲本，进行人工繁殖，建立全同胞家系分养，从每个家系中选取仔鱼，作为家系鉴定的样本；
(2)黄鳍鲷亲本和子代基因组DNA提取
选取步骤(1)中黄鳍鲷亲本和仔鱼的鳍条组织，提取亲本和子代的基因组DNA，保存待用；
(3)多态性微卫星引物筛选
从黄鳍鲷转录组测序中筛选获得8个微卫星位点Y1、Y2、Y3、Y4、Y6、Y8、Y9、Y10，根据8个微卫星位点，设计8对微卫星引物，分别为引物对Y1、引物对Y2、引物对Y3、引物对Y4、引物对Y6、引物对Y8、引物对Y9和引物对Y10；
(4)荧光标记8重PCR体系开发和扩增
将步骤(3)中筛选出来的8对引物，设计成一个8重PCR体系，在8对引物的正向引物的5’端分别用FAM、HEX、TAMRA三种不同的荧光基团进行修饰，采用荧光PCR反应对步骤(2)中亲本及子代的DNA样品进行PCR扩增；
(5)微卫星位点基因分型及家系鉴定
(5.1)确定亲本和家系个体在各微卫星位点上对应的基因型
将步骤(4)中8重PCR扩增产物在测序仪上进行分型；
(5.2)家系鉴定
对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本。
2.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(2)中采用醋酸铵法提取亲本和子代的基因组DNA。
3.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(3)中所述引物Y1、引物对Y2、引物对Y3、引物对Y4、引物对Y6、引物对Y8、引物对Y9、引物对Y10的碱基序列分别如SEQ ID NO：1～16所示。
4.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(4)中8重PCR体系包括：浓度为10μmol/L的引物对Y1 0.5μL、浓度为10μmol/L的引物对Y2 0.3μL、浓度为10μmol/L的引物对Y3 0.4μL、浓度为10μmol/L的引物对Y4 0.5μL、浓度为5μmol/L的引物对Y6 0.5μL、浓度为5μmol/L的引物对Y8 0.6μL、浓度为5μmol/L的引物对Y9 0.6μL、浓度为5μmol/L的引物对Y10 0.4μL、浓度为100ng/μL的DNA 3μL、ddH2O 6.2μL、
Taq PCRStarMix 12μL、总计25μL。
5.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(4)中在引物对Y1、引物对Y2、引物对Y3的正向引物的5’端标记荧光物质FAM，在引物对Y4、引物对Y6的正向引物的5’端标记荧光物质HEX，在引物对Y8、引物对Y9、引物对Y10的正向引物的5’端标记荧光物质TAMRA。
6.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(4)中PCR扩增时，PCR反应程序为：94℃预变性5min，然后94℃30s，退火温度59℃30s，72℃30s，共30个循环，最后72℃延伸10min。
7.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(5.1)中将步骤(4)中8重PCR扩增产物在ABI3730XL基因分析仪上进行分型，用GS-500作为内参，用GeneMarker V1.5软件读取每个样品的基因型。
8.根据权利要求1所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(5.2)中采用CERVUS 3.0软件对亲本基因型和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，该结果与已知的实际家系信息进行比较，最终判断家系鉴定的成功。
9.根据权利要求8所述的黄鳍鲷微卫星家系鉴定的方法，其特征是：步骤(5.2)中采用软件CERVUS 3.0对亲本基因型和子代基因型进行分析时，采用软件CERVUS 3.0计算亲本基因型和子代基因型在各微卫星座位上等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、Hardy-Weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据LOD值鉴定每个家系个体的父母本。
10.权利要求1所述方法在黄鳍鲷的群体遗传学评价、系谱认证、亲子鉴定、分子标记辅助家系管理和分子标记辅助亲本选择方面的应用。
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| CN116555433A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-08-08 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055571A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-21 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 黄鳍棘鲷微卫星标记的特异性引物及应用 |
| CN113667760A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-11-19 | 中山大学 | 一种评估黄鳍鲷种群遗传多样性的ssr标记引物和方法 |
-
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109055571A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-21 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 黄鳍棘鲷微卫星标记的特异性引物及应用 |
| CN113667760A (zh) * | 2021-07-06 | 2021-11-19 | 中山大学 | 一种评估黄鳍鲷种群遗传多样性的ssr标记引物和方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 夏军红;朱彩艳;苏天凤;江世贵;: "黄鳍鲷基因组微卫星的分离", 中国水产科学, no. 02, pages 321 - 325 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116555433A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-08-08 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用 |
| CN116555433B (zh) * | 2022-12-28 | 2024-03-19 | 中国水产科学研究院南海水产研究所 | 一种用于鉴别黄鳍棘鲷和平鲷的引物、试剂盒及应用 |
| CN116179657A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-05-30 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 鉴定鳢的引物组合、微卫星标记组合、多重pcr体系及其方法和应用 |
| CN116179657B (zh) * | 2022-12-30 | 2023-09-05 | 中国水产科学研究院珠江水产研究所 | 鉴定鳢的引物组合、微卫星标记组合、多重pcr体系及其方法和应用 |
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