CN108410963B - 一种基于微卫星荧光多重pcr的长鳍吻鮈亲子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，包括以下步骤：1.提取待检测样本的基因组DNA；2.利用引物组合进行多重PCR扩增反应，通过测序仪进行等位基因分型；3.通过似然率检测待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定亲子关系。与传统PCR方法相比，本方法检测的微卫星位点提高了3倍左右，大大提高了亲子鉴定的效率和速度，并且检测费用也仅为原来的三分之一左右，同时克服了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型中等位基因大小判读误差等问题，提高了基因型数据的准确性，分析结果表明100%的待测个体均能够正确的找到其父母本。

Description

一种基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法

技术领域

本发明属于鱼类分子标记技术领域，具体涉及一种长鳍吻鮈的微卫星荧光多重PCR亲子鉴定方法。

背景技术

长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis Sauvage et Dabry)，隶属于硬骨鱼纲(Osteichthyes)、鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、鮈亚科(Gobioninae)、吻鮈属(Rhinogobio)，俗称洋鱼、土耗儿，主要分布于长江上游干流、金沙江、雅砻江、岷江、沱江、嘉陵江中下游和乌江下游。其喜生活于河流底层，是一种具有较高营养价值和经济价值的长江上游珍稀特有鱼类。近年来，由于过度捕捞、水域污染、生境破坏、水利工程建设等人类活动，长鳍吻鮈的资源量急剧下降。从受威胁程度、遗传多样性、物种价值等方面进行定量评估发现，长鳍吻鮈已达3级急切保护状，被列为低危鱼类。为保护此种长江上游珍稀特有鱼类资源，开展人工增殖放流是恢复和增殖长鳍吻鮈自然种群资源的必要措施，而且多个水电工程已将长鳍吻鮈列为增殖放流对象，对长鳍吻鮈人工驯养、繁殖技术等方面的研究日益受到重视。长鳍吻鮈的人工繁殖是开展增殖放流的前提条件，但人工繁殖工作如果在没有考虑其遗传背景的情况下进行，则具有较大的盲目性和随机性，从而容易产生严重的近交衰退，导致繁殖率和存活率下降、后代适应能力降低、对疾病和灾害的抵抗力减弱等现象；同时群体自由交配产生的后代其系谱信息难以确定，这些将导致后续人工增殖放流等工作难以开展。长鳍吻鮈亲子鉴定技术的开发，是解决这些难题的有效途径。目前关于长鳍吻鮈的研究主要集中在资源调查与评估、年龄与生长、生物学及遗传多样性等方面，未开展其亲子鉴定技术研究工作。

目前无专门针对长鳍吻鮈的亲子鉴定方法。微卫星(Microsatellite)又称为简单序列重复(Simple Sequence Repeat,SSR)是指一类重复单位在2～6个碱基的重复序列，微卫星序列作为分子标记具有在真核基因组中广泛分布、等位基因多杂合度高、扩增片段短扩增率高、灵敏度高于传统的DNA指纹，结果可靠、方法简单、省时省力等诸多优点，在亲子鉴定和遗传多态性研究中微卫星标记技术正在逐步取代其他分子标记技术。目前关于微卫星亲子鉴定技术的研究已广泛应用于生命科学各个领域，其中包括一些水生生物，如凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、美洲牡蛎(Crassostrea virginica)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等亲子鉴定分析。本发明利用微卫星建立长鳍吻鮈亲子鉴定技术可以用于指导长鳍吻鮈人工繁殖工作，有效防止近亲交配或某些长鳍吻鮈亲本过度繁殖所带来的长鳍吻鮈种群遗传多样性的下降，使得长鳍吻鮈资源量得以较快恢复与增殖，从而更好的保护长鳍吻鮈。

发明内容

本发明的目的在于提供用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，利用微卫星标记与多重PCR技术结合，筛选了15对高度多态性微卫星位点，组建3-5个多重荧光PCR体系，与传统PCR方法相比，本方法检测的微卫星位点提高了3倍左右，大大提高了亲子鉴定的效率和速度。

本发明的另一个目的在于提供一种基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，用于长鳍吻鮈的亲子鉴定、家系管理以及放流效果评估。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，包括引物组合B、引物组合C、引物组合D。

作为优选，用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，包括引物组合A、引物组合B、引物组合C和引物组合D。

作为优选，用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，包括引物组合B、引物组合C、引物组合D和引物组合E。

作为优选，用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，包括引物组合A、引物组合B、引物组合C、引物组合D和引物组合E。

所述的引物组合A包括REN17、REN32、RVE-09，引物组合B包括RVE-23、RVE-24、REN16，引物组合C包括RV-9、RV-7、REN10，引物组合D包括RV-8、REN30、REN34，引物组合E包括RVE-13、RVE-01、REN02。各引物的序列及退火温度、每对引物的正向引物5′端标记的荧光物质如下所示：

一种基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，其步骤是：

1、采用酚-氯仿方法或高盐法或基因组DNA提取试剂盒提取待测样本的基因组DNA，将DNA浓度调整至100ng/μL保存备用；

2、利用上述的引物组合进行多重PCR扩增反应，多重PCR的反应体系及扩增程序如下：

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火(温度见上表)45s，72℃延伸1min，进行33个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存；

3、将多重PCR扩增产物在测序仪上进行等位基因分型，利用GeneMarker v.1.5软件读取等位基因大小值；

4、通过似然率检测待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定亲子关系。判断亲子关系的参考标准为：亲子指数的对数值——LOD值小于0表示亲本与子代之间不存在亲子关系；LOD值等于0表示亲本与子代之间的亲子关系不确定；LOD值大于0表示亲本与子代之间存在亲子关系；LOD值越大，可靠性越高。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明利用微卫星标记与多重PCR技术结合，筛选了15对高度多态性微卫星位点，组建5个多重荧光PCR体系，通过测序仪进行基因分型，对长鳍吻鮈家系进行高通量个体识别和亲子关系分析；本发明一次PCR反应可以同时检测3个微卫星位点，与原有简单PCR方法相比提高了3倍左右，大大提高了亲子鉴定的效率和速度，并且检测费用也仅为原来的三分之一左右；

2、通过测序仪进行基因分型，克服了利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分型中等位基因大小判读误差等问题，提高了基因型数据的准确定性，分析结果表明100％的待测个体均能够正确的找到其父母本；

3、本发明所建立的长鳍吻鮈亲子鉴定技术能够指导长鳍吻鮈养殖场人工繁殖，有效防止近亲交配或某些长鳍吻鮈亲本过度繁殖所带来的长鳍吻鮈种群遗传多样性的下降，为长鳍吻鮈种质鉴定和家系管理提供依据，从而指导长鳍吻鮈人工增殖放流，保护长江长鳍吻鮈的遗传多样性，使得长江长鳍吻鮈种群得以较快恢复和增殖，对长鳍吻鮈的保护具有重要意义。

附图说明

图1为引物REN17测序图(依次为亲本MB5、亲本FB5、子代ZD501)；

图2为引物REN32测序图(依次为亲本MB5、亲本FB5、子代ZD501)；

图3为引物RVE-09测序图(依次为亲本MB5、亲本FB5、子代ZD501)；

图4为引物RVE-24测序图(依次为亲本MB5、亲本FB5、子代ZD501)。

具体实施方式

实施例1

长鳍吻鮈多态性微卫星标记筛选及多重PCR引物组合选择，其步骤是：

1、长鳍吻鮈个体的DNA提取

采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)试剂盒提取样本基因组DNA，其操作步骤如下：取12尾野生长鳍吻鮈，剪取鳍条或其他组织样本30mg左右，经双蒸水洗涤后，用小剪刀充分剪碎，放入1.5mL离心管中，加入200μL TL Buffer和25μL OB ProteaseSolution，在55℃消化1-1.5h，直至组织完全消化；12000rpm离心5min沉淀不溶性组织碎片，吸取上清液转移到另一个1.5mL离心管中；加入220μL BL Buffer，混匀，在70℃恒温水槽中放置10min；加入220μL的无水乙醇，混匀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将溶液全部转移至离心柱中，12000rpm离心1min，弃滤液，将离心柱放回收集管中；向离心柱中加入500μL HBC Buffer，12000rpm离心30s，弃滤液和收集管；将离心柱插入到另一个收集管里，向离心柱中加入700μL DNA Wash Buffer，12000rpm离心30s，弃滤液，将离心柱放回收集管中，重复一次后12000rpm离心2min，弃滤液，彻底晾干离心柱；将离心柱插入到1.5mL灭菌离心管里，悬空滴加50-200μL Elution Buffer，温室静置2min，12000rpm离心1min洗脱DNA，将溶液收集到离心管中；测定DNA浓度，将样本DNA浓度调整至100ng/μL保存备用。

2、长鳍吻鮈多态性微卫星标记筛选

根据文献发表的33对长鳍吻鮈微卫星引物序列(徐念等《Isolation andcharacterization of microsatellite loci in Rhinogobio ventralis》，程晓凤《长江上游特有鱼长鳍吻鮈(Rhinogobio ventralis)遗传结构分析》，Shao Ke《Development ofsixteen novel polymorphic microsatellite markers in Rhinogobio ventralis》)，合成非荧光标记微卫星引物，并分别以上述12个野生长鳍吻鮈个体进行PCR扩增。长鳍吻鮈33个微卫星位点信息特征见表1。

表1 长鳍吻鮈33个微卫星位点信息特征

扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火(温度见表1)45s，72℃延伸1min，进行33个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存，反应体系如下所示：PCR反应体系25μL，包括：10×PCR Buffer(15mmol/L Mg²⁺)3μL，10mmol/L dNTPs 1μL，10μmol/L的引物对各0.5μL，5U/μL rTaq Enzyme 0.4μL，DNA Template(100ng/μL)1.5μL，ddH₂O 18.1μL。

扩增产物于12％非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，银染显色，筛选条带清晰、扩增稳定、多态性强、杂合度高的引物，本发明共筛选出15对长鳍吻鮈微卫星引物：REN17、REN32、RVE-09、RVE-23、RVE-24、REN16、RV-9、RV-7、REN10、RV-8、REN30、REN34、RVE-13、RVE-01、REN02。

3、长鳍吻鮈微卫星多重PCR引物组合选择、条件的优化

根据筛选获得的多态性微卫星引物的退火温度、等位基因大小以及引物序列，组合成5组多重PCR，多重PCR组合A引物为：REN17、REN32、RVE-09；多重PCR组合B引物为：RVE-23、RVE-24、REN16；多重PCR组合C引物为：RV-9、RV-7、REN10；多重PCR组合D引物为：RV-8、REN30、REN34；多重PCR组合E引物为：RVE-13、RVE-01、REN02。其中每对引物的正向引物的5′端标记上荧光物质，REN17、REN32、RVE-09、RVE-23、RVE-24、REN16、RV-9、RV-7、REN10、RV-8、REN30、REN34、RVE-13、RVE-01、REN02的荧光物质分别是FAM、HEX、FAM、HEX、FAM、FAM、FAM、HEX、TET、FAM、HEX、TET、FAM、HEX、TET，见表2。

表2长鳍吻鮈5组微卫星荧光多重PCR组合引物信息

实施例2

基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，其步骤是：

1、长鳍吻鮈个体的DNA提取

采集长鳍吻鮈亲本鳍条样本6尾(雌雄各3尾，按1：1进行繁殖)及相应的子代个体样本96尾，同时采集其他繁殖亲本鳍条样本34尾，采用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，将样本DNA浓度调整至100ng/μL保存备用。

2、微卫星荧光多重PCR扩增

根据表1所示的引物序列及荧光标记，合成15对长鳍吻鮈微卫星引物，并在每对引物的正向引物的5′端标记上荧光物质，将步骤1的基因组DNA按照表3所示的反应体系及退火温度分别进行5组多重PCR扩增。

表3 长鳍吻鮈亲子鉴定多重PCR反应体系及退火温度

PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，退火(温度见表3)45s，72℃延伸1min，进行33个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存。

取2μL的PCR扩增产物，用1.0％的琼脂糖凝胶进行电泳，初步检测扩增片段的大小和产物浓度，送至生物服务公司利用ABI 3730测序仪进行等位基因分型。

3、亲子鉴定

根据测序仪分型结果，利用GeneMarker v.1.5软件读取个体等位基因大小值，并加以人工校正，排成数字基因型矩阵。表4a、表4b是长鳍吻鮈个体基因型数据。

利用Cervus v.3.0软件对基因型数据进行等位基因频率(Allele Frequency)分析、模拟分析(Simulation Analysis)以及亲子分析(Parentage Analysis)。通过似然率检测待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定待测个体与哪个亲本具有亲子关系。其参照标准为：亲子指数的对数值——LOD值小于0表示亲本与子代之间不存在亲子关系；LOD值等于0表示亲本与子代之间的亲子关系不确定；LOD值大于0表示亲本与子代之间存在亲子关系；LOD值越大，可靠性越高。

基于排除法的亲子鉴定其参照标准为：当累积非父排除概率(CEP)在99.73％及以上，则可以认定存在亲子关系；若CEP在95％～99％以内，则有可能是亲子关系；若CEP在80％及以下，则不能确定有亲子关系。表5是长鳍吻鮈15个微卫星位点亲子关系分析的遗传信息情况，结果显示，当双亲基因型未知时，15个位点的累积排除概率(CE-1P)为0.99998607；当已知单亲基因型时，15个位点的累积排除概率(CE-2P)为0.99999997。当仅使用多态信息含量较高的多重PCR组合D、B和C，双亲基因型未知时，9个位点的累积排除概率为0.99935535，证明亲本与子代存在亲子关系。亲子鉴定分析结果显示，当使用5组微卫星多重PCR组合进行亲子鉴定时，3个家系共96尾子代个体LOD值均大于0(表6)，结果中96尾子代个体均能准确找到其真实父母本，其亲子鉴定准确率为100％；当使用多态信息含量较高的多重PCR组合D和B时，其亲子鉴定准确率为97％；当再增加任意一个多重PCR组合时，其亲子鉴定准确率也达到了100％。

以上结果表明，利用本发明的微卫星荧光多重PCR方法能高效快捷实现长鳍吻鮈家系的亲子鉴定分析，准确率为100％，满足长鳍吻鮈种质鉴定、家系管理和人工增殖放流效果评估的要求。

表4a 长鳍吻鮈的基因型数据

表4b 长鳍吻鮈的基因型数据

表5 长鳍吻鮈15个微卫星位点亲子关系分析的遗传信息

注：NS表示不显著偏离(P＞0.05)，***表示极显著偏离(P＜0.001)，**表示显著偏离(P＜0.01)，*表示显著偏离(P＜0.05)，ND表示未检验。

表6 96尾子代长鳍吻鮈亲子鉴定结果

Claims (4)

1.用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，包括引物组合B、引物组合C、引物组合D，其特征在于：引物组合B包括RVE-23、RVE-24、REN16，引物组合C包括RV-9、RV-7、REN10，引物组合D包括RV-8、REN30、REN34，各引物的序列及退火温度、每对引物的正向引物5′端标记的荧光物质如下所示：

2.根据权利要求1所述的用于长鳍吻鮈亲子鉴定的微卫星荧光多重PCR引物组合，其特征在于，还包括引物组合A或/和引物组合E，所述的引物组合A包括REN17、REN32、RVE-09，所述的引物组合E包括RVE-13、RVE-01、REN02，各引物的序列及退火温度、每对引物的正向引物5′端标记的荧光物质如下所示：

3.一种基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，其步骤是：

A.提取待检测样本的基因组DNA；

B.利用权利要求1或2所述的引物组合进行多重PCR扩增反应，通过测序仪进行等位基因分型；

C.通过似然率检测待测个体与亲本基因型之间的相关性，确定亲子关系。

4.根据权利要求3所述的基于微卫星荧光多重PCR的长鳍吻鮈亲子鉴定方法，其特征在于，多重PCR的反应体系和扩增程序如下：

多重PCR组合A的PCR体系为总体积25μL，包括基因组DNA150ng，10×PCR Buffer 3μL，Mg²⁺1.8mM，dNTPs 0.4mM，rTaq DNA聚合酶2U，REN17、REN32、RVE-09正反引物各0.2μM，补充灭菌双蒸水至25μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，53.8℃退火45s，72℃延伸1min，进行33个循环；最后72℃再延伸10min，4℃保存；

多重PCR组合B的PCR体系中RVE-23、RVE-24、REN16正反引物各0.2μM，PCR反应条件中退火温度为59.2℃，其他均与多重PCR组合A的反应体系及条件相同；

多重PCR组合C的PCR体系中RV-9、REN10正反引物各0.2μM，RV-7正反引物各0.28μM，PCR反应条件中退火温度为56.1℃，其他均与多重PCR组合A的反应体系及条件相同；

多重PCR组合D的PCR体系中RV-8、REN30正反引物各0.2μM，REN34正反引物各0.28μM，PCR反应条件中退火温度为56.1℃，其他均与多重PCR组合A的反应体系及条件相同；

多重PCR组合E的PCR体系中RVE-13、REN02正反引物各0.2μM，RVE-01正反引物各0.28μM，PCR反应条件中退火温度为51.9℃，其他均与多重PCR组合A的反应体系及条件相同。

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