CN109811078B

CN109811078B - 一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法

Info

Publication number: CN109811078B
Application number: CN201910262162.5A
Authority: CN
Inventors: 沈晨佳; 冯尚国; 罗秀俊; 俞春娜; 王慧中
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2019-04-02
Filing date: 2019-04-02
Publication date: 2022-10-25
Anticipated expiration: 2039-04-02
Also published as: CN109811078A

Abstract

本发明公开了一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法。当前方法对东北红豆杉的真伪鉴别效率不高，且准确率低下。本发明中东北红豆杉分子特异性标记为特异性引物DHDSF/DHDSR。特异性引物DHDSF/DHDSR作为扩增引物，通过常规PCR扩增反应和琼脂糖电泳检测，可以高效、准确的鉴别东北红豆杉样品。DHDSF/DHDSR为东北红豆杉的特异性扩增引物，待测样品为东北红豆杉，则会扩增出486bp大小的特异性DNA电泳条带；若待测样品为其他近缘红豆杉物种样品，则为阴性反应。本发明方法操作简单，用时短，且结果准确，是传统形态学方法鉴别东北红豆杉的有效辅助手段。

Description

一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法

技术领域

本发明属于东北红豆杉分子鉴定领域，涉及一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，以及利用该特异性标记引物对东北红豆杉进行快速鉴别的方法。

背景技术

东北红豆杉Taxus cuspidata S.et Z.，又名赤柏松、米树(东北)，宽叶紫杉，是裸子植物亚门(Cymnospermai)松杉纲(Coniferopside)红豆杉目(Taxales)红豆杉科中(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)多年生常绿乔木植物。主要分布于中国吉林老爷岭、张广才岭及长白山区，日本、朝鲜、俄罗斯也有分布。东北红豆杉具有非常高的观赏价值、药用价值和保健价值，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，在地球上已有250万年的历史，是植物活化石。东北红豆杉中的紫杉醇被认为是治愈多种癌症的新型抗癌药物。自然繁殖更新能力较低，加上人类过度砍伐，东北红豆杉资源非常稀少，1996年联合国教科文组织将其列为世界珍稀濒危植物，1999年被列为我国一级珍稀濒危野生植物，是全世界公认的植物界“大熊猫”。东北红豆杉T.cuspidata与南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana等其他红豆杉属植物的茎和叶型相似度非常高，尤其在幼苗期，利用形态学鉴别方法很难将东北红豆杉与其它四种红豆杉区分开，并且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。这也为东北红豆杉资源的鉴定、保护和利用带来了极大困难。因此，建立更为快速、准确鉴别东北红豆杉的方法是非常必要的。

与传统形态学鉴定技术相比，DNA分子标记技术不受环境及基因表达与否的限制，该技术能对不同发育时期的个体、任何组织器官甚至细胞作检测。DNA分子标记数量多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定，可以通过基因序列差异比较分析为植物鉴别、系统分类提供直接的证据。因此，DNA分子标记尤其是特异性分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴定方法的一些缺陷和难题，是传统形态学鉴定技术的高效辅助手段。本发明通过开发设计提供一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，并建立其鉴别方法，为实现该珍贵红豆杉种质资源的真伪鉴别及保护提供技术支持。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供用于鉴别东北红豆杉T.cuspidata的分子特异性标记引物，该分子特异性标记引物序列如下：

上游引物DHDSF：5’-GTGGACCTGAACAATGAA-3’，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物DHDSR：5’-AAACACCGTGTGGAACTT-3’，如SEQ ID NO.2所示；

该分子特异性标记引物的开发过程：首先，采用常规PCR技术及琼脂糖凝胶电泳检测，以及经过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选获得东北红豆杉的特异性DNA电泳位点。之后，经过切胶回收、TA克隆及测序分析，获得该特异性DNA序列(如SEQ ID NO.3所示)，在此基础上，开发获得东北红豆杉的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)。

以该分子特异性标记引物作为PCR扩增引物，对东北红豆杉及其相似近缘红豆杉物种(南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana)样品进行PCR扩增。经电泳检测，该引物只与东北红豆杉样本DNA发生反应，获得486bp大小的特异性DNA片段，而与南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fuana的样品材料不发生反应。为了验证该分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)的稳定性和应用范围，利用该引物对来自12个不同东北红豆杉个体的样本基因组总DNA进行PCR扩增，结果所有东北红豆杉样品都能扩增出486bp大小的特异性DNA条带，说明本发明提供的特异性标记引物具有非常好的稳定性和应用范围。

本发明的第二个目的是提供上述分子特异性标记引物对东北红豆杉进行鉴别的方法。采用上述分子特异性标记引物组合(DHDSF/DHDSR)作为特异性扩增引物，以被测东北红豆杉与其近缘相似红豆杉物种样品DNA为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳图谱中出现分子量为486bp大小的特异性DNA条带，则被测植物样品为东北红豆杉T.cuspidata，反之则不是。具体的所述方法如下：

(1)样品基因组总DNA提取：剪取被测植物样品(东北红豆杉及其近缘相似红豆杉物种)叶片0.15g放入研钵，加液氮研磨至粉末，然后，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(订购于上海生工生物工程股份有限公司)提取被测植物样品的基因组DNA。所得DNA用1.0％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL。

(2)PCR扩增反应：以步骤(1)提取的被测植物样品DNA为模板，以本专利提供的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)作为扩增引物，进行PCR扩增。

PCR反应体系(总体积25μL)：2.5μL的10×PCR Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂，质量含量1％TritonX-100]，1μL的模板DNA(50ng/μL)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL上游引物DHDSF(10μM)，1μL下游引物DHDSR(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，18.2μL的ddH₂O。

PCR反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸1.5min)；最后，72℃延伸10min。

(3)电泳检测：利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤(2)所得的PCR产物进行电泳检测。然后，利用凝胶成像系统(BIO-RAD Molecular

Gel Doc^TMXR+System with ImageLab^TM Software)进行拍照和DNA指纹图谱分析。若电泳图通道出现分子量为486bp大小的特异性DNA电泳条带，则被测植物样品为东北红豆杉，反之则不是。

本发明主要有益效果表现为：DHDSF/DHDSR是东北红豆杉的种特异性PCR扩增引物。若被测植物样品为东北红豆杉，则PCR反应为阳性，DNA指纹图谱上会出现486bp大小的特异性DNA电泳条带；若被测植物样品为其他近缘相似物种的样品DNA，则PCR反应为阴性，DNA指纹图谱不会出现486bp大小的特异性DNA电泳条带。从而实现东北红豆杉种质资源的快速、准确鉴别，使用方法简便，操作耗时短。

附图说明

图1为利用本发明提供的分子特异性标记引物(DHDSF/DHDSR)对被测红豆杉属植物进行PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图。其中，M为Trans2K DNA Marker(北京全式金生物技术有限公司)；通道C：阴性对照；1～6：东北红豆杉；通道7～12：曼迪亚红豆杉；通道13～18：南方红豆杉；通道19～24：云南红豆杉；通道25～30：密叶红豆杉。电泳图显示只有东北红豆杉所有样品扩增出分子量为486bp大小的特异性DNA条带。

图2是本发明所述的东北红豆杉的特异性核苷酸序列，以及东北红豆杉特异性引物DHDSF和DHDSR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为特异性引物DHDSF/DHDSR扩增的序列片段大小及位置。

图3为利用本发明提供的分子特异性标记引物对12种不同东北红豆杉个体样品的基因组总DNA进行PCR扩增的电泳图。其中M：DNA 分子量标准Trans2K DNA Marker；通道C：阴性对照；通道1～12：对应为12个不同东北红豆杉个体的样品。电泳图显示12个不同东北红豆杉个体样品均扩增出分子量为486bp大小的特异性DNA条带。

具体实施方式

本发明提供的分子特异性标记引物和方法可以快速、准确的鉴别东北红豆杉样品，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：东北红豆杉分子特异性标记引物开发设计

1、基因组DNA提取

取被测红豆杉植物样品新鲜叶片0.15g，其中样品包括来自东北红豆杉T.cuspidata、南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia、云南红豆杉T.yunnanensis和密叶红豆杉T.fauna的30个样品。立即加入液氮研磨至粉末。然后，利用UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(购于上海生工生物工程股份有限公司)进行样品总基因组DNA提取。所得基因组DNA用1.0％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μL，4℃保存，用于后续PCR扩增反应。

2.分子特异性标记引物DHDSF/DHDSR获得

通过常规PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测，以及经过大量DNA指纹图谱比较分析，筛选获得东北红豆杉特异性核苷酸片段。然后，经过切胶回收、克隆及测序，获得东北红豆杉特异性核苷酸序列(如SEQ ID NO.3所示)。获得东北红豆杉特异性核苷酸序列的方式为送上海生工生物工程股份有限公司测序。

最后，基于获得的东北红豆杉特异性核苷酸序列开发获得东北红豆杉的特异性标记引物DHDSF/DHDSR(上游引物DHDSF：5’-GTGGACCTGAACAATGAA-3’；下游引物DHDSR：5’-AAACACCGTGTGGAACTT-3’)。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

实施例2：特异性标记引物DHDSF/DHDSR的PCR扩增及电泳检测

以本发明开发的特异性标记引物组合DHDSF/DHDSR为扩增引物，30份红豆杉样品的总基因组DNA(具体见附图1说明)进行PCR扩增，以及电泳检测。

PCR反应体系(总体积25μL)：2.5μL的10×PCR Buffer[200mM Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，20mM MgCl₂，1％TritonX-100]，1μL的模板DNA(50ng/μL)，0.8μL的dNTPs(10mM)，1μL的上游引物DHDSF(10μM)，1μL的下游引物DHDSR(10μM)，0.5μL的Taq酶(2U/μL)，18.2μL的ddH₂O。

电泳检测：利用1.5﹪琼脂糖凝胶对步骤进行电泳检测。然后，利用凝胶成像系统(BIO-RAD Molecular

Gel Doc^TM XR+System with Image Lab^TM Software)进行拍照和DNA指纹图谱分析。所得电泳图如附图1所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2KDNA Marker；通道C：阴性对照；通道1～30为30份不同被测植物的样品，具体见附图1说明)。从附图1可以看出只有东北红豆杉(通道1～6)能扩增出486bp大小的特异性DNA片段，该序列的具体片段大小及碱基构成排序见附图2黑色标识部分。而其他红豆杉物种的所有样品都没有扩增出任何条带，这表明本发明提供的特异性标记引物专一性好，灵敏度高，可以用于东北红豆杉样品的快速鉴定。

实施例3：分子特异性标记引物DHDSF/DHDSR进一步验证

为了进一步验证发明开发的特异性标记引物DHDSF/DHDSR的稳定性和和应用范围，利用引物组合DHDSF/DHDSR对12份来自不同东北红豆杉个体的样品DNA进行PCR扩增和琼脂糖电泳检测；所得电泳图如附图3所示(图中，通道M为DNA分子量标准Trans2K DNAMarker；通道C：阴性对照；通道1～12：对应为12个不同东北红豆杉样品。附图3显示所有东北红豆杉样品都能扩增出486bp大小的特异性DNA条带，说明本发明提供的特异性标记引物DHDSF/DHDSR具有很好的稳定性和应用范围。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 杭州师范大学

<120> 一种东北红豆杉的分子特异性标记引物及其鉴别方法

<130> 1

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 1

gtggacctga acaatgaa 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

aaacaccgtg tggaactt 18

<210> 3

<211> 619

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

caacaatggc taccaccgct ttgatttcaa caataacaag attgaagggc aaacaagtgg 60

acctgaacaa tgaatttata gaaaaagaaa ccatattgga gacgtggaag gagttatgat 120

acaccaaggg tccatgtgga attgatatga ataaactgaa taagtatcac atggaacatg 180

taactaaaaa tatggttacc aaattgaatg atcaagatat atggtcgcaa gtgaacacaa 240

tgtggttaca cattgcataa aaaatgtcac acggaacaat atacaacata gaaagataca 300

ttacggacac tatcatcgac gaactgtgca catgtgagag aatcattttc ggtgttgtct 360

tattgttttt ggtatttttg gaaatcgaag tgctcgatga gcagaagaac aagatctagg 420

agtaccccat gcagagtaat tccctagtgg aaagatttga gaagtactta tttgaagggt 480

aaatgagtgg gtttttcaag aaaagggaag agatgtggta tgacaagttc cacacggtgt 540

ttgaagagga ctgacgaatc cctaatgatt taccttcggt ggtagccatt gttgaagact 600

ggagatctgg atccctcga 619

Claims

1.一种东北红豆杉的分子特异性标记引物，其特征在于，该特异性标记引物序列如下：

上游引物DHDSF，如SEQ ID NO.1所示；

下游引物DHDSR，如SEQ ID NO.2所示。

2.利用权利要求1所述的一种东北红豆杉的分子特异性标记引物对东北红豆杉进行鉴别的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）提取被测红豆杉植物样品的基因组DNA；

（2）以步骤（1）提取的被测植物样品DNA为扩增模板，以所述分子特异性标记引物DHDSF和DHDSR作为扩增引物，进行PCR扩增；

（3）对步骤（2）获得的PCR扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现486bp大小的特异性DNA片段，则被测植物样品为东北红豆杉，反之则不是。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤（2）中，所述的PCR扩增体系的总体积为25μL，具体为：含MgCl₂的 10×PCR Buffer 2.5 μL，50 ng/μL的模板DNA 1 μL，10 mM的dNTPs 0.8 μL，10 μM的上游引物DHDSF 1 μL，10 μM的下游引物DHDSR 1 μL，2 U/μL 的Taq酶0.5 μL，ddH₂O 18.2 μL。

4.如权利要求2所述的对东北红豆杉进行鉴别的方法，其特征在于步骤（2）中，所述的PCR扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性50 s，56℃退火50 s，72℃延伸1.5 min，32个循环；最后，72℃延伸10 min。