CN110551826B - 鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。所述的微卫星引物TC111为：F:5'‑CCATTTTGGTGCGTAGTA‑3'；R:5'‑CTTGAGGGCACCTTTTAG‑3'。利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出番红砗磲、鳞砗磲、番红砗磲×鳞砗磲杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。

Description

鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒 和鉴定方法
技术领域
本发明属于水产生物技术中的贝类分子标记和杂交种鉴定技术，具体涉及一种鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。
背景技术
砗磲是一种大型海产双壳类软体动物，不仅肉味鲜美、营养丰富，而且贝壳可制作成精美的贝雕艺术品，具有极高的观赏价值、收藏价值和药用价值。近年来由于滥捕，砗磲资源受到严重的破坏，如库氏砗磲在我国南海几近绝迹，无磷砗磲也极为罕见，其他砗磲大多数也处于濒危境地，因此开展砗磲的人工繁育及增值放流迫在眉睫。
番红砗磲(Tridacna crocea)是个体较小的砗磲种类，外形呈卵圆状，足丝孔较宽。番红砗磲是水族馆中优先选择的观赏种类且存在造礁、护礁功能，具有重要的经济价值和生态价值。鳞砗磲(Tridacna squamosa)最大能生长至30-40cm，外壳有明显棱鳞，由外壳边缘成直行生长一直伸展至外壳底部，也是一种重要的造礁护礁生物。近年来，随着我国砗磲野生资源的迅速减少和市场需求的不断扩大，番红砗磲和鳞砗磲将成为重要的养殖经济种类。由于幼体阶段的番红砗磲和鳞砗磲根据形态特征难以区分，杂交种更加难以鉴别。急需一种简单高效的方法对番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
发明内容
本发明目的在于提供一种鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法。本发明中利用该方法对番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代各80个个体进行了分析并发现鉴定效果显著。
本发明从100对番红砗磲EST-SSR引物中筛选出1对微卫星(SSR)引物对番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代各80个个体的基因组DNA进行PCR扩增，通过扩增图谱可以简单高效的对真正杂交子一代进行分子鉴定，从而简单高效地对番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代进行大规模物种鉴定。
本发明的第一个目的是提供鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物TC111，所述的微卫星引物TC111为：
F:5'-CCATTTTGGTGCGTAGTA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
R:5'-CTTGAGGGCACCTTTTAG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
本发明的第二个目的是提供一种鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的试剂盒，该试剂盒含有上述的微卫星引物TC111。
本发明的第三个目的是提供一种番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的鉴定方法，包括以下步骤：
提取待测砗磲样品的基因组DNA，然后用上述的微卫星引物TC111(F:5'-CCATTTTGGTGCGTAGTA-3'，R:5'-CTTGAGGGCACCTTTTAG-3')进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，若在240bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为番红砗磲；若在200bp～220bp区间内出现条带，则该待测样品为鳞砗磲；若同时在240bp～260bp区间和200bp～220bp区间内各出现1条带，则该待测样品为番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
所述的用微卫星引物TC111进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer 10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，然后用0.1％AgNO3溶液染色10min，银染后用2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL显色，至条带清晰为止。
本发明的第四个目的是提供上述的微卫星引物TC111或上述的试剂盒在鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代中的应用。
由于微卫星引物TC111产生的番红砗磲特异条带范围在240bp～260bp之间，鳞砗磲特异性条带范围在200bp～220bp之间，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种砗磲的个体。因此将电泳结果与提供的标准图谱进行对比：若在240bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为番红砗磲；若在200bp～220bp区间内出现条带，则该待测样品为鳞砗磲；若同时在240bp～260bp区间和200bp～220bp区间内各出现1条带，则该待测样品为番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代。即同时拥有亲本的1条特异性条带的个体才为真正的番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。
本发明从100对番红砗磲的转录组微卫星引物中筛选出一对能够在番红砗磲、鳞砗磲中通用并且可以根据扩增条带大小区分两种砗磲，同时带型清晰、重复性好、可靠性强的微卫星引物：TC111，并在两者间的杂交子一代个体鉴定中具有重要应用价值。
由于幼体阶段的番红砗磲和鳞砗磲根据形态特征难以区分，杂交种更加难以鉴别。而利用本发明方法，可以快速、准确地鉴定出番红砗磲、鳞砗磲、番红砗磲×鳞砗磲杂交子一代，具有重要的实际应用价值，同时本发明具有方法简单、结果直观、准确有效、不受环境及发育时期影响、成本低廉等优点。
附图说明
图1是微卫星引物TC111在番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代部分个体间的电泳染色对比图谱。1～3是番红砗磲个体，4～6是鳞砗磲个体，7～16是杂交子一代个体。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
从番红砗磲、鳞砗磲及其杂交种足丝孔中剪取少量外套膜组织，采用酚-氯仿抽提法提取番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代各80个个体的基因组DNA。将闭壳肌充分剪碎，用干净的滤纸吸除水分后放入1.5mL离心管中，再加入400μL裂解液和10μL蛋白酶K(10mg/mL)，在振荡器上混匀，55℃水浴消化3～5h，直到裂解液澄清为止。加入等体积饱和酚200μL、氯仿/异戊醇混合液(24:1v/v)200μL抽提三次。用1mL的无水乙醇沉淀DNA，经70％酒精洗涤，室温晾干后溶于100μL的超纯水中。紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。分别以提取的三种砗磲基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应：PCR反应体系的总体积为25μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50ng，Buffer10mM，引物各0.2mM，dNTP 0.2mM，Mg2+2.0mM，Taq DNA聚合酶1U，用灭菌水补足25μL。其中引物序列为：
F:5'-CCATTTTGGTGCGTAGTA-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；
R:5'-CTTGAGGGCACCTTTTAG-3'(其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)。
PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10min。
PCR反应结束后，取0.5μL扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，电泳结束后将凝胶从玻璃板上取下放入托盘中，用去离子水清洗两次，然后加入0.1％AgNO3溶液(AgNO3 1g，dH2O 1000mL)染色10min。染色后加入去离子水再次清洗一次，加入显色液(2％NaOH、0.4％甲醛、0.2％NaS2O3、dH2O 1000mL)显色，直至条带清晰为止，于UMAX扫描仪下扫描后，根据电泳结果与提供的标准图谱进行对比，若在240bp～260bp区间内出现条带，则该待测样品为番红砗磲；若在200bp～220bp区间内出现条带，则该待测样品为鳞砗磲；若在240bp～260bp区间和200bp～220bp区间内各出现1条带，则该个体为真正的番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代，缺少其中的任意一个条带均为假杂种。具体结果如图1所示，从图1可以看出，番红砗磲在240bp～260bp区间出现条带，鳞砗磲在200bp～220bp区间出现条带，两者之间没有等位基因重叠区，可以明显区分两种砗磲的个体。番红砗磲×鳞砗磲杂交子一代同时在240bp～260bp区间和200bp～220bp区间内各出现1条带。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物、试剂盒和鉴定方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccattttggt gcgtagta 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cttgagggca ccttttag 18

Claims (7)

1.鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的微卫星引物TC111，其特征在于，所述的微卫星引物TC111为：
F: 5'-CCATTTTGGTGCGTAGTA-3'；
R: 5'-CTTGAGGGCACCTTTTAG-3'。
2.一种鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的微卫星引物TC111。
3.一种番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待测砗磲样品的基因组DNA，然后用权利要求1所述的微卫星引物TC111进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳和染色，电泳结果判定方式如下：如果电泳结果为一条带，且该条带在240bp~260bp区间内，则该待测样品为番红砗磲；若电泳结果为一条带，且该条带在200bp~220bp区间内，则该待测样品为鳞砗磲；若电泳结果为两条带，且条带分别在240bp~260bp区间和200bp~220bp区间内，则该待测样品为番红砗磲与鳞砗磲杂交子一代。
4. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物TC111进行PCR扩增，其PCR扩增体系为：总体积为25 μL，其中各种成分及终浓度分别为：DNA模板50 ng，Buffer 10 mM，引物各 0.2 mM，dNTP 0.2 mM，Mg2+ 2.0 mM，Taq DNA聚合酶 1U，用灭菌水补足25 μL。
5. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的用微卫星引物TC111进行PCR扩增，其PCR反应程序为：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，变性至延伸三个步骤重复30次，72℃延伸10 min。
6. 根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述的将扩增产物进行电泳和染色，是将扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，220V稳压电泳3小时，然后用0.1% AgNO3溶液染色10 min，银染后用显色液显色至条带清晰为止，所述的显色液为2% NaOH、0.4%甲醛、0.2% NaS2O3、dH2O定容至1000 mL。
7.权利要求1所述的微卫星引物TC111或权利要求2所述的试剂盒在鉴定番红砗磲、鳞砗磲及其杂交子一代中的应用。
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