CN106978490B

CN106978490B - 一种鉴定砗磲的dna条形码标准检测方法及其应用

Info

Publication number: CN106978490B
Application number: CN201710224675.8A
Authority: CN
Inventors: 郑小东; 姜典航; 曾晓起; 张晓英; 李琪
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2037-04-07
Also published as: CN106978490A

Abstract

本发明提供一种用于鉴定砗磲DNA条形码组合，包含有用于鉴定砗豪的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、用于鉴定无磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列其核苷酸序列为SEQ ID NO:2、用于鉴定大砗磲的DNA条形码，核苷酸序列为SEQ ID NO:3、用于鉴定长砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4、用于鉴定磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5、用于鉴定番红砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6。本发明再一个方面提供扩增上述砗磲科贝类DNA条形码的通用引物对，其引物的序列为SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。本发明的条形码和扩增引物可以有效的鉴定砗磲的具体种类。

Description

一种鉴定砗磲的DNA条形码标准检测方法及其应用

技术领域

本发明属于贝类分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定砗磲的DNA条形码标准检测方法及其应用。

背景技术

砗磲科(Tridacnidae)隶属双壳纲(Bivalvia)，异齿亚纲(Heterodonta)，帘蛤目(Veneroida)，是一种体型较大的双壳贝类，主要生活在热带海域，珊瑚礁或海砂表面。砗磲科贝类肉质鲜美，营养及药用价值高，价格昂贵，其加工制品具有极高的艺术价值，在世界各地均遭到过度捕捞。近年一些国家已将大砗磲(Tridacna gigas)等三种砗磲列为世界珍稀保护动物，加以保护。长砗磲(Tridacna maxima)亦被世界自然保护联盟红色名录列为近危物种。砗磲科目前发现9种，根据不同种放射肋上褶襞的分布，足丝孔，主、侧齿和闭壳肌痕等形态特征区分不同种，但实际上贝壳有较高的可塑性，在发育过程中存在中间形态和中间生境，造成砗磲科不同种难以区分。目前，对于砗磲科(Tridacnidae)的研究主要集中在生态环境、资源保护方面，在遗传特性、系统发育关系方面，有报道的研究较少，这种现状极大的阻碍了砗磲科种质资源的保护和物种鉴定。

近年来，利用DNA条形码对物种进行分类鉴定和系统发育分析已成为一种高效的方法。DNA条形码的工作原理是基于DNA短片段来识别动物、植物或其它生物的类别，它具有迅速和价格低廉两个独特的优点。DNA条形码不仅是传统物种鉴定的强有力补充，更由于它采用数字化形式，使样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，解决了依靠形态学鉴定存在的问题，并可利用有机体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种鉴定砗磲的DNA条形码标准检测方法及其应用，从而解决依据外部形态和人工经验难以准确鉴定砗磲的问题，能够快速有效地鉴定砗磲，对于研究砗磲科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护砗磲科种质资源具有重要意义。

本发明首先提供一种用于鉴定砗磲DNA条形码组合，包含有：

用于鉴定砗

的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

TGACCAGCTTCAGGCTTCAAAATAATATATAATGTTATTGTTACTACCCACGCTTTGATTATGATTTTTTTATGGTAATACCAGTTATAATAGGCGGGTTTGGTAATTGATTGGTGCCTTTGATGATGGTCATACCAGATATACCCTCGATTAAATAATTTAAGATTTTGATTGGTACCTAATGCATTTTTTTTGTTGGGAGTGTCGGGCTTTGTAGAAGGGGGTATAGGTGCCGGATGGACAATTTACCCCCCGCTAACATCGATTGAGTTTAAGGGACCCGTCCATAGATCTAGCAATTTTTTCTCTGCACCTTGGAGGTGCTTCTTCTATTGCTGCTAGTTTAAATTTTGCTAGGACAGTAGCTAACATACCACCAAAAACGTGGTTTTCACAAAGTTCCTATATTTCCTATTTCCTTAGGAATTACAGCGTTGCTATTAATTGTAGCAAT；

用于鉴定无磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

TGACCAGCGTCTGGTTACAAAATAATATACAATGTTATTGTTACTACACATGCTTTGATTATGATTTTTTTATGGTAATGCCAGTAATAATAGGAGGTTTTGGCAATTGGCTTGTGCCTTTAATAATGTTGATGCCTGATATACCCTCGTTTAAATAATTTAAGGTTTTGATTAGTTCCTAATGCATTCTTTTTGCTTGGAGTTTCTGGGTTTGTAGAGGGAGGTATAGGCGCAGGTTGAACGATCTATCCTCCATTGACTTCAATTGACTTTAAGGGATCCGTCTATAGATCTTGCTATTTTTTCTTTACATTTAGGTGGTGCTTCTTCTATTGCGGCCAGGTTAAATTTTGCAAGGACTGTAGCTAATATGCCATCAAAAACGAGGTTTTCATAAAATCCCAATATTTCCGGTATCACTAGGAATTACAGCGTTACTTTTGATCGTTGCAAT；

用于鉴定大砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

TGGCCAGCGTCTGACTTCAGAATAATATACAATGTTATTGTCACTACACATGCTTTAATCATAATTTTTTTATGGTAATACCGGTAATAATAGGAGGGTTTGGTAACTGGCTAGTACCGCTGATGATGGTCATGCCGGATATGCCCCCGGCTGAATAACTTAAGGTTTTGGCTGGTCCCAAATGCATTTTTTTTGCTTGGAGTTTCCGGGTTTGTAGAAGGAGGGATAGGAGCAGGGTGAACAATCTACCCCCCGTTAACATCGATTGATTTTGAGGGACCCCTCGATGGACCTAGCCATCTTTTCCCTTCATCTTGGGGGCGCATCTTCGATTGCAGCGAGATTAAATTTTGCAAGGACCGTGGCAAATATACCATCAAAAGCGTGGTTTTCATAAAATTCCTATATTCCCGGTGTCCTTAGGGATCACGGCATTACTTTTAATTGTAGCTAT；

用于鉴定长砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:4)：

CCAGCTAAAACAGGCATTGCCACAATAAGCAACGCTGTAATACCTAATGACACTGGAAACATAGGAATTTTATGGAAACCACGTTTTTGATGCCGTATATTAGCCACAGTCTTGCAAAATTTAACCTGGCTGCAATAGATGAGGCACCGCCTAAGTGAAGGGAAAAAATGGCAAGATCTATAGACGGATCTCTTAAGAAATCGATTGAAGTCAGTGGGGGGTAGATTGTTCAACCAGCACCCATGCCTCCTTCTACAAATCCAGATACTCCTAAAAAAATGCATTTACAAACCAAAACCTCAAATTATTTAATCGAGGGAAATGCATATCTGGTATTACCATTATTAAAGGTACAAGTCAATTTCCAAATCCGCTATTATCACCGGCATTACCATAAAAAAATTATAATTAATGCATGTGTAGTAACGATTACATTATAATCTATTATTCTGCA；

用于鉴定磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:5)：

TGGCCTGCCTCAGGTTACAGAATAATGTACAATGTGATTGTTACTACACATGCTTTAATTATAATTTTTTTATGGTAATACCAGTGATAGTAGGAGGGTTCGGAAATTGGCTTGTACCTTTAATAATGGTAATACCAGATATACCCACGCTTAAACAATCTAAGGTTTTGGTTTGTGCCAAATGCATTTTTTCTGCTTGGAGTGTCTGGGTTTGTAGAAGGAGGTGTTGGAGCTGGCTGAACAATTTATCCCCCATTAACTTCAATCGACTTTAAGAGACCCTTCTATAGACCTTGCTATTTTTTCACTTCATTTGGGGGGTGCTTCTTCTATTGCAGCTAGATTAAATTTTGCAAGAACTGTTGCTAATATACCATCAAAAACGTGGGTTCCATAAAATCCCTATGTTTCCAGTATCCTTGGGGATTACGGCACTGCTTCTTATTGTGGCAAT；

用于鉴定番红砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列如下(SEQ ID NO:6)：

TGGCCTGCTTCAGGTTGCAGAATAATGTATAATGTAATTGTTACAACTCATGCCTTAATTATGATTTTTTTATGGTAATACCAGTCATAATAGGTGGATTTGGAAACTGGCTTGTACCTTTAATAATAGTAATACCAGATATACCCTCGTTTAAACAATCTAAGGTTTTGGTTTGTGCCAAATGCATTTTTTTTGCTCGGAGTGTCTGGGTTTGTAGAAGGAGGTGTAGGAGCTGGTTGAACAATTTATCCCCCTTTGACTTCTATTGATTTTAAGAGACCCTTCTATAGATCTTGCTATTTTTTCGCTTCATCTTGGGGGTGCTTCTTCTATTGCAGCTAGGTTAAATTTTGCAAGGACTGTAGCTAATATACCATCAAAAACGTGGGTTTCATAAGATCCCGATGTTTCCAGTGTCATTGGCGATTACAGCATTGCTTCTTATTGTAGCAAT。

本发明再一个方面提供扩增上述砗磲科贝类DNA条形码的通用引物对，其引物的序列信息如下：

上游引物的序列为5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’(SEQ ID NO:7)

下游引物的序列为5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’(SEQ ID NO:8)。

本发明再一个方面提供一种鉴定砗磲科贝类的方法，包括以下步骤：

1)待测样品的采集、保存、处理：待测样品取闭壳肌肌肉组织，保存在95％的酒精中，于-20℃冰箱中存放；

2)DNA提取：利用常规方法提取待检测样品的DNA待用；

3)PCR扩增：利用上述提供的通用引物对待测的个体进行PCR扩增，退火温度范围为48-52℃；

4)测序结果：对步骤3)中所得聚合酶链式反应扩增产物用琼脂糖凝胶电泳就行检测，如果能特异性扩增出680±10bp的条带，则将其进行测序分析；

5)碱基序列对比：将测得的序列与上述的DNA条形码1-6对比，若两段核苷酸序列的同源性在98％以上，即可判断该待测的物种来自于DNA条形码对应的物种。

与传统的形态学分类方法相比，本发明具有迅速和价格低廉两个独特的优点不仅是传统物种鉴定的强有力补充，而且样本鉴定过程能够实现自动化和标准化，突破了对经验的过度依赖，并可利用有机体的残片进行快速有效的鉴定，能够在较短时间内建立形成易于利用的应用系统。

附图说明

图1：用BioEdit处理CO1.fas图；

图2：基于16s rRNA基因的DNA条形码图；

图3：基于CO1基因序列的系统发育树图；

图4：基于16s rRNA基因序列的系统发育树图；

图5：实施例2的对比图。

具体实施方式

申请人从多个基因组数据中选取最能代表砗磲并且符合DNA条形码使用要求的基因片段，从而促成了本发明。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：砗磲科贝类DNA条形码的筛选

1)用于筛选砗磲科贝类DNA条形码的序列：

在美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上查询关于砗磲科贝类的线粒体基因序列，其中有2028条CO1序列记录；有192条16s rRNA记录；有122条18s rRNA记录；有3条12s rRNA记录。其中，12s rRNA仅包含鳞砗磲(Tridacnasquamosa)和长砗磲(T.maxima)2个物种，不符合作为DNA条形码的条件。

经分析，得到如下物种CO1基因序列：砗

(Hippopus hippopus)，无鳞砗磲(T.derasa)，大砗磲(T.gigas)，长砗磲(T.maxima)，鳞砗磲(T.squamosa)，番红砗磲(Tridacna crocea)。其中,长砗磲(T.maxima)下载10条序列(HE995483.1-HE995487.1，FM244530.1-FM244534.1)，鳞砗磲(T.squamosa)下载10条(HE995507.1-HE995516.1)，砗

(H.hippopus)下载4条序列(AM909765.1AF122973.1,KJ508348.1,KJ508344.1)，无鳞砗磲(T.derasa)下载3条序列(JX974957.1，GQ166591.1，KJ202112.1)，大砗磲(T.gigas)下载2条序列(EU003616.1，KJ202113.1)，番红砗磲(T.crocea)下载2条序列(KJ202111.1-KJ202102.1)。

得到如下物种16s rRNA基因序列：砗

(H.hippopus),Hippopus porcellanus，无鳞砗磲(T.derasa)，大砗磲(T.gigas),长砗磲(T.maxima),鳞砗磲(T.squamosa)，番红砗磲(T.crocea)，Tridacna noae，Tridacna costata。其中,长砗磲(T.maxima)下载10条序列(AM909743.1-AM909752.1)，鳞砗磲(T.squamosa)下载10条(AM909753.1-AM909762.1)，番红砗磲(T.crocea)下载10条序列(KJ508349.1-KJ508352.1，EU341342.1-341349.1)，Tridacna costata下载10条序列(AM909726.1-AM909735.1)，Tridacna noae下载10条序列(KT865912.1-KT865921.1)，砗

(H.hippopus)下载4条序列(KJ508347.1，KJ508348.1，AF122973.1，AM909765.1),无鳞砗磲(T.derasa)下载3条序列(KJ508353.1，KR422990.1，AF122976.1)，大砗磲(T.gigas)下载1条序列(AF122975.1)，H.porcellanus下载1条序列(AF122974.1)。

2)单个体序列处理:

将(1)中砗

(H.hippopus)的4条序列(AM909765.1AF122973.1，KJ508348.1，KJ508344.1)，分别用SeqMan软件处理，得到hippopus-co1.fas(SEQ ID NO：9)，代表砗

(H.hippopus)CO1基因序列的标准序列；将(1)中无鳞砗磲(T.derasa)的3条序列(JX974957.1，GQ166591.1，KJ202112.1)分别用SeqMan软件处理，得到desersa-co1.fas(SEQ ID：9)，代表无鳞砗磲(T.derasa)CO1基因序列的标准序列；将(1)中大砗磲(Tridacna.gigas)的两条序列(EU003616.1，KJ202113.1)用SeqMan软件处理得到gigas-co1.fas(SEQ ID：10)，代表大砗磲(Tridacna.gigas)CO1基因序列的标准序列；将步骤(1)中长砗磲(T.maxima)的10条序列(HE995483.1-HE995487.1，FM244530.1-FM244534.1)用SeqMan软件处理，得到maxima-co1.fas(SEQ ID：11)，代表长砗磲(T.maxima)CO1基因序列的标准序列；将(1)中鳞砗磲(T.squamosa)的10条序列(HE995507.1-HE995516.1)用SeqMan软件处理得到squamosa-co1.fas(SEQ ID：12)，代表鳞砗磲(T.squamosa)CO1基因序列的标准序列；将(1)中番红砗磲(T.crocea)的两条序列(KJ202111.1-KJ202102.1)用SeqMan软件处理得到crocea-co1.fas(SEQ ID：13)，代表番红砗磲(T.crocea)CO1基因序列的标准序列。运用相同的方法处理，得到maxima-16s.fas(SEQ ID：14)，代表长砗磲(T.maxima)16srRNA基因的标准序列；得到crocea-16s.fas(SEQ ID：15)，代表番红砗磲(T.crocea)16srRNA基因的标准序列；得到squamosa-16s.fas(SEQ ID：16)，代表鳞砗磲(T.squamosa)16srRNA基因序列的标准序列；得到costata-16s.fas(SEQ ID：17)，代表T.costata 16s rRNA基因的标准序列；得到noae-16s.fas(SEQ ID：18)，代表T.noae 16s rRNA基因的标准序列；得到hippopus-16s.fas(SEQ ID：19)，代表砗

(H.hippopus)16s rRNA基因的标准序列；得到derasa-16s.fas(SEQ ID：20)，代表无鳞砗磲(T.derasa)16s rRNA基因的标准序列；

砗

(H.hippopus)CO1基因的标准序列：

AAATCAAAATAAATGTATAAATAAAACCGGATCTCCACCGCCAACAGGATCAAAAAATGATGTAGCAAAATTACGATCAAATAATAATATGGTTAAAGCCCCAGCTAAAACAGGCATTGCCACAATAAGAAGCAACGCTGTAATACCTAATGACACTGGAAACATAGGAATTTTATGGAAACCACGTTTTTGATGCCGTATATTAGCCACAGTCCTTGCAAAATTTAACCTGGCTGCAATAGATGAGGCACCGCCTAAGTGAAGGGAAAAAATGGCAAGATCTATAGACGGATCTCTTAAGAAATCGATTGAAGTCAGTGGGGGGTAGATTGTTCAACCAGCACCCATGCCTCCTTCTACAAATCCAGATACTCCTAACAAAAAAAATGCATTAGGTACAAACCAAAACCTCAAATTATTTAATCGAGGGAAATGCATATCTGGTATTACCATTATTAAAGGTACAAGTCAATTTCCAAATCCGCCTATTATCACCGGCATTACCATAAAAAAAATTATAATTAATGCATGTGTAGTAACGATTACATTATAAAGTCTATTATTCTGCAGCCATGAAGCAGGTCATGCTAATTCTGTTCGGATTATTACTCTAAACGACGCACCTGCCAGCCCTGCCCACAATGCTAATAAAAAATAAAGAGTTCCAATA

无鳞砗磲(T.derasa)CO1基因的标准序列：

TATTGGAACCCTTTATTTTTTGTTGGCCTTATGGGCTGGACTAGCGGGTGCTTCATTCAGTGTTATAATTCGTACTGAGTTAGCGTGACCAGCGTCTTGGTTACAAAATAATAGATTATACAATGTTATTGTTACTACACATGCTTTGATTATGATTTTTTTTATGGTAATGCCAGTAATAATAGGAGGTTTTGGCAATTGGCTTGTGCCTTTAATAATGTTGATGCCTGATATACATTTCCCTCGTTTAAATAATTTAAGGTTTTGATTAGTTCCTAATGCATTCTTTTTGCTTGGAGTTTCTGGGTTTGTAGAGGGAGGTATAGGCGCAGGTTGAACGATCTATCCTCCATTGACTTCAATTGACTTCTTAAGGGATCCGTCTATAGATCTTGCTATTTTTTCTTTACATTTAGGTGGTGCTTCTTCTATTGCGGCCAGGTTAAATTTTGCAAGGACTGTAGCTAATATGCGACATCAAAAACGAGGTTTTCATAAAATCCCAATATTTCCGGTATCACTAGGAATTACAGCGTTACTTTTGATCGTTGCAATGCCTGTTTTAGCTGGGGGATTAACTATATTATTGTTTGATCGCAATTTTGCTACATCGTTTTTTGATCCAGTTGGCGGAGGGGATCCTGTTTTATTTATACATTTGTTTTGATTTT

大砗磲(Tridacna.gigas)CO1基因的标准序列：

CAACCAAATCATAAAGATATTGGAACTTTATATTTCTTGTTAGCCATGTGGGCTGGGCTGGCTGGAACTTCGTTTAGGGTAATAATTCGGACGGAGTTGGCATGGCCAGCGTCTTGACTTCAGAATAATAGGCTATACAATGTTATTGTCACTACACATGCTTTAATCATAATTTTTTTTATGGTAATACCGGTAATAATAGGAGGGTTTGGTAACTGGCTAGTACCGCTGATGATGGTCATGCCGGATATGCACTTTCCCCGGCTGAATAACTTAAGGTTTTGGCTGGTCCCAAATGCATTTTTTTTGCTTGGAGTTTCCGGGTTTGTAGAAGGAGGGATAGGAGCAGGGTGAACAATCTACCCCCCGTTAACATCGATTGATTTTCTGAGGGACCCCTCGATGGACCTAGCCATCTTTTCCCTTCATCTTGGGGGCGCATCTTCGATTGCAGCGAGATTAAATTTTGCAAGGACCGTGGCAAATATACGACATCAAAAGCGTGGTTTTCATAAAATTCCTATATTCCCGGTGTCCTTAGGGATCACGGCATTACTTTTAATTGTAGCTATGCCAGTTTTAGCTGGGGGCCTAACAATATTATTATTTGATCGGAATTTTGCTACATCATTTTTTGACCCTGTTGGTGGGGGCGATCCCGTTTTATTTATACATCTGTTTTGATTTTTTGGTCACCCTGAAGTTAAAAA

长砗磲(T.maxima)CO1基因的标准序列：

鳞砗磲(T.squamosa)CO1基因的标准序列：

ATGGCCTGCCTCATGGTTACAGAATAATGCCCTTTACAATGTGATTGTTACTACACATGCTTTAATTATAATTTTTTTTATGGTAATACCAGTGATAGTAGGAGGGTTCGGAAATTGGCTTGTACCTTTAATAATGGTAATACCAGATATACACTTTCCACGCTTAAACAATCTAAGGTTTTGGTTTGTGCCAAATGCATTTTTTCTGCTTGGAGTGTCTGGGTTTGTAGAAGGAGGTGTTGGAGCTGGCTGAACAATTTATCCCCCATTAACTTCAATCGACTTTCTAAGAGACCCTTCTATAGACCTTGCTATTTTTTCACTTCATTTGGGGGGTGCTTCTTCTATTGCAGCTAGATTAAATTTTGCAAGAACTGTTGCTAATATACGTCATCAAAAACGTGGGTTCCATAAAATCCCTATGTTTCCAGTATCCTTGGGGATTACGGCACTGCTTCTTATTGTGGCAATCCGG

番红砗磲(T.crocea)CO1基因的标准序列：

GACAGAATTGGCATGGCCTGCTTCATGGTTGCAGAATAATGCCCTTTATAATGTAATTGTTACAACTCATGCCTTAATTATGATTTTTTTTATGGTAATACCAGTCATAATAGGTGGATTTGGAAACTGGCTTGTACCTTTAATAATAGTAATACCAGATATACACTTCCCTCGTTTAAACAATCTAAGGTTTTGGTTTGTGCCAAATGCATTTTTTTTGCTCGGAGTGTCTGGGTTTGTAGAAGGAGGTGTAGGAGCTGGTTGAACAATTTATCCCCCTTTGACTTCTATTGATTTCCTAAGAGACCCTTCTATAGATCTTGCTATTTTTTCGCTTCATCTTGGGGGTGCTTCTTCTATTGCAGCTAGGTTAAATTTTGCAAGGACTGTAGCTAATATACGCCATCAAAAACGTGGGTTTCATAAGATCCCGATGTTTCCAGTGTCATTGGCGATTACAGCATTGCTTCTTATTGTAGCAATGCCTGTTTTAGCTG

长砗磲(T.maxima)16s rRNA基因的标准序列：

CCCGGTGCCTTGCGAGGTAAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAAGTCGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAAGGGTTGACGTCGGAAAAGCTGTCTCAGAAAGATTAAATGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAGATGAGAGTAAAAGACGAGAAGGCCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAACGTTTAGTAAACGTGATTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGATAGCCTCCGTTTTTAAAGCAAAGATCCATTATGTTCAGGATAATGAAAAAGGAAAAAGCTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGG

CGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTTTGTGCAGGAGCAAAGCGGG

番红砗磲(T.crocea)16s rRNA基因的标准序列：

AAAACATCTCTTCTAGTATGATATTAGAAGTAGGCCCTGCCCGGTGCCTTGCGAGGTAAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAAGTCGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAAGGGTTGACGTCGGAAAAACTGTCTCGGAAGAATTAAGTGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATTAAAGTAAAAGACGAGAAGACCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAATGTTTATCAAACGTGACTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGGTAGCCTCCGTTTTTAGCGCATAGATCCATTTTATCTAAAATAATGAAAAAAGAAAAAAGCTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTTTGTGCAGGAGCAAAGCGGGTAGGACTGTTCTTCCTTTAATCCCCTACGTGATCTA

鳞砗磲(T.squamosa)16s rRNA基因的标准序列：

CCCGGTGCCTTGCGGGGTAAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAAGTCGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAGGGGTTGACGTCGGAAAAGCTGTCTCAGAAAGACTAAGTGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATAAGGATAAAAGACGAGAAGGCCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAATGTTTAGCAACGTGATTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGATAGCCTCCGTTTTTAAAGCAAAGATCCATTATGTTCAAAATAATGAAAAAAGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTTTGTGCAGGAGCAAAGCGGG

T.costata 16s rRNA基因的标准序列：

GTCTGGTATGAAGGGGTTGACGTCGGAAAAGCTGTCTCAGAAAGACTAAGTGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATAAGGATAAAAGACGAGAAGGCCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAATGTTCGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGATAGCCTCCGTTTTTAAAGCAAAGATCCATTATAATGAAAAAGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTT

T.noae 16s rRNA基因的标准序列：

AAAACATCTCTTCTAGCATGATATTAGAAGTAGGCCCTGCCCGGTGCCTTACGAGGTAAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAAGTCGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAGGGGTTGACGTCGGAAAAACTGTCTCAGAAAAACTAAGTGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATAAAAGTAAAAGACGAGAAGGCCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAATGTTTATTAAACGTGATTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGGTAGCCTCCGTTTTTAATGCAAAGATCCATTATGTTTGAAATAATGAAAAAAGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTTTGTGCAGGAGCAAAGCGGGTAGGACTGTTCTTCCTTTAAT

砗

(H.hippopus)16s rRNA基因的标准序列：

TCGCCTGTTTATCAAAAACATCTCTTCCTGAAGTATACTGGAAGTAGGCCCTGCCCGGTGCCCTGCGGGGTTAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAGATTGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAATGGGTTGACGTCGGAAACGCTGTCTCAAAAAAATATAATGAAATTTACTTTTCAGTGAAAAGGCTGAAATTTGAGTAAAAGACGAGAAGACCCTATCGAGCTTGAGGGATTCTAATGTTGTAAAACCGTTAGAAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAACGGAGGTAACCTCCGTTTTTAAGTCGAAGATCCATTAGATTGGTTAATGATAAGAGGAAAAAGTTACCGTAGGGATAACAGCACCAGACCGCCTCAGAGGCCGTATCGAAGGCGGAAGGTGTGACCTCGATGTTGGATCAGGGTGAACCGCATGGTGCAGGAGCTATGCAGGTGGGACTGTTCTTCCTTTAATCCCCTACGTGATCTG

无鳞砗磲(T.derasa)16s rRNA基因的标准序列：

ACCTTAAAGTAGCGTGATAAGTCGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAGGGGTTGACGTCGGAGAAACTGTCTCGGAAAAATATGGTGAAATTTACTTTTAAGTGAAAAGGCTTAAATAAAAGTAAAAGACGAGAAGGCCCTGTCGAGCTTGAGGGATTTGAGTGTTAAATAACATGATTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGGTAGCCTCCATTTTTAAAGCAAAGATCCATTATAGTTAATTAATGATAAAAGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTAAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTAAACCTCTTTTGCAGGAGCAAAGCGGGTAGGACTGTTCTTCCTTTAATTCCCTACGTGA

3)多序列比对：

CO1基因的比对：将砗

(H.hippopus)，无鳞砗磲(T.derasa)，大砗磲(T.gigas),长砗磲(T.maxima),鳞砗磲(T.squamosa),番红砗磲(T.crocea)的CO1基因序列利用Clustal 1.8软件进行比对，得到3-co1.pir文件；

16s rRNA基因的对比：将长砗磲(T.maxima),番红砗磲(T.crocea),鳞砗磲(T.squamosa),T.costata,T.noae砗

(Hippopus hippopus),无鳞砗磲(T.derasa)，大砗磲(Tridacna.gigas),H.porcellanus的16s基因序列利用Clustal 1.8软件进行比对，得到3-16s.pir文件；

大砗磲(Tridacna.gigas)16s rRNA基因序列如下：

TCGCCTGTTTTTCAAAAACATCTCTTCTAGAACTATATTAGAAGTAGGCCCTGCCCGGTGCCCTGCGGGGTTAACGGCGGTGTTAAGCCTTAAAGTAGCGTGATAAGTTGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAAGGGGTTGACGTCGGAGAAACTGTCTCGGAAAGATAAAATGAAATTTACGTCCTAGTGAAAAGGCTGGGATGGCTGTAAAAGACGAGAAGACCCTGTCGAGCTTGAGGGATATGAATGTTTTAACAACATGATTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGGTAGCCTCCATTTTTAAAGCAAAGATCCATTAGAAAGAGATAATGATAAAAGGAAAAAGTTACCGCAGGGATAACAGCACAAGACCGCCTCAGAGGTCGTATCGAAGGCGGTGAGTGTGACCTCGATGTTGGATTAGGGTGAACCCTTTCGTGCAGGAGCGAAAGTTGGTGGGACTGTTCTTCCTTTAATACCCTACGTGATCTG

H.porcellanus 16s rRNA基因序列如下：

GATACTGGAATTAGCCCTGCCCGGTGCCTTGCGGGGTTAACGGCGGTGTTAAACCTTAAAGTAGCGTGATAGATTGGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATGAATGGGTTGACGTTGGAAAAGCTGTCTCAAAAAAATCTAGCGAAATTTACTTTTTAGTGAAAAGGCTAGAATTTTTATAAAAGACGAGAAGACCCTATCGAGCTTGAGGGATATTAACGTTTATAATGGGAACGTAAGTAGGAGTTTGGCTGGGGCAGCAATGGAGGTAACCTCCGTTTTTAAATCAAAGATCCATTACATTTCCTAATGATAAGAGGAAAAAGTTACCGTAGGGATAACAGCACCAGACCGCCTCAGAGGCCGTATCGAAGGCGGAAGGTGTGACCTCGATGTTGGATCAGGGTGAACCGCATGGTGCAGGAGCTATGCAGGCAGGACTGTCCTTCCT

4)提取保守位点：然后用Gblocks 0.91b软件从多序列比对结果中提取保守位点。具体过程是①.首先，将3-CO1.pir拖入到Gblocks 0.91b软件目录下，打开软件，进入主页面②输入O，然后回车，对话框显示输入一个文件或路径，此时将(3)中3-CO1.pir文件拖入对话框。对话框即出现该文件的路径，按回车，即导入该序列③.快速比对：输入G，然后回车。在原比对文件所在文件夹内即可出现Gblocks 0.91b已经处理好的文件4-CO1.pir-gb文件。然后，修改4-CO1.pir-gb文件格式为4-CO1.pir；用相同的方法处理3-16s.pir，得到4-16s.pir文件。

5)确定DNA条形码：用BioEdit处理(4)中4-CO1.pir文件，得到基于CO1基因的DNA条形码，如图1所示，保存文件为5-CO1.fas，用记事本打开5-CO1.fas。

用BioEdit处理(4)中4-16s.pir文件，得到基于16s rRNA基因的DNA条形码，如图2所示，保存文件为5-16s.fas，用记事本打开5-16s.fas。

利用5.fas文件，用Mega 5建立ML系统发育树，得到如图3和图4所示图。

从图3中可以看出，基于CO1建立的系统发育树，砗磲属不同种之间的遗传距离较近且能较好地分开砗磲属几种个体，与砗

属的砗

(Hippopus hippopus)处于不同的分支，并且遗传距离较远。相比于基于16s基因的DNA条形码，本发明中基于CO1基因的DNA条形码，能够应用于砗磲的鉴定。

从图4中可以看出，基于16s rRNA建立的系统发育树，虽然能够很好的区分开砗磲属和砗

属，但是在区分砗磲属物种时，支持度较低。因此，选用基于CO1建立的系统发育树，最终获得了用于鉴定砗磲DNA条形码组合，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-6；

通过对上述条形码序列的分析，最终确定了扩增上述砗磲科贝类DNA条形码的通用引物对，其引物的序列信息如下：

上游引物的序列为5'CTACTCCACCCGCTACCAAT 3'(SEQ ID NO:7)

下游引物的序列为5'GATGCTCTACAATGTGCGAAAC 3'(SEQ ID NO:8)。

上述的引物对可以在一次反应中就扩增出具有上述条形码序列的核苷酸片段。

实施例2：用于扩增上述DNA条形码的通用引物对

1)序列比对：利用BioEdit软件将砗

(Hippopus hippopus),无鳞砗磲(T.derasa),大砗磲(T.gigas),长砗磲(T.maxima),鳞砗磲(T.squamosa),番红砗磲(Tridacna crocea)的CO1序列进行比对，找出比较保守、碱基变异度最小的序列片段。

2)引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primer5在碱基变异度最小的序列片段设计出1对扩增引物。引物序列为

COI-F：5'CTACTCCACCCGCTACCAAT 3'(SEQ ID NO:7)；

COI-R：5'GATGCTCTACAATGTGCGAAAC 3'(SEQ ID NO:8)。

3)引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR扩增已知的砗磲样品。设置PCR热循环退火温度范围为40℃～60℃。.

4)扩增结果检测：扩增产物用1.5倍的琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果显示，该引物可以有效地扩增出砗磲的CO1基因。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为500bp。

测序结果表明，使用已知的砗磲样品作为模板，利用本实施例的通用引物可以有效的扩增出砗

(Hippopus hippopus),无鳞砗磲(T.derasa),大砗磲(T.gigas),长砗磲(T.maxima),鳞砗磲(T.squamosa),番红砗磲(Tridacna crocea)的上述DNA条形码。

实施例3：

采自南海全福岛的贝类，从外形观察初步断定为一种砗磲，但具体属于哪个种，并不清楚。用本发明筛选获得的条形码进行鉴定。

具体步骤如下：

1)利用常规方法提取待检测样品的DNA待用；

2)PCR扩增：利用设计的简并引物,对待测的砗磲科个体进行PCR扩增。退火温度范围为48-52℃；

3)测序结果：扩增产物进行双向测序；测定核苷酸序列为：

AAATCAAAATAAATGTATAAATAAAACCGGATCTCCACCGCCAACAGGATCAAAAAATGATGTAGCAAAATTACGATCAAATAATAATATGGTTAAAGCCCCAGCTAAAACAGGCATTGCCACAATAAGAAGCAACGCTGTAATACCTAATGACACTGGAAACATAGGAATTTTATGGAAACCACGTTTTTGATGCCGTATATTAGCCACAGTCCTTGCAAAATTTAACCTGGCTGCAATAGATGAGGCACCGCCTAAGTGAAGGGAAAAAATGGCAAGATCTATAGACGTATCTCTTAAGAAATCGATTGAAGTCAGTGGGGGGTAGATTGTTCAACCAGCACCCATGCCTCCTTCTACAAATCCAGATACTCCTAACAAAAAAAATGCATTAGGTACAAACCAAAACCTCAAATTATTTAATCGAGGGAAATGCATATCTGGTATTACCATTATTAAAGGTACAAGTCAATTTCCAAATCCGCCTATTATCACCGGCATTACCATAAAAAAAATTATAATTAATGCATGTGTAGTAACGATTACATTATAAAGTCTATTATTCTGCAGCCATGAAGCAGGTCATGCTAATTCTGTTCGGATTATTACTCTAAACGACGCACCTGCCAGCCCTGCCCACAATGCTAATAAAAAATAAAGAGTTCCAATA

4)碱基序列对比：将测得的序列与上述的DNA条形码1-6对比，对比图见图5。由图5可知，待测样品和长砗磲DNA条形码的序列同源性最高，达到99％；和其他砗磲DNA条形码的序列同源性均低于98％(其中和番红砗磲DNA条形码的序列同源性为87％，和鳞砗磲DNA条形码的序列同源性为86％，和无鳞砗磲DNA条形码的序列同源性为81％，和砗

DNA条形码的序列同源性低于80％)。

通过上述鉴定过程，得出该贝类属于双壳纲(Bivalvia),异齿亚纲(Heterodonta),帘蛤目(Veneroida)砗磲科(Tridacnidae)砗磲属(Tridacna)长砗磲。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国海洋大学

<120> 一种鉴定砗磲的DNA条形码标准检测方法及其应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 451

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

tgaccagctt caggcttcaa aataatatat aatgttattg ttactaccca cgctttgatt 60

atgatttttt tatggtaata ccagttataa taggcgggtt tggtaattga ttggtgcctt 120

tgatgatgtc ataccagata taccctcgat taaataattt aagattttga ttggtaccta 180

atgcattttt tttgttggga gtgtcgggct ttgtagaagg gggtataggt gccggatgga 240

caatttaccc cccgtaacat cgattgagtt taagggaccc gtccatagat ctagcaattt 300

tttctctgca ccttggaggt gcttcttcta ttgctgctag tttaaatttt gctaggacag 360

tagctaacat accaccaaaa agtggttttc acaaagttcc tatatttcct atttccttag 420

gaattacagc gttgctatta attgtagcaa t 451

<210> 2

<211> 451

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

tgaccagcgt ctggttacaa aataatatac aatgttattg ttactacaca tgctttgatt 60

atgatttttt tatggtaatg ccagtaataa taggaggttt tggcaattgg cttgtgcctt 120

taataatttg atgcctgata taccctcgtt taaataattt aaggttttga ttagttccta 180

atgcattctt tttgcttgga gtttctgggt ttgtagaggg aggtataggc gcaggttgaa 240

cgatctatcc tccatgactt caattgactt taagggatcc gtctatagat cttgctattt 300

tttctttaca tttaggtggt gcttcttcta ttgcggccag gttaaatttt gcaaggactg 360

tagctaatat gccatcaaaa agaggttttc ataaaatccc aatatttccg gtatcactag 420

gaattacagc gttacttttg atcgttgcaa t 451

<210> 3

<211> 451

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

tggccagcgt ctgacttcag aataatatac aatgttattg tcactacaca tgctttaatc 60

ataatttttt tatggtaata ccggtaataa taggagggtt tggtaactgg ctagtaccgc 120

tgatgatgtc atgccggata tgcccccggc tgaataactt aaggttttgg ctggtcccaa 180

atgcattttt tttgcttgga gtttccgggt ttgtagaagg agggatagga gcagggtgaa 240

caatctaccc cccgtaacat cgattgattt tgagggaccc ctcgatggac ctagccatct 300

tttcccttca tcttgggggc gcatcttcga ttgcagcgag attaaatttt gcaaggaccg 360

tggcaaatat accatcaaaa gcgtggtttt cataaaattc ctatattccc ggtgtcctta 420

gggatcacgg catactttta attgtagcta t 451

<210> 4

<211> 451

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

ccagctaaaa caggcattgc cacaataagc aacgctgtaa tacctaatga cactggaaac 60

ataggaattt tatggaaacc acgtttttga tgccgtatat tagccacagt cttgcaaaat 120

ttaacctgct gcaatagatg aggcaccgcc taagtgaagg gaaaaaatgg caagatctat 180

agacggatct cttaagaaat cgattgaagt cagtgggggg tagattgttc aaccagcacc 240

catgcctcct tctaaaatcc agatactcct aaaaaaatgc atttacaaac caaaacctca 300

aattatttaa tcgagggaaa tgcatatctg gtattaccat tattaaaggt acaagtcaat 360

ttccaaatcc gctattatca cggcattacc ataaaaaaat tataattaat gcatgtgtag 420

taacgattac attataatct attattctgc a 451

<210> 5

<211> 451

<212> DNA

<213> 5

<400> 5

tggcctgcct caggttacag aataatgtac aatgtgattg ttactacaca tgctttaatt 60

ataatttttt tatggtaata ccagtgatag taggagggtt cggaaattgg cttgtacctt 120

taataatgta ataccagata tacccacgct taaacaatct aaggttttgg tttgtgccaa 180

atgcattttt tctgcttgga gtgtctgggt ttgtagaagg aggtgttgga gctggctgaa 240

caatttatcc cccataactt caatcgactt taagagaccc ttctatagac cttgctattt 300

tttcacttca tttggggggt gcttcttcta ttgcagctag attaaatttt gcaagaactg 360

ttgctaatat accatcaaaa agtgggttcc ataaaatccc tatgtttcca gtatccttgg 420

ggattacggc actgcttctt attgtggcaa t 451

<210> 6

<211> 452

<212> DNA

<213> 6

<400> 6

tggcctgctt caggttgcag aataatgtat aatgtaattg ttacaactca tgccttaatt 60

atgatttttt tatggtaata ccagtcataa taggtggatt tggaaactgg cttgtacctt 120

taataatgta ataccagata taccctcgtt taaacaatct aaggttttgg tttgtgccaa 180

atgcattttt tttgctcgga gtgtctgggt ttgtagaagg aggtgtagga gctggttgaa 240

caatttatcc ccctttgact tctattgatt ttaagagacc cttctataga tcttgctatt 300

ttttcgcttc atcttggggg tgcttcttca ttgcagctag gttaaatttt gcaaggactg 360

tagctaatat accatcaaaa acgtgggttt cataagatcc cgatgtttcc agtgtcattg 420

gcgattacag cattgcttct tattgtagca at 452

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 7

<400> 7

ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 8

<400> 8

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims

1.DNA条形码组合在鉴定砗磲种中的应用，其特征在于，所述的DNA条形码组合包含有：

用于鉴定砗豪的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、

用于鉴定无磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2、

用于鉴定大砗磲的DNA条形码，核苷酸序列为SEQ ID NO:3、

用于鉴定长砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4、

用于鉴定磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5、

用于鉴定番红砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

2.DNA条形码在制备鉴定砗磲种的制品中的应用，所述的DNA条形码包含有：

用于鉴定砗豪的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、

用于鉴定无磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2、

用于鉴定大砗磲的DNA条形码，核苷酸序列为SEQ ID NO:3、

用于鉴定长砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4、

用于鉴定磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5、

用于鉴定番红砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的制品为检测试剂盒。

4.一种鉴定砗磲科贝类的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1）取待测样品的闭壳肌肌肉组织，保存在95%的酒精中，于-20℃存放；

2）DNA提取：提取待检测样品的DNA待用；

3）PCR扩增：对待检测样品的DNA进行PCR扩增，退火温度范围为48-52℃；扩增引物对的上游引物的序列为SEQ ID NO:7、下游引物的序列为SEQ ID NO:8；

4）测序结果：对步骤3）中所得的扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果能特异性扩增出680±10bp的条带，则将其进行测序分析；

5）碱基序列对比：将测得的序列与DNA条形码进行对比，若两段核苷酸序列的同源性在98%以上，即可判断该待测的物种来自于DNA条形码对应的物种；所述的DNA条形码组合包含有：

用于鉴定砗豪的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1、

用于鉴定无磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2、

用于鉴定大砗磲的DNA条形码，核苷酸序列为SEQ ID NO:3、

用于鉴定长砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4、

用于鉴定磷砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5、

用于鉴定番红砗磲的DNA条形码，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6。