CN105209636A - 用于癌症预后的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供的是评估来自患者的癌症样品例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法。还提供的是用于预测前列腺癌的生物标志物实验对象组。还提供的是通过鉴定侵袭性前列腺癌或可能具有致死结果的前列腺癌来治疗前列腺癌的方法。

Description

用于癌症预后的组合物和方法
相关申请
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,003的利益，所述美国临时申请的完整内容在此通过引用全文并入。
发明领域
本发明涉及使用生物标志物实验对象组来预测癌症患者中的预后。
发明背景
前列腺癌(PCA)是男性中最常见的癌症。大多数老年男性具有前列腺瘤形成，其中绝大多数病例保持局限性且是无痛的，无需治疗干预。然而，存在早期PCA子集，其对于侵袭性恶性肿瘤是“硬连线的”，并且如果未经治疗，则将扩散到前列腺外且持续地进展至转移性疾病并最终死亡。目前无法准确地区别无痛和侵袭性疾病，这使患有潜在无痛疾病的许多男性遭受不必要的根治性治疗干预，例如前列腺切除术和束辐射，伴随高发病率。单独在美国，与前列腺癌过度治疗相关的成本估计每年超过20亿美元。这还不包括来自治疗程序的生活质量影响。同时，患有潜在侵袭性PCA的一些患者治疗不足，并且由于疾病进展而死亡。
使前列腺癌分层以预测结果的目前方法基于临床因素，包括格里森(Gleason)分级、前列腺特异性抗原(PSA)水平和肿瘤分期。然而，这些因素无法完全预测结果，并且无法可靠地联系至最有意义的转移风险和PCA特异性死亡的临床终点。这种未满足的医学需要已推动明确PCA进展的遗传和生物学基础的努力，目标是鉴定能够指定进展风险的生物标志物，并且提供靶向介入疗法的机会。人PCA的遗传研究已鉴定了许多标志事件，包括PTEN肿瘤抑制子失活以及ETS家族易位和失调，以及其它遗传或表观遗传改变例如Nkx3.1、c-Myc和SPINK。总体分子分析还已鉴定潜在复发/转移生物标志物的阵列，例如ECAD、AIPC、Pim-1激酶、hepsin、AMACR和EZH2。然而，人PCA的强烈异质性已限制单一生物标志物在临床环境中的效用，因此提示更广泛的转录特征谱分析研究以确定预后多基因生物标志物实验对象组或标志。这些实验对象组或标志可能看起来更强力，但它们的临床效用仍是不确定的，这是由于转录网络的固有噪声和环境特异性质以及癌症基因组的极端不稳定性，伴随无数旁观者遗传和表观遗传事件，其产生显著的疾病异质性。因此，存在对于早期肿瘤中的更准确的预后测试的需要，所述预后测试可用于特别是在早期预测癌症的出现和行为，并且因此可用于指导用于前列腺癌患者的适当治疗。
发明概述
在一个方面，本文提供的是评估来自患者的癌症样品例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法。该方法包括鉴定FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)的1、2、3、4、5、6、7或8种肿瘤标志物或者所述肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平例如量或表达水平，从而评估所述肿瘤样品。
在实施方案中，该方法包括例如直接或间接获取针对肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法包括直接获取信号。
在实施方案中，该方法包括直接或间接获取癌症样品。
本文还提供的是包含下述的反应混合物：(a)癌症样品；和(b)针对FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)的1、2、3、4、5、6、7或8种肿瘤标志物或者所述肿瘤标志物的DNA或mRNA的检测试剂。在反应混合物的一些实施方案中，癌症样品包含多个部分，例如薄片或等分试样。在反应混合物的一些实施方案中，癌症样品的第一部分包含针对第一所述标志物而不是全部所述标志物的检测试剂，并且癌症样品的第二部分包含针对标志物之一的检测标志物的检测试剂，但不包含针对第一标志物的检测试剂。
本文还提供的是评估来自患者的样品，例如组织样品，例如癌症样品，例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法。该方法包括：(a)在来自所述样品的目标区域(ROI)中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，从而评估所述样品。
在实施方案中，样品是癌症样品。在实施方案中，样品包含来自实体瘤的细胞。在实施方案中，样品包含来自液体肿瘤的细胞。在实施方案中，通过形态特征来限定或选择ROI。
在实施方案中，通过手动或自动手段以及ROI与其它细胞或材料的物理分离，例如通过使ROI例如癌性区域与其它组织例如非癌性细胞剥离，来限定或选择ROI。在实施方案中，通过非形态特征例如ROI标志物来限定或选择ROI。在实施方案中，通过细胞分选的方式借助ROI标志物的包含来鉴定或选择ROI。在实施方案中，通过形态和非形态选择的组合来鉴定或选择ROI。
在实施方案中，在第一ROI例如第一癌性区域中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，并且在第二ROI例如第二癌性区域中，鉴定第二区域表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。
在实施方案中，在相同ROI例如相同癌性区域中，鉴定第一和第二区域表型标志物例如肿瘤标志物的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括：(b)鉴定ROI，例如对应于癌性区域的ROI。
在一些实施方案中，(a)在(b)之前执行。
在其它实施方案中，(b)在(a)之前执行。
在实施方案中，第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平的鉴定包括例如直接或间接获取与检测试剂与所述第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的结合相关的例如成比例的信号。
在实施方案中，该方法包括使样品与针对第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的检测试剂接触。
在实施方案中，该方法包括使样品与针对ROI标志物例如上皮标志物的检测试剂接触。
在实施方案中，该方法进一步包括采集样品的图像，并且分析图像。在一些此类实施方案中，该方法包括由所述图像计算针对所述患者的风险得分。
在实施方案中，该方法包括使样品与针对第一区域表型标志物例如肿瘤标志物的检测试剂接触，并且获取针对检测试剂的结合的值。在一些此类实施方案中，该方法包括由该值计算针对所述患者的风险得分。
在实施方案中，该方法进一步包括(b)使样品与针对ROI标志物的检测试剂接触。在实施方案中，该方法进一步包括(c)限定ROI。在实施方案中，该方法进一步包括(d)鉴定所述ROI中的区域表型标志物例如肿瘤标志物的水平。在实施方案中，该方法进一步包括(e)分析所述水平以提供风险得分。在实施方案中，该方法进一步包括重复步骤(a)-(d)。
在实施方案中，该方法进一步包括(i)使所述样品经历一种或多种物理分离步骤，例如解离例如胰蛋白酶化所述样品，剥离所述样品，或使所述样品与针对ROI标志物的检测试剂接触；(ii)使所述ROI与检测试剂接触；和/或(iii)检测来自所述ROI的信号。
本文还表征了评估来自患者的肿瘤样品例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法，其包括：
(a)在ROI例如癌性ROI中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物或者所述第一肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平例如量，例如其中所述第一肿瘤标志物选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)，从而评估所述肿瘤样品。
在实施方案中，在第一ROI例如癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，并且在第二ROI例如第二癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第二区域表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。在实施方案中，通过相同方法或标准鉴定或选择所述第一ROI例如癌性ROI和所述ROI例如第二癌性ROI。在实施方案中，在相同ROI例如相同癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一和第二区域表型标志物例如第一和第二肿瘤标志物的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括：(b)鉴定ROI，例如对应于肿瘤上皮的所述肿瘤样品的ROI。在该方法的一些实施方案中，(a)在(b)之前执行。在该方法的一些实施方案中，(b)在(a)之前执行。
在实施方案中，第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平的鉴定包括例如直接或间接获取与检测试剂与所述第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的结合相关的例如成比例的信号。在实施方案中，肿瘤标志物是编码FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9HSPA9的DNA。在实施方案中，肿瘤标志物是编码FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的mRNA。在实施方案中，肿瘤标志物是选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的蛋白质。
在实施方案中，该方法包括使样品与针对肿瘤标志物集合的标志物的检测试剂接触，直接或间接获取样品的图像，并且分析图像。在实施方案中，该方法包括由该图像计算针对患者的风险得分。
在实施方案中，该方法包括使样品与针对肿瘤标志物集合的第一标志物的检测试剂接触，直接或间接获取针对检测试剂的结合的值。在实施方案中，该方法包括由所述值计算针对所述患者的风险得分。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物或者针对所述第二肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，所述第二肿瘤标志物是来自所述肿瘤标志物集合的蛋白质。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物或者针对所述第三肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物或者针对所述第四肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物或者针对所述第五肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物或者针对所述第六肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物或者针对所述第七肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物或者针对所述第八肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括鉴定除标志物或所述肿瘤标志物集合之外的本文公开的另外标志物的水平。
在实施方案中，在癌性ROI中鉴定所述另外标志物的水平。
在实施方案中，在良性ROI中鉴定所述另外标志物的水平。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，其中该方法进一步包括提供所述肿瘤样品或所述癌症样品。(如本文使用的，除非上下文另有说明，否则术语“癌症样品”和“肿瘤样品”是可互换的。)
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，该方法进一步包括来自另一实体例如医院、实验室或诊所的所述肿瘤样品。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品包含前列腺组织切片或薄片。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品包含多个部分，例如多个前列腺组织切片或薄片。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品是经固定的，例如经福尔马林固定。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品包埋在基质中。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品是石蜡包埋的。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品是去石蜡的。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述癌症样品或所述肿瘤样品是福尔马林固定、石蜡包埋的样品或其等价物。
在实施方案中，癌症样品或肿瘤样品制备(例如去石蜡)是自动化的。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，检测试剂与所述癌症样品或肿瘤样品的接触是自动化的。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，将癌症样品或肿瘤样品置于自动化扫描仪中。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，将癌症样品或肿瘤样品，例如前列腺组织的部分例如切片或薄片，布置在基底例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。在一些此类实施方案中，将所述肿瘤样品的第一部分例如切片或薄片布置在第一基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。在实施方案中，将所述肿瘤样品的第二部分例如切片或薄片布置在第二基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。在实施方案中，将所述肿瘤样品的第三部分例如切片或薄片布置在第三基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。在实施方案中，将所述肿瘤样品的第四部分例如切片或薄片布置在第四基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
在实施方案中，同时分析所述第一和第二部分。在实施方案中，相继分析所述第一和第二部分。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，所述检测试剂包含肿瘤标志物抗体，例如肿瘤标志物单克隆抗体，例如针对FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的肿瘤标志物抗体。在实施方案中，所述肿瘤标志物抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，所述检测试剂包含第二抗体，其是针对所述肿瘤标志物抗体的抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，所述检测试剂包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，使癌症或肿瘤样品与下述接触：
第一ROI标志物检测试剂，例如总上皮检测试剂，例如如本文描述的，具有第一发射特征谱，例如第一峰值发射，或其在第一通道中进行测量；
第二ROI标志物检测试剂，例如基底上皮检测试剂，例如如本文描述的，具有第二发射特征谱，例如第二峰值发射，或其在第二通道中进行测量；
区域表型标志物，例如肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第三发射特征谱，例如第三峰值发射，或其在第三通道中进行测量。
在实施方案中，癌症或肿瘤样品进一步与核检测试剂接触，所述核检测试剂具有第四发射特征谱，例如第四峰值发射，或其在第四通道中进行测量。
在实施方案中，癌症或肿瘤样品进一步与下述接触：第二区域表型标志物，例如第二肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第五发射特征谱，例如第五峰值发射，或其在第五通道中进行测量。
在实施方案中，癌症或肿瘤样品进一步与下述接触：第三区域表型标志物，例如第三肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第六发射特征谱，例如第六峰值发射，或其在第六通道中进行测量。
在前述方法中任一种的任何的实施方案中，鉴定ROI例如癌性ROI包括鉴定具有缺乏基底细胞外层的上皮结构的区域。
在实施方案中，用第一ROI特异性检测试剂，例如第一总上皮特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK8抗体或抗CK18抗体例如单克隆抗体，来检测上皮结构。
在实施方案中，用所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮特异性检测试剂，以及第二ROI特异性检测试剂，例如第二总上皮特异性检测试剂，来检测上皮结构。
在实施方案中，所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮特异性检测试剂，以及所述第二ROI特异性检测试剂，例如所述第二总上皮特异性检测试剂中的一种是CK8检测试剂，例如抗CK8抗体例如单克隆抗体，并且另一种是CK18结合试剂，例如抗CK18抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，针对所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮检测试剂的结合的信号通过第一通道例如在第一波长处进行检测。
在实施方案中，针对所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮检测试剂的结合的信号，以及针对所述第二ROI特异性检测试剂，例如所述第二总上皮检测试剂的信号，通过所述第一通道例如在第一波长处进行检测。
在实施方案中，所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮检测试剂，包含标志物抗体例如标志物单克隆抗体。
在实施方案中，所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮检测试剂，缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮结合试剂，包含第二抗体，其是针对所述标志物抗体的抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮结合试剂，包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，用ROI特异性检测试剂，例如基底上皮检测试剂，例如本文描述的基底上皮检测试剂，来检测基底细胞的存在或不存在。
在实施方案中，该方法进一步包括鉴定对应于所述肿瘤样品的良性ROI的ROI，例如第二ROI。
在实施方案中，鉴定良性ROI包括鉴定具有以基底细胞外层为界的上皮结构的区域。
在实施方案中，用针对基底上皮的ROI特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，或抗TRIM29抗体例如单克隆抗体，来检测基底细胞。
在实施方案中，用针对基底上皮的所述ROI特异性检测试剂，以及针对基底上皮的第二ROI特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，或抗TRIM29抗体例如单克隆抗体，来检测基底细胞。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂以及针对基底上皮的所述ROI特异性检测试剂中的一种是CK5检测试剂，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，并且另一种是TRIM29检测试剂，例如抗TRIM29抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂的结合的信号通过第一通道例如在第一波长处进行检测。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂的结合的信号，以及针对基底上皮的所述第二ROI特异性检测试剂的信号，通过所述第一通道例如在第一波长处进行检测。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含标志物抗体例如标志物单克隆抗体。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含针对所述标志物抗体的第二抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
在实施方案中，所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
在实施方案中，该方法进一步包括将所述肿瘤样品的ROI鉴定为间质的。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括(i.a)直接或间接获取针对总上皮特异性标志物例如CK8的信号；(ii.a)直接或间接获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法进一步包括：(i.b)直接或间接获取针对第二总上皮特异性标志物例如CK18的信号；(ii.b)直接或间接获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(iii)直接或间接获取针对核标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(iv)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(v)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(vi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(vii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(viii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(ix)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括(x)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物的信号。
在实施方案中，针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。
在实施方案中，针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括：(i.a)直接或间接获取针对总上皮特异性标志物例如CK8的信号；(i.b)直接或间接获取针对第二总上皮特异性标志物例如CK18的信号；(ii.a)直接或间接获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号；(ii.b)直接或间接获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号；(iii)直接或间接获取针对核标志物的信号；(iv)直接或间接获取针对第一肿瘤标志物的信号；(v)直接或间接获取针对第二肿瘤标志物的信号；或(vi)直接或间接获取针对第三肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法包括(i.a)、(ii.a)、(iii)和(iv)。在实施方案中，该方法包括(i.a)、(i.b)、(ii.a)、(ii.b)、(iii)和(iv)。在实施方案中，该方法包括(i.a)-(v)的全部。在实施方案中，该方法包括(i.a)-(vi)的全部。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，鉴定质量控制标志物的水平。在实施方案中，所述质量控制标志物选自肿瘤标志物集合，例如DERL1。
在实施方案中，该方法进一步包括使所述样品与针对所述质量控制标志物的检测试剂接触。
在实施方案中，该方法进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，例如直接或间接获取与所述检测试剂与所述第一质量控制标志物的结合相关的例如成比例的信号。
在实施方案中，该方法进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物的水平。在实施方案中，所述第二质量控制标志物不是来自所述肿瘤标志物集合的标志物。在实施方案中，所述第二质量控制标志物与肿瘤的致死率或侵袭性相关。在实施方案中，所述第二质量控制标志物是本文描述的标志物，例如除来自所述肿瘤标志物集合的标志物之外的肿瘤标志物。在实施方案中，所述第二质量控制标志物选自ACTN和VDAC1。
在实施方案中，该方法进一步包括在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物的水平。在实施方案中，所述第三质量控制标志物不是来自所述肿瘤标志物集合的标志物。在实施方案中，所述第三质量控制标志物是本文描述的标志物，例如除来自所述肿瘤标志物集合的标志物之外的肿瘤标志物。在实施方案中，所述第三质量控制标志物选自ACTN和VDAC1。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法进一步包括在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平例如量；并且在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平。在实施方案中，在相同的第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一、第二和第三质量控制标志物的水平。在实施方案中，在不同的第二ROI例如不同的良性ROI中，鉴定第一、第二和第三质量控制标志物的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平；在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平；并且在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平，其中响应所述水平，将样品分类为例如可接受的或不可接受的。
在实施方案中，该方法包括检测针对所述质量控制标志物之一的水平的信号。在实施方案中，针对检测到的信号的第一值指示第一质量水平，例如可接受的质量，并且针对检测到的信号的第二值指示第二质量水平，例如不可接受的质量。在实施方案中，响应所述值，将样品进行加工或不进行加工，例如弃去，或改变用于分析的参数。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括采集来自所述样品的多光谱图像，并且将所述多光谱图像解混至下述通道：针对第一ROI特异性检测试剂例如上皮特异性标志物的通道；针对第二ROI特异性检测试剂例如基底上皮特异性标志物的通道；针对核特异性信号例如DAPI信号的通道；以及针对第一群体表型标志物例如第一肿瘤标志物的通道。在实施方案中，该方法包括：使用第一通道来收集针对第一ROI特异性检测试剂例如总上皮标志物的信号；使用第二通道来收集针对第二ROI特异性检测试剂例如基底上皮标志物的信号；使用第三通道来收集针对核区域的信号；使用第四通道来收集针对第一群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第一肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：使用第五通道来收集针对第二群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第二肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：使用第六通道来收集针对第三群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第三肿瘤标志物的信号。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括采集待分析的样品的区域的图像，例如作为DAPI过滤图像。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括例如通过将组织发现算法应用于从所述样品中收集的图像来定位组织。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括用DAPI和FITC单色过滤器来重新采集图像。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括应用组织发现算法，例如以确保采集含有足够组织的预选数目的视野图像。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括直接或间接获取DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器的连续曝光。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括采集待分析的样品的区域的多光谱图像。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将所述样品的区域分段成上皮细胞、基底细胞和间质。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法进一步包括将所述样品的区域鉴定为细胞质和核区域。
权利要求1-166中任一项的方法，其包括在癌性ROI的细胞质、核和/或全细胞中，例如直接或间接获取针对群体表型标志物例如肿瘤标志物的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括在良性ROI的细胞质、核和/或全细胞中，例如直接或间接获取针对群体表型标志物例如肿瘤标志物的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，所述癌症或肿瘤样品包含多个部分，例如多个切片或薄片。
在实施方案中，该方法包括执行本文描述的步骤，例如从第一部分例如切片或薄片中收集或获取信号，或形成图像，例如鉴定第一群体表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平；和执行本文描述的步骤，例如从第二部分例如切片或薄片中收集或获取信号，或形成图像，例如鉴定第二群体表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。在实施方案中，所述第二肿瘤标志物选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9。在实施方案中，该方法进一步包括：在所述肿瘤样品的第二部分例如第二切片或薄片中，鉴定对应于肿瘤上皮的ROI；从对应于肿瘤上皮的所述ROI中，例如直接或间接获取针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第二肿瘤标志物的信号。
在实施方案中，该方法包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(i.a)获取针对上皮特异性标志物例如CK8的信号；(ii.a)获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。
在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(i.b)获取针对第二上皮特异性标志物例如CK18的信号；(ii.b)获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。
在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(iii)获取针对核标志物的信号。
在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(iv)获取针对权利要求1的第二肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(v)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(vi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(vii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(viii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(ix)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(x)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，(xi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物的信号。
在实施方案中，针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。
在实施方案中，针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。
在实施方案中，该方法进一步包括在所述肿瘤样品的第三部分例如第三切片或薄片中，鉴定对应于肿瘤上皮的ROI；从对应于肿瘤上皮的所述ROI中，例如直接或间接获取针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第三肿瘤标志物的信号。
在实施方案中，该方法包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片：(i.a)获取针对上皮特异性标志物例如CK8的信号；(ii.a)获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，(i.b)获取针对第二上皮特异性标志物例如CK18的信号；(ii.b)获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，(iii)获取针对核标志物的信号。在实施方案中，该方法进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，(iv)获取针对权利要求1的第二肿瘤标志物的信号。在实施方案中，针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。在实施方案中，针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同通道中收集。
在前述方法中任一种的实施方案中，将第一肿瘤样品部分例如第一切片或薄片布置在第一衬底上。在实施方案中，将第二肿瘤样品部分例如第二切片或薄片布置在第二衬底上。在实施方案中，将第三肿瘤样品部分例如第三切片或薄片布置在第三衬底上。在实施方案中，将第四肿瘤样品部分例如第四切片或薄片布置在第四衬底上。
在实施方案中，将第一肿瘤样品部分例如第一切片或薄片以及第二肿瘤样品部分例如第二切片或薄片布置在相同衬底上。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法进一步包括将来自本文描述的方法中的任何步骤的对应于从所述样品获取的信号、值或图像的值保存或储存于数字或电子介质例如计算机数据库中。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定核区域。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定细胞质区。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定癌性ROI。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定良性ROI。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以提供针对所述肿瘤标志物在癌性ROI中的水平的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以提供针对所述肿瘤标志物在良性ROI中的水平的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号，提供针对区域表型标志物例如肿瘤标志物在癌性ROI中的水平的值。在实施方案中，该方法包括计算针对所述患者的风险得分。在实施方案中，该方法包括响应所述值计算针对所述患者的风险得分。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在良性ROI中的水平的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号、以及针对第三ROI标志物例如核特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在癌性ROI中的细胞质水平的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号、以及针对第三ROI标志物例如核特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在良性ROI中的核水平的值。
在前述方法中任一种的实施方案中，该方法包括响应所述值中的一种或多种，计算针对所述患者的风险得分。
在实施方案中，该方法包括计算针对所述患者的风险得分，其中所述风险得分与针对前列腺外扩散或转移的潜力关联。
在实施方案中，该方法包括响应所述风险得分，预后所述患者、分类患者、选择用于所述患者的治疗过程、或给所述患者施用所选择的治疗过程。
在实施方案中，所述风险得分对应于‘有利’病例(例如手术格里森3+3或3伴随最低限度4，局限于器官的(≤T2)肿瘤)。
在实施方案中，所述风险得分对应于‘不利’病例(例如包膜渗透(T3a)、精囊侵入(T3b)、淋巴结转移或占优势的格里森4模式或更高)。
在实施方案中，所述风险得分允许区分‘有利’病例(例如手术格里森3+3或3伴随最低限度4，局限于器官的(≤T2)肿瘤)和‘不利’病例(例如包膜渗透(T3a)、精囊侵入(T3b)、淋巴结转移或占优势的格里森4模式或更高)。
在实施方案中，所述风险得分对应于或预测：3+3的手术格里森或局限性疾病(≤T3a)(定义为‘低风险’)；手术格里森≥3+4或非局限性疾病(T3b、N或M)(定义为‘中-高风险’)；手术格里森≤3+4和局限于器官的疾病(≤T2)(定义为‘有利的’)；或手术格里森≥4+3或非局限于器官的疾病(T3a、T3b、N或M)(‘不利的’)。
在其中计算风险得分的实施方案中，该方法进一步包括响应所述风险得分，将所述患者鉴定为患有侵袭性癌症或具有增高的风险或癌症相关的致死结果。
在其中计算风险得分的实施方案中，该方法进一步包括(例如响应所述风险得分)选择所述患者用于辅助疗法或给所述患者施用辅助疗法。
本文还提供的是包含针对肿瘤标志物FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9中的1、2、3、4、5、6、7种或全部的检测试剂的试剂盒。在实施方案中，该试剂盒进一步包含针对总上皮标志物和基底上皮标志物的检测试剂。
本文还提供的是在其上布置有下述的癌症样品例如前列腺肿瘤样品：针对总上皮标志物的检测试剂；针对基底上皮标志物的检测试剂；针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的肿瘤标志物的检测试剂。在实施方案中，癌症样品例如前列腺肿瘤样品包含多个部分例如薄片。
在实施方案中，癌症样品例如前列腺肿瘤样品具有在其上进一步布置的针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的第二肿瘤标志物的检测试剂。
本文还表征了评估来自患者的前列腺肿瘤样品的计算机实现的方法，该方法包括：(i)鉴定对应于肿瘤上皮的所述肿瘤样品的ROI(癌性ROI)；(ii)在癌性ROI中，鉴定下述肿瘤标志物FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)各自的水平例如量，其中鉴定肿瘤标志物的水平包括例如直接或间接获取与针对所述肿瘤标志物的抗体的结合相关的例如成比例的信号；(iii)提供针对肿瘤标志物各自在癌性ROI中的水平的值；和(iv)响应所述值，评估所述肿瘤样品，包括例如通过算法地组合所述水平来对所述患者指定风险得分，从而评估前列腺肿瘤样品。
在实施方案中，该方法包括：使用第一通道来收集针对总上皮标志物的信号；使用第二通道来收集针对基底上皮标志物的信号；使用第三通道来收集针对核区域的信号；使用第四通道来收集针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的肿瘤标志物的信号。
在实施方案中，在第一癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一肿瘤标志物的水平，并且在第二癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的水平。
在实施方案中，在相同癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一和第二肿瘤标志物的水平。
在实施方案中，该方法进一步包括：在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平；在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平；并且在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平，其中响应所述水平，将样品分类为例如可接受的或不可接受的。
本发明提供了用于预测患者(例如人患者)中的癌症(例如前列腺癌)的预后的方法。这些方法提供针对患者是否患有侵袭性形式的癌症或处于患有侵袭性形式的癌症的风险中，和/或针对患者是否处于具有癌症相关的致死结果的风险中的可靠预测。
在一些实施方案中，本发明的预后方法包括在得自患者的样品中，测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种预后决定因素(PD)的水平，其中所测量的水平指示癌症患者的预后。
在一些实施方案中，本发明的预后方法包括
在得自患者的样品中，测量选自下述的两种或更多种PD的水平：
(1)至少一种细胞骨架基因或蛋白质(例如α-辅肌动蛋白例如α-辅肌动蛋白1、2、3和4)；
(2)至少一种泛素化基因或蛋白质(例如CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7、DERL1、DERL2和DERL3)；
(3)至少一种依赖性受体基因或蛋白质(例如DCC、再生蛋白(neogenin)、p75NTR、RET、TrkC、Ptc、EphA4、ALK和MET)；
(4)至少一种DNA修复基因或蛋白质(例如FUS、EWS、TAF15、SARF和TLS)；
(5)至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质(例如PDSS1和PDSS2)；
(6)至少一种PI3K途径基因或蛋白质(例如RpS6和PLAG1)；
(7)至少一种TFG-β途径基因或蛋白质(例如SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5和SMAD9)；
(8)至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质(例如VDAC1、VDAC2、VDAC3、TOMM40和TOMM40L)；和/或
(9)至少一种RNA剪接基因或蛋白质(例如U2AF或YBX1)；
其中所测量的水平指示癌症患者的预后。
该方法可以包括从患者中获得样品(例如癌性组织样品)的另外步骤。样品可以是固体组织样品例如肿瘤样品。固体组织样品可以是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的组织样品、快速冷冻的组织样品、乙醇固定的组织样品、用有机溶剂固定的组织样品、用塑料或环氧树脂固定的组织样品、交联的组织样品、手术摘除的肿瘤组织、或活组织检查样品，例如核心活组织检查、切除组织活组织检查、或切口组织活组织检查。在其它实施方案中，样品可以是液体样品，包括血液样品和循环肿瘤细胞(CTC)样品。在其它实施方案中，组织样品是前列腺组织样品，例如FFPE前列腺肿瘤样品。
在一些实施方案中，本发明的预后方法测量包含下述的两种或更多种PD的RNA或蛋白质水平：至少ACTN1、YBX1、SMAD2和FUS；至少ACTN1、YBX1和SMAD2；至少ACTN1、YBX1和FUS；至少ACTN1、SMAD2和FUS；或至少YBX1、SMAD2和FUS。
在一些实施方案中，本发明的方法测量至少三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种PD。在其它实施方案中，该方法测量三种PD(即PD1-3)、四种PD(即PD1-4)、五种PD(即PD1-5)、六种PD(即PD1-6)、七种PD(即PD1-7)、八种PD(即PD1-8)、九种PD(即PD1-9)、十种PD(即PD1-10)、十一种PD(即PD1-11)、或十二种PD(即PD1-12)，其中所述PD全部彼此不同，并且独立地选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
在一些实施方案中，本发明的预后方法测量一种或多种PD，所述PD的水平在侵袭性形式的癌症或具有高的致死结果风险的癌症中相对于参考值是上调的。此类PD可以是例如CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1。该方法可以测量一种或多种PD，所述PD的水平在侵袭性形式的癌症或具有高的致死结果风险的癌症中相对于参考值是下调的。此类PD可以是例如ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1。
在其它实施方案中，除选自上述十二种生物标志物组的PD之外，本发明的方法还测量选自下述的一种或多种PD：HOXB13、FAK1、COX6C、FKBP5、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。
通过例如抗体或其抗原结合片段，本发明的预后方法可以测量所选择的PD的表达水平。表达或蛋白质水平可以通过免疫组织化学或免疫荧光进行测量。例如，针对PD的抗体或抗原结合片段可以各自通过不同荧光团进行标记或结合，并且来自荧光团的信号可以通过自动化成像机器分开或同时(多路)检测。在一些实施方案中，组织样品可以用DAPI进行染色。在一些实施方案中，该方法可以测量亚细胞区室例如核、细胞质或细胞膜中的所选择的PD的蛋白质水平。备选地，测量可以在整个细胞中完成。
测量可以在组织样品的限定目标区域，例如在其中排除非癌性细胞的肿瘤区域中完成。例如，可以通过其与抗细胞角蛋白5抗体和/或抗TRIM29抗体的结合(例如染色)，和/或通过其与抗细胞角蛋白8抗体或抗细胞角蛋白18抗体的特异性结合的缺乏(不显著高于本底噪声水平)，来鉴定非癌性细胞。另一方面，可以通过其与抗细胞角蛋白8抗体和/或抗细胞角蛋白18抗体的结合(例如染色)，和/或通过其与抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体的特异性结合的缺乏，来鉴定癌性细胞。在具体的实施方案中，该方法包括使FFPE前列腺肿瘤样品的横截面与抗细胞角蛋白8抗体、抗细胞角蛋白18抗体、抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体接触，其中在由抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体结合但不由抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体结合的横截面中的区域中进行所述测量步骤。
在一些实施方案中，除测量本发明的生物标志物之外，可期望评价与目标癌症相关的至少一种标准参数，例如格里森评分、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤的视觉特征、肿瘤部位、肿瘤生长、淋巴结状态、肿瘤厚度(布瑞斯罗夫(Breslow)得分)、溃疡、发病年龄、PSA水平和PSA动力学。
本发明的预后方法可在临床上用于改善癌症治疗的功效，并且避免不必要的治疗。例如，本发明的生物标志物和诊断方法可以用于鉴定需要辅助疗法的癌症患者，这包括获得来自患者的组织样品；在样品中测量本文描述的生物标志物的水平，随后可以用辅助疗法治疗具有侵袭性癌症或具有癌症相关致死结果的风险升高的预后的患者。相应地，本发明还提供了通过下述治疗癌症患者的方法：鉴定或选择如通过本发明的预后方法测定的具有不利预后的患者，并且仅用辅助疗法治疗具有不利预后的那些患者。辅助疗法可以施用于已接受标准护理疗法的患者，所述标准护理疗法为例如手术、放射、化学疗法或雄激素消融。辅助疗法的例子包括但不限于放射疗法、化学疗法、免疫疗法、激素疗法和靶向疗法。靶向疗法可以靶向信号传导途径的组分，在所述信号传导途径中所选择的PD中的一种或多种是组分，并且其中被靶向的组分与所选择的PD相同或不同。
本发明还提供了用于测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种PD的水平的诊断试剂盒，其包含用于特异性测量所选择的PD的水平的试剂。试剂可以包含一种或多种抗体或其抗原结合片段、寡核苷酸或适体。试剂可以测量例如所选择的PD的RNA转录物水平或蛋白质水平。
本发明还提供了鉴定能够降低癌症进展风险或者延迟或减缓癌症进展的化合物的方法，其包括：(a)提供表达选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的PD的细胞；(b)使细胞与候选化合物接触；和(c)测定所述候选化合物是否改变所选择的PD的表达或活性；由此在化合物的存在下观察到的改变指示该化合物能够降低癌症进展的风险，或者延迟或减缓癌症进展。如此鉴定的化合物可以用于本发明的癌症治疗方法中。
本文还描述的是下述实施方案：
实施方案1.用于预测癌症患者的预后的方法，其包括：
在得自患者的样品中，测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种预后决定因素(PD)的水平，
其中所测量的水平指示癌症患者的预后。
实施方案2.用于预测癌症患者的预后的方法，其包括：
在得自患者的样品中，测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质；或至少一种RNA剪接基因或蛋白质；
其中所测量的水平指示癌症患者的预后。
实施方案3.实施方案2的方法，其中所述至少一种细胞骨架基因或蛋白质是α-辅肌动蛋白1、α-辅肌动蛋白2、α-辅肌动蛋白3或α-辅肌动蛋白4；所述至少一种泛素化基因或蛋白质是CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7、DERL1、DERL2或DERL3；所述至少一种依赖性受体基因或蛋白质是DCC、再生蛋白、p75NTR、RET、TrkC、Ptc、EphA4、ALK或MET；所述至少一种DNA修复基因或蛋白质是FUS、EWS、TAF15、SARF或TLS；所述至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质是PDSS1或PDSS2；所述至少一种PI3K途径基因或蛋白质是RpS6或PLAG1；所述至少一种TFG-β途径基因或蛋白质是SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD5或SMAD9；所述至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质是VDAC1、VDAC2、VDAC3、TOMM40或TOMM40L；或所述至少一种RNA剪接基因或蛋白质是U2AF或YBX1。
实施方案4.实施方案1-3中任一项的方法，其进一步包括获得来自患者的样品的步骤。
实施方案5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述预后为癌症是侵袭性形式的癌症。
实施方案6.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述预后为患者处于具有侵袭性形式的癌症的风险中。
实施方案7.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述预后为患者处于具有癌症相关的致死结果的风险中。
实施方案8.用于鉴定需要辅助疗法的癌症患者的方法，其包括：
获得来自患者的组织样品；和
在样品中测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种PD的水平，
其中所测量的水平指示患者需要辅助疗法。
实施方案9.用于鉴定需要辅助疗法的癌症患者的方法，其包括：
获得来自患者的组织样品；和
在样品中测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质；或至少一种RNA剪接基因或蛋白质；
其中所测量的水平指示患者需要辅助疗法。
实施方案10.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种PD的水平；和
如果所测量的水平指示患者具有侵袭性形式的癌症或处于具有癌症相关的致死结果的风险中，则用辅助疗法治疗患者。
实施方案11.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
鉴定在至少两种PD中具有水平变化的患者，其中所述水平变化选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1中的一种或多种的上调和ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1中的一种或多种的下调；和
用辅助疗法治疗患者。
实施方案12.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质；或至少一种RNA剪接基因或蛋白质；和
如果所测量的水平指示患者具有侵袭性形式的癌症或处于具有癌症相关的致死结果的风险中，则用辅助疗法治疗患者。
实施方案13.实施方案8-12中任一项的方法，其中所述辅助疗法选自放射疗法、化学疗法、免疫疗法、激素疗法和靶向疗法。
实施方案14.实施方案13的方法，其中所述靶向疗法靶向信号传导途径的组分，在所述信号传导途径中所选择的PD中的一种或多种是组分，并且其中被靶向的组分不同于所选择的PD。
实施方案15.实施方案13的方法，其中所述靶向疗法靶向所选择的PD中的一种或多种。
实施方案16.实施方案8-12中任一项的方法，其中已对所述患者实施标准护理疗法。
实施方案17.实施方案16的方法，其中所述标准护理疗法是手术、放射、化学疗法或雄激素消融。
实施方案18.实施方案1-17中任一项的方法，其中所述患者患有前列腺癌。
实施方案19.实施方案1-18中任一项的方法，其中所述两种或更多种PD包含：
A)至少ACTN1、YBX1、SMAD2和FUS；
B)至少ACTN1、YBX1和SMAD2；
C)至少ACTN1、YBX1和FUS；
D)至少ACTN1、SMAD2和FUS；或
E)至少YBX1、SMAD2和FUS。
实施方案20.实施方案1-19中任一项的方法，其中选择至少三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种PD。
实施方案21.实施方案1、4-8、9、10和12-19中任一项的方法，其中选择由PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6组成的六种PD，并且其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6是不同的并且独立地选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
实施方案22.实施方案1、4-8、9、10和12-19中任一项的方法，其中选择由PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7组成的七种PD，并且其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7是不同的并且独立地选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
实施方案23.实施方案1、5-8、10和13-22中任一项的方法，其进一步包括测量选自下述的一种或多种PD的水平：HOXB13、FAK1、COX6C、FKBP5、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。
实施方案24.实施方案1-23中任一项的方法，其中所述两种或更多种所选择的PD中的至少一种的测量水平相对于参考值是上调的。
实施方案25.实施方案1-24中任一项的方法，其中所述两种或更多种所选择的PD中的至少一种的测量水平相对于参考值是下调的。
实施方案26.实施方案1-25中任一项的方法，其中所述两种或更多种所选择的PD中的至少一种的测量水平相对于参考值是上调的，并且所述两种或更多种所选择的PD中的至少一种相对于参考值是下调的。
实施方案27.实施方案24的方法，其中所述所选择的PD包含选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1的一种或多种PD。
实施方案28.实施方案25的方法，其中所述所选择的PD包含选自ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1的一种或多种PD。
实施方案29.实施方案1-28中任一项的方法，其中所述测量步骤包括测量所选择的PD的蛋白质水平。
实施方案30.实施方案29的方法，其中所述蛋白质水平通过抗体或其片段进行测量。
实施方案31.实施方案30的方法，其中所述蛋白质水平通过免疫组织化学或免疫荧光进行测量。
实施方案32.实施方案30的方法，其中所述抗体或其片段各自通过不同荧光团进行标记或结合，并且来自荧光团的信号通过自动化成像机器同时进行检测。
实施方案33.实施方案32的方法，其中所述组织样品用DAPI进行染色。
实施方案34.实施方案29的方法，其中所述测量步骤包括测量亚细胞区室中的所选择的PD的蛋白质水平。
实施方案35.实施方案29的方法，其中所述测量步骤包括测量在核中、在细胞质中或在细胞膜上的所选择的PD的蛋白质水平。
实施方案36.上述实施方案中任一项的方法，其中所述PD的水平从限定的目标区域中测量。
实施方案37.实施方案36的方法，其中所述非癌性细胞从目标区域中排除。
实施方案38.实施方案37的方法，其中所述非癌性细胞由抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体结合。
实施方案39.实施方案38的方法，其中所述非癌性细胞不由抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体结合。
实施方案40.实施方案36-39中任一项的方法，其中所述癌性细胞包括在目标区域中。
实施方案41.实施方案43的方法，其中所述癌性细胞由抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体结合。
实施方案42.实施方案41的方法，其中所述癌性细胞不由抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体结合。
实施方案43.上述实施方案中任一项的方法，其中所述测量步骤包括分开测量所选择的PD的水平。
实施方案44.上述实施方案中任一项的方法，其中所述测量步骤包括在反应中测量所选择的PD的水平。
实施方案45.上述实施方案中任一项的方法，其中所述样品是固体组织样品。
实施方案46.实施方案45的方法，其中所述固体组织样品是福尔马林固定石蜡包埋的组织样品、快速冷冻的组织样品、乙醇固定的组织样品、用有机溶剂固定的组织样品、用塑料或环氧树脂固定的组织样品、交联的组织样品、手术摘除的肿瘤组织、或活组织检查样品。
实施方案47.实施方案46的方法，其中所述活组织检查样品是核心活组织检查、切除组织活组织检查、或切口组织活组织检查。
实施方案48.上述实施方案中任一项的方法，其中所述组织样品是癌性组织样品。
实施方案49.上述实施方案中任一项的方法，其中所述组织样品是前列腺组织样品。
实施方案50.实施方案49的方法，其中所述前列腺组织样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的前列腺肿瘤样品。
实施方案51.实施方案50的方法，其进一步包括使FFPE前列腺肿瘤样品的横截面与抗细胞角蛋白8抗体、抗细胞角蛋白18抗体、抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体接触，其中在由抗细胞角蛋白8和抗细胞角蛋白18抗体结合但不由抗细胞角蛋白5和抗TRIM29抗体结合的横截面中的区域中进行所述测量步骤。
实施方案52.上述实施方案中任一项的方法，其进一步包括测量与所述癌症相关的至少一种标准参数。
实施方案53.实施方案52的方法，其中所述至少一种标准参数选自格里森评分、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤的视觉特征、肿瘤部位、肿瘤生长、淋巴结状态、肿瘤厚度(布瑞斯罗夫得分)、溃疡、发病年龄、PSA水平和PSA动力学。
实施方案54.用于测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的两种或更多种PD的水平的试剂盒，其包含用于特异性测量所选择的PD的水平的试剂。
实施方案55.实施方案54的试剂盒，其中所述试剂包含一种或多种抗体或其片段、寡核苷酸或适体。
实施方案56.实施方案54的试剂盒，其中所述试剂测量所选择的PD的RNA转录物水平或蛋白质水平。
实施方案57.鉴定能够降低癌症进展的风险或者延迟或减缓癌症进展的化合物的方法，其包括：
(a)提供表达选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的PD的细胞；
(b)使细胞与候选化合物接触；和
(c)测定所述候选化合物是否改变所选择的PD的表达或活性；
由此在化合物的存在下观察到的改变指示该化合物能够降低癌症进展的风险，或者延迟或减缓癌症进展。
实施方案58.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
测量选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的PD的水平；和
施用调节所选择的PD的水平的试剂。
实施方案59.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质；或至少一种RNA剪接基因或蛋白质；和
施用调节所选择的PD的水平的试剂。
实施方案60.用于治疗癌症患者的方法，其包括：
鉴定在至少两种PD中具有水平变化的患者，其中所述水平变化选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1中的一种或多种的上调和ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1中的一种或多种的下调；和
施用调节PD中的至少一种的水平的试剂。
实施方案61.用于限定组织样品中的目标区域的方法，其包括使组织样品与特异性用于鉴定目标区域的一种或多种第一试剂接触。
实施方案62.实施方案61的方法，其中所述目标区域包含癌性细胞。
实施方案63.实施方案62的方法，其中所述一种或多种第一试剂包含抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体。
实施方案64.实施方案61-63中任一项的方法，其进一步包括通过使组织样品与特异性用于鉴定待排除区域的一种或多种第二试剂接触，来限定待从目标区域中排除的组织样品区域。
实施方案65.实施方案64的方法，其中所述待排除区域包含非癌性细胞。
实施方案66.实施方案65的方法，其中所述一种或多种第二试剂包含抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体。
多个方面和实施方案还涉及评估肿瘤样品的计算机实现的或自动化方法，例如以对患者指定风险得分。
多个方面和实施方案还涉及包括存储器和处理单元的系统，其可操作用于评估肿瘤样品，例如以对患者指定风险得分。
多个方面和实施方案还涉及包括存储器和处理单元的系统，其可操作用于评估肿瘤样品，例如以分析来自整合肿瘤样品的信号或对患者指定风险得分。
多个方面和实施方案还涉及包含计算机可执行指令的计算机可读介质，所述计算机可执行指令当在计算机的处理器上执行时，执行用于评估肿瘤样品的方法，例如以分析来自整合肿瘤样品的信号，或对患者指定风险得分。
附图简述
本申请要求其优先权的美国临时申请号61/792,003含有至少一个彩色附图。具有彩色附图的美国临时申请号61/792,003的拷贝将在请求并支付必要的费用后，由美国专利和商标局(UnitedStatesPatentandTrademarkOffice)提供。
图1描述了手术摘除的前列腺肿瘤的苏木精和伊红染色的切片。美国病理学委员会(AmericanBoardofPathology)认证的解剖病理学家注释切片，以鉴定观察到的最高格里森得分模式的四个区域和观察到的最低格里森得分模式的两个区域。从肿瘤样品中提取一个高观察核心用于包括在高观察组织微阵列(TMA)中，并且从肿瘤样品中提取一个低观察核心用于包括在低观察TMA上。
图2描述了生物标志物选择和验证，其可以用于鉴定针对任何疾病或病状的生物标志物。该工具具有三个阶段：生物学阶段、技术阶段和表现阶段。MoAb-单克隆抗体；DAB-3,3’-二氨基联苯胺；IF-免疫荧光；以及TMA-组织微阵列。
图3描述了前列腺癌特异性生物标志物选择和验证工具。该工具具有三个阶段：生物学阶段、技术阶段和表现阶段。最初鉴定了160种潜在生物标志物。使用生物标志物选择和验证工具，将12种标志物鉴定为与肿瘤侵袭性关联。MoAb-单克隆抗体；DAB-3,3’-二氨基联苯胺；IF-免疫荧光；以及TMA-组织微阵列。
图4通过在对照细胞系TMA(CTMA)上使用定量多路免疫荧光证实了交叉重现性。CTMA的切片27和41用针对FUS-N和DERL1的免疫荧光抗体进行染色。针对CTMA中的每种细胞系的荧光强度在切片27和41之间进行比较，并且如所示的，将结果制图。两种细胞系中的免疫荧光量的线性关系和高R2值证实在实验间的定量免疫荧光测定法的重现性。
图5描述了按照肿瘤侵袭性和致死结果，在低观察TMA上包括的样品队列的分类。基于手术格里森得分，在肿瘤侵袭性研究中包括的297个患者中，110个患者患有无痛感肿瘤，122个患者患有中间型肿瘤，并且67个患者患有侵袭性肿瘤。在致死结果研究中包括的317个患者中，275个患者患有无痛感肿瘤(不死于前列腺癌)，并且42个患者患有侵袭性肿瘤(死于前列腺癌或远处转移)。前五列提供临床数据，而后四列提供当用3、6、9或12种标志物训练模型时有用的样品数目的估计量。
图6证实了两种Vectra智能载玻片分析系统(VectraIntelligentSlideAnalysisSystem)的系统间重现性。CTMA以一式两份在两种不同系统上就Alexa-568、Alexa-633和Alexa-647检测进行评估。两种系统在Alexa-568检测中相差约7％，在Alexa-633检测中相差约20％，并且在Alexa-647检测中相差约2％。抗VDAC1、FUS和SMAD4抗体分别用于Alexa-568、633和647通道。
图7描述了通过Vectra智能载玻片分析系统的自动化图像采集和加工，以及通过DefiniensDeveloperXDTM的自动化图像分析。通过自动化分析获得的生物标志物强度得分随后可以用于通过生物信息学测定生物标志物关联或通过使用Harvest实验室信息系统(LaboratoryInformationSystem)(LIS)评估临床样品。
图8描述了掺入自动化图像分析中的质量控制特性，其中每个图像通过每个荧光层分析，以检测过饱和、异常纹理或组织的缺乏。标记为“假象”的区域指示过饱和的检测，使得过饱和的区域从图像分析中排除。
图9A至图9F描述了使用DefiniensDeveloperXDTM自动化鉴定目标区域(ROI)。图9A显示了输入含有多个荧光通道的系统内的原始图像。图9B显示了基于抗细胞角蛋白8和抗细胞角蛋白18染色鉴定的肿瘤上皮结构。图9C显示了覆盖的核，以鉴定细胞位于肿瘤上皮区内的位置。图9D显示了基于基底细胞标志物细胞角蛋白5和TRIM29的存在，将细胞限定为良性或恶性的。图9E显示了限定的良性和恶性肿瘤区域。图9F显示了基于良性和恶性肿瘤的位置，限定的目标区域。
图10描述了在目标区域内的生物标志物(PD)免疫荧光的定量。注意到两种生物标志物(DERL1(PD1)和FUS(PD2))在恶性肿瘤区域中以低于良性肿瘤区域的水平表达。
图11描述了在使用低核心的HLTMA研究中就肿瘤侵袭性和致死结果的预测显示单变量表现的十七种生物标志物。核心格里森得分是观察到的格里森得分。当排除来自中间型肿瘤(基于手术格里森得分)的核心时，获得最可靠的结果。通过将来自中间型肿瘤的核心限定为无痛感或侵袭性的，生物标志物和肿瘤侵袭性之间的关联可以朝向倾斜。
图12描述了来自HLTMA研究的数据的生物信息学分析。
图13描述了针对与肿瘤侵袭性的关联通过AIC分选的组合中生物标志物出现的频率。呈现了针对具有最多3种生物标志物、最多4种生物标志物、最多5种生物标志物、最多6种生物标志物、最多8种生物标志物和最多10种生物标志物的组合的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在微型TMA测定法和HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图14描述了针对与肿瘤侵袭性的关联通过AIC分选的最高5％组合中生物标志物出现的频率。呈现了针对具有最多3种生物标志物、最多4种生物标志物、最多5种生物标志物、最多6种生物标志物、最多8种生物标志物和最多10种生物标志物的组合的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在微型TMA测定法和HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图15描述了通过AIC和测试数据就与肿瘤侵袭性的关联分选的七成员最大组合的最高1％和最高5％中生物标志物出现的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在使用低核心的微型TMA测定法和HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图16描述了通过AIC和测试数据就与肿瘤侵袭性的关联分选的五成员最大组合的最高1％中生物标志物出现的频率。测试的生物标志物选自31种生物标志物的库，其未在HLTMA上就单变量表现进行预选。
图17描述了通过AIC和测试数据就与肿瘤侵袭性的关联分选的五成员最大组合的最高5％中生物标志物出现的频率。测试的生物标志物选自31种生物标志物的库，其未在HLTMA中就单变量表现进行预选。
图18描述了针对每类分析的最高12种标志物，以及针对各种分析的最高标志物之间的一致性。7种生物标志物核心被鉴定为对于75％或100％的分析在最高12种标志物列表中出现。7种生物标志物的第二集合也被鉴定为对于50％的分析在最高12种标志物列表中出现。
图19描述了针对与致死结果的关联通过AIC分选的最高1％组合中生物标志物出现的频率。呈现了针对具有最多3种生物标志物、最多4种生物标志物、最多5种生物标志物、最多6种生物标志物、最多8种生物标志物和最多10种生物标志物的组合的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图20描述了针对与致死结果的关联通过AIC分选的最高5％组合中生物标志物出现的频率。呈现了针对具有最多3种生物标志物、最多4种生物标志物、最多5种生物标志物、最多6种生物标志物、最多8种生物标志物和最多10种生物标志物的组合的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图21描述了通过AIC和测试数据就与致死结果的关联分选的七成员最大组合的最高1％和最高5％组合中生物标志物出现的频率。测试的生物标志物选自17种生物标志物的库，其已在HLTMA中就单变量表现进行了预选。
图22证实了在其与肿瘤侵袭性和致死结果的关联中部分重叠的标志物可以潜在用于在单一测定法中评估两个终点。例如，如图11、13和19中所示，ACTN1和YBX1显示与肿瘤侵袭性和致死结果两者的高度关联。
图23描述了三重分析，其可以用于在单一载玻片上评估除肿瘤面具(tumormask)标志物和核染色之外的三种生物标志物(PD)。第一生物标志物PD1可以用FITC缀合的一抗和抗FITC-Alexa568二抗进行检测。第二生物标志物PD2可以用兔一抗、生物素缀合的抗兔二抗和缀合至Alexa633的链霉抗生物素蛋白进行检测。第三生物标志物PD3可以用小鼠一抗、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗小鼠二抗和抗HRP-Alexa647三抗进行检测。对于肿瘤面具，抗CK8-Alexa488和抗CK18-Alexa488可以用于鉴定肿瘤上皮结构，并且抗CK5-Alexa555和抗TRIM29-Alexa555可以用于鉴定基底细胞标志物。肿瘤切片的质量可以通过一般自体荧光(AFL)以及来自红细胞和亮颗粒的自体荧光(BAFL)进行评估。虽然任何三种生物标志物(PD)均可用于三重染色中(条件是正确的抗体组合是可获得的)，但在该图中，PD1是HSD17B4，PD2是FUS，并且PD3是LATS2。
图24描述了可以组合用于三重分析的生物标志物抗体的组合。使用这些组合，12种生物标志物可以在来自肿瘤样品的四个切片上进行评估。
图25证实了当针对多重生物标志物(SMAD(PD1)和RpS6(PD2))的抗体用于相同测定法中时，观察到最低限度干扰。两种测定法中的免疫荧光的量的线性关系和高R2值证实通过第二抗体对第一抗体的最低限度干扰。
图26举例说明了本发明实施方案的各个方面可以在其上实现的示例性计算机系统。
图27A-F提供了用于前列腺切除术组织的限定目标区域中的自动化、定量多路免疫荧光和生物标志物测量的实验方法概括。
图27A显示了在测定法中使用的光谱文库中的每种荧光团的光谱特征谱，以及分别针对组织自体荧光信号(AFL)和亮自体荧光(BAFL)信号的特征谱。
图27B显示了用于目标组织区域中的定量多路免疫荧光生物标志物测量的染色程序的一般概括。SPP1和SMAD4用作例子。目标区域标志物抗体(CK8和CK18用于总上皮，并且CK5和TRIM29用于基底上皮)分别直接缀合至Alexa488和Alexa555。如所述的，生物标志物抗体用一系列二抗和三抗进行检测。表中的颜色举例说明针对所指示的Alexa荧光团染料的发射峰的独特光谱位置。
图27C举例说明了复合多光谱图像(i)解混至对应于自体荧光(AFL)和亮自体荧光(BAFL)、目标区域标志物以及生物标志物的分离通道，如(ii)所示的。
图27D显示了基于Definiens脚本的组织分段和生物标志物定量。从复合图像(1)移动通过份1-6，鉴定了第一总上皮区域(2)，随后为核区域域(3)。上皮区域进一步分段成肿瘤(其以红色显现)、良性(其以绿色显现)和未确定的(其以黄色显现)(4)。灰色指示非上皮区域，例如间质和脉管(4)。最后，仅定量来自肿瘤上皮区域的生物标志物，其以红色概括(5和6)。
图27E显示了组织注释和质量控制程序。左：如通过专家病理学家注释的，人前列腺切除术样品的代表性苏木精和伊红(H&E)染色的切片显示了分别置于具有最高和最低格里森模式的区域上的四个(蓝色)和两个(绿色)1mm直径圆圈。从四个蓝色区域中的两个取出两个核心(各1mm直径)，以生成TMA块。右：用DAPI和CK8/CK18-Alexa488染色相同的前列腺切除术样品的连续切片。具有通过CK8/18细胞角蛋白抗体对前列腺上皮的亮染色的区域视为质量良好区域，而具有很少或无染色(如在黄色点状区域内指示的)的区域视为具有低质量，并且视为不适合于TMA构建。
图27F显示了实验内重现性。来自前列腺肿瘤测试TMA的两个连续切片在相同实验中进行染色。使用Vectra系统采集图像，并且用Definiens脚本进行处理。散点图比较来自连续TMA切片的相同核心的CK8/18、PTEN和SMAD4染色强度的平均值。使用Excel软件生成线性回归曲线、方程和R2值。
图28A-C显示了致死结果的队列描述和单变量分析。图28A显示了在目前研究中使用的致死结果注释的前列腺切除术队列的组成，以及与来自Ding等人，Nature2011，470:269-273的PHS队列的比较。图28B显示了在研究阵列中存活作为单一生物标志物蛋白质表达的函数的卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)曲线。将具有最高三分之一风险得分值的群体与具有最低三分之一风险得分的群体分开。注释了P值(P)和危害比(HR)。
图29A-C显示了多变量模型开发和卡普兰-迈耶存活图。图29A显示了针对本发明的研究队列的存活预测的多变量Cox回归和逻辑回归分析。基于对整个队列的训练和测试，将标志物组合用于开发模型。四种标志物：PTEN、SMAD4、CCND1、SPP1。三种标志物：SMAD4、CCND1、SPP1。图29B显示了通过使用四种标志物或[三种标志物+pS6+pPRAS40]对整个队列训练的Cox模型生成的存活作为风险得分的函数的卡普兰-迈耶存活曲线。最低的三分之二的风险得分用作群体分离的阈值。图29C显示了四种标志物(PTEN、SMAD4、CCND1、SPP1)的致死结果预测表现在本研究和Ding等人的研究之间的比较。
图30A-E显示了PTEN、CCND1、SMAD4、SPP1、P-S6和P-PRAS40抗体特异性的验证。对于PTEN(图30A)、CCND1(图30B)和SMAD4(图30C)，建立了多西环素可诱导的shRNA敲低细胞系。多西环素处理降低所有情况下的靶蛋白丰度，如通过蛋白质印迹(WB)评价的。具有PTEN(图30A)、CCND1(图30B)和SMAD4(图30C)的高或低/阴性表达水平的细胞系还通过WB和免疫组织化学(IHC)进行检查，以进一步验证抗体的特异性。SPP1(图30D)抗体检测SPP1特异性条带和在更低分子量处的另外条带，如通过PC3细胞中的WB评价的，而SPP1特异性较高条带在低SPP1表达BxPC3细胞中显著减少。在PC3和BxPC3细胞中SPP1抗体通过IHC的染色强度与通过WB检测到的SPP1特异性条带的相对强度良好关联。P-S6和P-PRAS40抗体(图30E)的特异性在DU145细胞中加以验证。LY294002处理显著降低S6和PRAS40的磷酸化，如分别通过WB和IHC显示的。
图31显示了统计分析流的概括。对于每个患者，来自具有最高格里森得分的区域的两个组织核心置于TMA块内。在每个TMA核心的肿瘤上皮区域中的生物标志物表达的平均值用于分析，导致两个生物标志物值/患者。对于PTEN、SMAD4和pS6，来自两个核心的最低值用于分析。对于CCND1、SPP1、p90RSK、pPRAS40和Foxo3a，使用来自两个核心的最高值。使用这些值，生成10,000个自举训练样品，并且对每种训练样品训练多变量Cox和逻辑回归模型两者。对补充集合执行测试。考虑到队列包括删失数据，我们使用一致性指数(CI)和‘曲线下面积’(AUC)两者来估计模型表现。在模型中测试的标志物组合如下：四种标志物(PTEN、SMAD4、CCND1、SPP1)，三种标志物(SMAD4、CCND1、SPP1)，以及三种标志物与下述磷酸标志物组合的每一种：pS6、pPRAS40和[pS6+pPRAS40]。
图32举例说明了活组织检查模拟组织微阵列(TMA)的制备。来自前列腺切除术样品的组织块注释了所有可见格里森模式(最高)。所示例子来自具有总体格里森得分(GS)4+3＝7的患者。如更高放大率的视图(中间)中可见，在相同块内的模式可以是高度多样化的。从每个组织块取出两个1mm核心。一个取自具有最高GS(4+4＝8)的区域，并且连同来自其它块的高评分核心包埋到琼脂糖/石蜡内，以制备HTMA(左下)。另一个取自具有最低GS(3+3＝6)的区域，并且连同来自其它块的低评分核心包埋到琼脂糖/石蜡内，以制备LTMA(右下)。
图33显示了生物标志物选择策略。三类标准(基于生物学、技术和表现)用于选择12种最终生物标志物。(DAB：基于用二氨基联苯胺(DAB)染色的生色组织评价的Ab特异性；IF：基于免疫荧光组织染色的Ab特异性和表现)。
图34A和图34B显示了对于疾病侵袭性和疾病特异性死亡率，在低(LTMA；黑色条)和高(HTMA；褐色条)格里森区域中测量的39种生物标志物的单变量表现。图34A显示了对于每种标志物计算的用于预测严重疾病病理学(侵袭性)的比值比(OR)。OR在垂直线左侧的标志物与如通过病理学评价的疾病的严重性负关联。在线右侧的那些是正关联的。标志物基于在LTMA中测量时的OR进行排序。图34B显示了对于每种标志物计算且如对于图34A所述进行标绘的，针对来自疾病的死亡(致死率)的危害比。在图34A和图34B中，具有两个星号(**)的生物标志物指示在L和HTMA两者中在0.1水平下的统计显著性。具有一个星号(*)的生物标志物指示在仅在HTMA中，而不在LTMA中的统计显著性。注意到对于侵袭性疾病和来自疾病的死亡两者，具有统计显著的单变量表现的生物标志物的大量重叠。
图35A和图35B显示了针对疾病侵袭性的基于表现的生物标志物选择过程。图35A显示了生物信息学工作流从来自31种集合中的多至五种生物标志物的所有组合中选择最频繁利用的生物标志物。图35B显示了最高排序的5-标志物模型的表现的例子，包括与在LTMA上的训练和随后在来自LTMA和HTMA的独立样品上的测试的比较。注意到针对LTMA和HTMA的测试表现是一致的，在置信区间中具有实质重叠。图35C显示了生成的组合允许最多三、四或五种生物标志物。该图显示了当五-生物标志物模型用于预测侵袭性疾病时，通过测试排序的最频繁包括的蛋白质。
图36A和图36B显示了最终生物标志物集合和选择标准。图36A显示了基于针对侵袭性和致死率的单变量表现(显示为左侧的OR)以及针对疾病侵袭性或致死结果在多变量模型中的出现频率(右侧的表)选择的十二种生物标志物。图36B概括了生物标志物的名称和生物学意义。生物标志物集合包含已知在细胞增殖、细胞存活和代谢的调节中起作用的蛋白质。图36C显示了基于逻辑回归开发针对疾病侵袭性的多变量12-标志物模型。显示了所得到的AUC和OR。随后，对于所有患者通过侵袭性模型生成的风险得分与致死结果关联。显示了所得到的AUC和HR。
图37A-L显示了抗体特异性。通过siRNA处理的细胞和对照细胞的蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)，验证ACTN1(图37A)、CUL2(图37B)、Derlin1(图37C)、FUS(图37D)、PDSS2(图37E)、SMAD2(图37F)、VDAC1(图37G)和YBX1(图37H)抗体的特异性。标志物特异性siRNA处理显著降低在WB上的条带强度，并且细胞中的特异性IHC染色证实抗体的特异性。通过SMAD4阳性对照细胞系PC3和SMAD4阴性对照细胞系BxPC3的WB和IHC，验证SMAD4抗体的特异性(图37I)。通过幼稚DU145细胞和用PI3K抑制剂LY294002处理的DU145细胞的WB和IHC，验证pS6抗体的特异性(图37J)。LY294002处理显著降低S6的磷酸化，如通过WB和IHC显示的。在WB上Leica抗DCC抗体(图37K)检测的条带不匹配DCC蛋白质的预期大小(在K中标记为“X”)；IHC染色在DCCsiRNA处理的细胞中也不降低(图37K中的左图)。Leica抗DCC抗体看起来识别HSPA9蛋白质，如通过HSPA9siRNA处理的细胞和对照细胞的WB和IHC显示的(图37K中的右图)。β-肌动蛋白用作WB上样对照。
图38A-G显示了代替DCC作为前列腺癌预后生物标志物的HSPA9的鉴定。Leica抗DCC抗体通过WB和IHC(图38A)经由DCCsiRNA敲低细胞没有得到验证，因为通过抗体在WB上检测到的条带大小比对于DCC蛋白质预期的条带小得多(75kDa相对于158kDa)，并且IHC染色强度在DCCsiRNA处理的细胞中不降低。质谱法鉴定在WB上通过Leica抗DCC抗体识别的蛋白质是HSPA9。为了证实Leica抗DCC抗体确实是抗HSPA9抗体，通过WB和IHC对HSPA9siRNA处理的细胞和对照细胞进行测试；通过Leica抗DCC抗体检测的WB条带和IHC染色在HSPA9siRNA处理的细胞中显著降低(图38B)。在HSPA9siRNA处理的细胞上的Leica抗DCC抗体的WB和IHC模式类似于通过SantaCruz抗HSPA9抗体检测到的模式(图38C)。通过siRNA沉默HSPA9看起来减少HeLa细胞的增殖(图38D)，减少克隆形成测定法中的HeLa细胞集落形成(图38E)，并且引起增加的细胞死亡(图38F)和半胱天冬酶活性(图38G)。
图39A-C显示了针对8-标志物标志测定法的模型构建。图39A显示了针对个别生物标志物的比值比(具有95％置信区间)。定量生物标志物测量与作为终点的前列腺癌病理学关联。应注意效应大小已进行标准化。图39B显示了在最高10％的多变量模型中的生物标志物频率利用。考虑到许多模型在自举测试AUC中具有相似表现，详尽最高标志物模型搜索中的出现频率用作选择最终标志物用于诊断测试的另外准则。该图显示了当通过自举中值测试AUC分选时，最高八种标志物出现在八标志物模型的最高10％中的频率。图39C显示了最终标志物模型系数，其用于逻辑回归模型中用于计算风险得分，作为从0到1的连续量表提供。应注意负号指示保护性标志物。这些系数单位在与测定法相关的荧光强度量表中。
图40A-F举例说明了临床验证研究及其用于预测有利病理学的表现。灵敏度和特异度曲线(分别为图40A和图40B)可以用于鉴定适当的风险分类组。相对于NCCN风险分类组(图40C和图40D)和D’Amico风险分类组(图40E和图40F)的风险得分分布，显示了生物标志物标志测定法在每个NCCN或D’Amico水平内添加显著的另外风险信息。
图40A显示了在灵敏度和相关医学决策水平之间的关系可以用于鉴定低风险分类组。例如，有利分类可以鉴定为其风险得分在区间0-0.33中的患者，其对应于90％(95％CI，82％-94％)的灵敏度(P[风险得分>0.33|不利病理学])。在这种情况下，具有不利病理学的患者会具有不正确地接受有利分类的10％(95％CI，6％-18％)机会。这种假阴性可能导致治疗不足。
图40B显示了在特异性和相关医学决策水平之间的关系可以同样地用于鉴定不利分类组。例如，不利分类可以鉴定为其风险得分在区间(0.8-1)中的患者，其对应于95％(95％CI，90％-98％)的特异度(P[风险得分≤0.80|有利病理学])。在这种情况下，具有有利病理学的患者会具有不正确地接受不利分类的5％(95％CI，2％-10％)机会。这种假阳性可能导致过度治疗。
图40C显示了在每个NCCN风险水平下(极低、低、中间、高)，使用生物标志物标志测定法衍生的中值风险得分落入0.33和0.8的风险得分截断水平之间，其中针对有利(手术格里森3+3或3+4和≤T2)病理学的预测值(+PV)在风险得分截断<0.33时在85％中发现。针对不利病理学的预测值(–PV)在风险得分截断>0.9时为100％，并且在风险得分>0.8时为76.9％。对于风险得分<0.33，具有‘极低’NCCN分类的95％患者具有有利病理学，而通过单独的‘极低’NCCN分类观察到的有利病例频率为80.3％。在‘低’NCCN分类中，对于风险得分<0.33，81.5％的患者具有有利病理学，而通过‘低’NCCN准则观察到的有利病例频率为63.8％。相反，对于风险得分>0.8，在‘极低’NCCN分类中的75％患者具有不利病理学，并且当风险得分>0.8时，所有患者的76.9％具有不利病理学。
图40D显示了根据风险得分四分位数，对于有利病例观察到的频率。增加的风险得分四分位数在很大程度上与在每个NCCN类别中观察到的减少的有利病例频率关联。此外，相对于单独的NCCN分层，通过测试鉴定的观察到的具有有利病理学的患者频率在81％的置信水平下从0％增加到23.8％。
图40E显示了在每个D’Amico风险水平下(低、中间、高)，使用生物标志物标志测定法衍生的中值风险得分落入0.33和0.8的风险得分截断水平之间。针对有利病理学的预测值(+PV)在风险得分截断<0.33时为85％。针对不利病例的预测值(–PV)在风险得分截断>0.9时为100％，并且在风险得分截断>0.8时为76.9％。对于风险得分截断<0.33，具有‘低’D’Amico分类的87.2％患者具有有利病理学，而在‘低’D’Amico组内观察到的有利病例频率为70.6％。在‘中间’D’Amico类别中，对于风险得分<0.33，75％的患者具有有利病理学，而在‘中间’D’Amico组内观察到的具有有利病理学的所有患者的频率为41.2％。相反，对于风险得分>0.8，在‘低’D’Amico类别内的59.3％患者具有不利病理学，并且当风险得分>0.8时，所有患者的76.9％具有不利病理学。
图40F显示了根据风险得分四分位数，观察到的有利病例频率。增加的风险得分四分位数在很大程度上与每个D’Amico类别中观察到的减少的有利病例频率关联。此外，相对于单独的D’Amico分层，通过测试鉴定的观察到的具有有利病理学的患者频率在81％的置信水平下从0％增加到23.8％。
图41A-D显示了临床验证研究的结果，完全队列：针对“GS6”病理学(手术格里森＝3+3和局限性≤T3a，N＝256)的表现。图41A显示了根据医学决策水平，测试的灵敏度(P[风险得分>阈值|“非GS6”病理学])。图41B显示了用于鉴定“非GS6”类别的风险得分的特异度(P[风险得分<阈值|“GS6”病理学])。图41C和图41D显示了针对“GS6”和“非GS6”病理学的风险得分的分布。图41E显示了针对模型的接受者操作特征(ROC)曲线。ROC曲线下面积(AUC)＝0.65(95％置信区间[CI]，0.58-0.72)，P<0.001，以及最高至最低四分位数比值比(OR)＝4.2(95％CI，1.9-9.3)。针对定量风险得分的OR为12.59(95％CI，3.5-47.2)/单位变化。
图42A-C显示了临床验证研究的结果，完全队列：用于预测有利病理学(手术格里森≤3+4和局限于器官的≤T2，N＝274)的表现。图42A显示了针对有利病理学的风险得分分布。图42B显示了针对不利病理学的风险得分分布。图42C显示了针对模型的ROC曲线。AUC＝0.68(95％CI，0.61-0.74)，P<0.0001，以及最高至最低四分位数OR＝3.3(95％CI，1.8-6.1)。针对定量风险得分的OR为20.9(95％CI，6.4-68.2)/单位变化。
图43A-C显示了临床验证研究的结果，具有美国国家综合癌症网络(NationalComprehensiveCancerNetwork)(NCCN)和D’Amico标准的队列：针对有利病理学(手术格里森≤3+4和局限于器官的≤T2，N＝256)的表现。图43A显示了针对有利疾病的风险得分分布。图43B显示了针对不利疾病的风险得分分布。图43C显示了针对模型的ROC曲线。AUC＝0.69(95％CI，0.63-0.73)，P<0.0001，以及最高至最低四分位数OR＝5.5(95％CI，2.5-12.1)。针对定量风险得分的OR为26.2(95％CI，7.6-90.1)/单位变化。
图44A-B显示了净重新分类指数分析举例说明了有利(风险得分≤0.33)和不利(风险得分>0.8)分子标志类别可以如何补充NCCN(图44A)和D’Amico(图44B)SOC风险分类系统。在NCCN低、中间和高，以及D’Amico中间和高类别中，具有分子风险得分≤0.33的患者可以视为处于比单独的SOC类别指示的侵袭性疾病的更低风险中。在NCCN低、中间和高，以及D’Amico中间和高类别中，具有分子风险得分>0.8的患者可以视为处于比单独的SOC类别指示的侵袭性疾病的更高风险中。针对类别NCCN极低和D’Amico低的分子风险得分≤0.33视为证实的。类似地，针对类别NCCN高和D’Amico高的分子风险得分>0.8视为证实的。应当指出左侧矩形中的有利患者和右侧矩形中的不利患者反映正确的风险调整。在具有有利病理学的患者中，针对NCCN和D’Amico分别有78％和53％被正确调整。在具有不利病理学的患者中，针对NCCN和D’Amico分别有76％和88％被正确调整。还应当指出相对于总体风险组，在类别NCCN极低和D’Amico低中，具有分子风险得分≤0.33的患者对于有利患者显著富集。R.S.＝分子风险得分。
图45A显示了针对12种标志物的染色，所有四种定量多路免疫荧光三重测定法形式(PBXA/B/C/D)的概括。目标区域标志物抗体直接与Alexa染料缀合，而通道568中的生物标志物抗体与异硫氰酸荧光素(FITC)缀合。所有生物标志物(一抗)均用一系列二抗和三抗进行检测，除了直接与FITC缀合的pS6和PDSS2外。每种颜色对应于特异性通道。具有星号(*)的生物标志物用于内部组织质量控制目的，其中自动排除具有低于ACTN1、DERL1或VDAC的预定信号强度的病例。其在肿瘤上皮中的定量测量用于预测算法中的八种生物标志物以斜体指示。
图45B显示了在图像采集过程期间，最初使用4×单色4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)过滤图像的拼凑，采集整个载玻片的图像。组织发现算法用于定位其中图像的重新采集用4×DAPI和4×FITC单色过滤器两者执行的组织，并且以后另一种组织发现算法用于采集含有足够组织量的所有20×视野的图像，伴随DAPI、FITC、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)和Cy5过滤器的连续曝光。图像立方体储存用于自动分离成个别通道，并且通过Definiens软件进一步加工。
图45C显示了整个定量多路免疫荧光测定法程序的不同步骤。未加工的载玻片最初用荧光显微镜就染色和染料的存在进行目视检查。显著量的荧光染料的存在排除载玻片用于进一步分析。对通过最初质量控制的组织实施多路染色程序，伴随后续图像采集、Definiens分析和生物信息学分析。图像采集过程如上文对于图45B描述的执行。将图像立方体储存于服务器中，分离成个别通道，并且通过Definiens软件加工。通过Definiens软件使用ROI生物标志物，从来自每个特异性目标区域(ROI)的肿瘤和良性区域中收集数据。在数据进一步分析之前，生物信息学分析算法排除具有低于针对ACTN1、DERL1或VDAC1的预定信号强度的病例。
发明详述
本发明基于下述发现：包含来自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1(“预后决定因素”或“PD”；表1)的两个或更多个成员的生物标志物实验对象组可用于提供针对癌症患者的分子的、基于证据的、可靠的预后。通过测量来自患者的癌性组织样品中的生物标志物的表达(例如蛋白质表达)或活性水平，可以可靠地预测肿瘤在癌症患者中的侵袭性，例如肿瘤侵入周围组织的能力或进展的风险。癌症进展通过例如癌症的转移或复发指示。该水平还可以用于预测癌症的致死结果或癌症疗法(例如手术、放射疗法或化学疗法)的功效，不依赖于或附加于传统的已建立的风险评价程序。该水平还可以用于鉴定需要侵袭性癌症疗法(例如辅助疗法，例如除手术治疗之外给予的化学疗法)的患者，或指导进一步的诊断测试。当在途径背景基因或蛋白质的背景下使用时，该水平还可以用于告知医疗保健提供者针对癌症患者最可能获益于哪类疗法，并且将患者分层用于包括在临床研究中。该水平还可以用于鉴定不获益于和/或不需要癌症疗法(例如手术、放射疗法、化学疗法、靶向疗法或辅助疗法)的患者。换言之，本发明的生物标志物实验对象组允许临床医生最佳管理癌症患者。
在一些实施方案中，本发明的多路或多变量诊断方法的主要临床指示是准确地预测PCA是“侵袭性的”(例如预测前列腺肿瘤在诊断时活跃进展的概率(即，“活跃的、侵袭性疾病”；或将在以后某个时间点进展(即，“进展风险”))，还是“无痛感的”或“休眠的”。该方法的另一种临床指示可以是准确地预测患者将死于PCA的概率(即，“致死结果”/“疾病特异性死亡”)。准确度可以按照C统计量进行测量。针对对样品指定风险得分的模型，C统计量是具有一个侵袭性样品和一个无痛感样品的样品对数目在此类样品对的总数目上的比，其中侵袭性样品具有比无痛感样品更高的风险得分。
定义
如该术语在本文中使用的，“获取(acquire)”或“获取(acquiring)”指通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值而获得物理实体(例如样品)、或值例如数值、或图像的拥有。“直接获取”意指执行过程(例如执行合成或分析方法，使样品与检测试剂接触，或捕获来自样品的信号)，以获得物理实体或值。“间接获取”指接受来自另一方或来源(例如直接获取物理实体或值的第三方实验室)的物理实体或值。直接获取物理实体包括执行包括物理物质中的物理变化的过程。示例性变化包括由两种或更多种原材料制备物理实体，剪切或破碎物质，分离或纯化物质，将两种或更多种分离实体组合成混合物，执行包括破坏或形成共价键或非共价键的化学反应。直接获取值包括执行包括样品或另一种物质中的物理变化的过程，例如执行包括物质例如样品、分析物或试剂中的物理变化的分析过程(在本文中有时被称为“物理分析”)，执行分析方法例如包括下述中的一种或多种的方法：从另一种物质中分离或纯化物质例如分析物或其片段或其它衍生物；将分析物或其片段或其它衍生物与另一种物质例如缓冲液、溶剂或反应物组合；或例如通过在分析物的第一和第二原子之间破坏或形成共价键或非共价键，改变分析物或其片段或其它衍生物的结构；诱导或收集信号例如基于光的信号例如荧光信号，或通过改变试剂或其片段或其它衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间破坏或形成共价键或非共价键。直接获取值包括其中使用计算机或检测装置例如扫描仪的方法，例如当响应检测器上的光子碰撞的电子态中的变化时。直接获取值包括捕获来自样品的信号。
如本文使用的，检测试剂是对于其预期靶具有足够特异性以使得其可以用于将该靶与本文讨论的其它物质区分开来的试剂，通常为结合试剂。在实施方案中，在其中进行方法的条件下，检测试剂与其它(非靶)种类无结合或基本上无结合。
如该术语在本文中使用的，目标区域(ROI)指一种或多种实体，例如无细胞实体(例如亚细胞组分(例如核或细胞质)、组织组分、无细胞结缔组织基质、无细胞胶原物质、细胞外组分例如间质组织液)，或细胞，所述实体包含区域表型标志物，所述区域表型标志物用于ROI、样品、组织或其来源于的患者的分析。在实施方案中，ROI的实体是细胞。
如该术语在本文中使用的，区域表型标志物反映、预测或关联针对患者的预选表型，例如癌症例如癌症亚型，或结果。在实施方案中，区域表型标志物反映、预测或关联炎性病症(例如，自身免疫性病症)、神经系统病症或传染病。在实施方案中，预选表型在ROI的实体或细胞中存在或外露。在实施方案中，预选表型是对于其分析ROI、样品、组织或患者的疾病例如癌症的表型。
例如，ROI可以包括癌细胞例如癌性前列腺细胞，预选表型是癌性细胞的表型，群体表型标志物是癌症标志物，例如在前列腺癌的情况下，肿瘤标志物选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9。
如本文使用的，除非上下文另有说明，否则pS6指由RpS6基因编码的核糖体蛋白S6的磷酸化形式。
在实施方案中，第一ROI是癌性ROI，并且第二ROI是良性ROI。
在实施方案中，区域表型标志物在ROI的细胞中表达。在实施方案中，区域表型标志物布置在ROI的细胞中，但不在该细胞中表达，例如在实施方案中，区域表型标志物是在间质中发现的分泌因子，因此在该例子中，间质是ROI。
ROI可以以各种方式提供。例如，ROI可以通过下述的拥有进行选择或鉴定：
形态特征，例如与第二组织或细胞类型具有预选关系的第一组织或细胞类型，例如第一组织或细胞类型由第二组织或细胞类型结合；
非形态特征，例如分子特征，例如拥有所选分子例如蛋白质、mRNA或DNA(在本文中被称为ROI标志物)标志物；或
形态特征和非形态特征的组合。
在实施方案中，通过形态特征的鉴定或选择包括从其它细胞或材料选择(例如通过手动或自动化手段)和物理分离ROI，例如通过从其它组织例如非癌性细胞剥离ROI例如癌性区域。在形态选择例如显微剥离的实施方案中，ROI基本上完整地从其环境中取出。在形态选择例如显微剥离的实施方案中，ROI被取出，但形态结构未得到维持。
在通过非形态特征的选择或鉴定的实施方案中，ROI可以由于ROI标志物的包括得到鉴定或选择，所述ROI标志物为与ROI的实体例如细胞相关，例如在ROI的实体例如细胞中的预选分子种类。例如，细胞分选例如FACS可以用于通过非形态特征提供ROI。在实施方案中，FACS用于使具有ROI标志物的细胞与其它细胞分离，以提供ROI。
在通过形态和非形态选择的组合选择ROI的实施方案中，显示与针对ROI标志物的检测试剂结合的预选模式的形态上可鉴定的结构用于提供ROI。
ROI包含其中群体表型标志物发挥其功能的实体，通常为细胞。在实施方案中，ROI是实体通常为细胞的集合，由其可以提取与区域表型标志物相关例如成比例的信号。ROI中的区域表型标志物的水平允许样品的评估。例如，在前列腺癌的情况下，区域表型标志物例如肿瘤标志物，例如本文描述的肿瘤标志物之一的水平，允许评估样品和由其获得样品的患者。在实施方案中，区域表型标志物基于下述事实进行选择：它在ROI的实体或细胞中发挥功能，例如与待评估、预后或诊断的病症相关的功能。在一些实施方案中，ROI标志物用于选择或限定ROI。
在实施方案中，ROI是实体通常为细胞的集合，所述实体例如在患者中尽管不一定在样品中形成模式例如独特的形态区域。
如该术语在本文中使用的，样品是包含来自患者的细胞或无细胞组分的组合物。术语“样品”包括未加工的样品例如活组织检查，经加工的样品例如固定组织，来自组织的级分或来自患者的其它物质。ROI被视为样品。
预后决定因素
本发明的第一个方面提供了用于癌症治疗决策中的预后决定因素。术语“预后决定因素”、“生物标志物”和“标志物”在本文中可互换使用，并且指可以作为生物过程的指示剂进行客观地测量和评估的分析物(例如肽或蛋白质)。本发明人已发现这些生物标志物的表达或活性水平与癌症患者的预后例如肿瘤侵袭性或致死结果可靠地关联。这些生物标志物与癌症预后关联的能力可以通过组合使用它们得到扩大。
至少一种生物标志物可以是细胞骨架基因或蛋白质。不受理论束缚，细胞骨架基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为恶性肿瘤部分地由肿瘤侵入邻近组织内和肿瘤扩散至远处肿瘤表征。此类侵入和扩散通常需要细胞骨架再建。可用作癌症预后的生物标志物的细胞骨架基因和蛋白质的非限制性例子包括α肌动蛋白、β肌动蛋白、γ肌动蛋白、α-辅肌动蛋白1、α-辅肌动蛋白2、α-辅肌动蛋白3、α-辅肌动蛋白4、纽蛋白、E-钙粘蛋白、波形蛋白、角蛋白1、角蛋白2、角蛋白3、角蛋白4、角蛋白5、角蛋白6、角蛋白7、角蛋白8、角蛋白9、角蛋白10、角蛋白11、角蛋白12、角蛋白13、角蛋白14、角蛋白15、角蛋白16、角蛋白17、角蛋白18、角蛋白19、角蛋白20、核纤层蛋白A、核纤层蛋白B1、lambinB2、核纤层蛋白C、α-微管蛋白、β-微管蛋白、γ-微管蛋白、δ-微管蛋白、ε-微管蛋白、LMO7、LATS1和LATS2。优选地，细胞骨架基因或蛋白质是α-辅肌动蛋白1、α-辅肌动蛋白2、α-辅肌动蛋白3或α-辅肌动蛋白4，特别是α-辅肌动蛋白1。α-辅肌动蛋白1已显示与下述相互作用：CDK5R1；CDK5R2；胶原，XVII型，α1；GIPC1；PDLIM1；蛋白激酶N1；SSX2IP；和斑联蛋白。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为细胞骨架蛋白质。
至少一种生物标志物可以是泛素化基因或蛋白质。不受理论束缚，泛素化基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为泛素可以附着至蛋白质，且将它们导向蛋白酶体用于破坏。因为增加的蛋白质合成速率通常是支持癌症中的转化事件所需的，所以蛋白质控制过程例如泛素化在肿瘤进展中是关键的。可用作癌症预后的生物标志物的泛素化基因和蛋白质的非限制性例子包括泛素活化酶(例如UBA1、UBA2、UBA3、UBA5、UBA6、UBA7、ATG7、NAE1和SAE1)、泛素缀合酶(例如UBE2A、UBE2B、UBE2C、UBE2D1、UBE2D2、UBE2D3、UBE2E1、UBE2E2、UBE2E3、UBE2G1、UBE2G2、UBE2H、UBE2I、UBE2J1、UBE2L3、UBE2L6、UBE2M、UBE2N、UBE2O、UBE2R2、UBE2V1、UBE2V2和BIRC6)、泛素连接酶(例如UBE3A、UBE3B、UBE3C、UBE4A、UBE4B、UBOX5、UBR5、WWP1、WWP2、mdm2、APC、UBR5、SOCS、CBLL1、HERC1、HERC2、HUWE1、NEDD4、NEDD4L、PPIL2、PRPF19、PIAS1、PIAS2、PIAS3、PIAS4、RANBP2、RBX1、SMURF1、SMURF2、STUB1、TOPORS和TRIP12)、F-box蛋白质(例如cdc4)、Skp1、cullin家族成员(例如CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A、CUL4B、CUL5、CUL7和ANAPC2)、RING蛋白(例如RBX1)、延伸蛋白C、和内质网相关蛋白降解(“ERAD”，例如DERL1、DERL2、DERL3、Doa10、EDEM、ER甘露糖苷酶I、VIMP、SEL1、HRD1和HERP)。优选地，泛素化基因或蛋白质是cullin，特别是CUL2，或ERAD基因或蛋白质，特别是DERL1。CUL2已显示与DCUN1D1、SAP130、CAND1、RBX1、TCEB2和VonHippel-Lindau肿瘤抑制子相互作用。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为泛素化蛋白质。
至少一种生物标志物可以是依赖性受体基因或蛋白质。不受理论束缚，依赖性受体基因和蛋白质可以与癌症预后关联，这是由于其触发两个相反的信号传导途径的能力：1)细胞存活、迁移和分化；和2)细胞凋亡。在配体的存在下，这些受体活化牵涉细胞存活、迁移和分化的经典信号传导途径。在不存在配体的情况下，它们并非保持失活；相反，它们发出细胞凋亡信号。细胞存活、迁移和凋亡均牵涉癌症。可用作癌症预后的生物标志物的依赖性受体基因和蛋白质的非限制性例子包括DCC、再生蛋白、p75NTR、RET、TrkC、Ptc、EphA4、ALK、MET和整联蛋白子集。优选地，依赖性受体基因或蛋白质是DCC。DCC已显示与PTK2、APPL1、MAZ、半胱天冬酶3、NTN1和雄激素受体相互作用。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为依赖性受体蛋白质。
至少一种生物标志物可以是DNA修复基因或蛋白质。不受理论束缚，DNA修复基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为已累积大量DNA损害的细胞，或不再有效修复其DNA遭受的损害的细胞，可以进入不受调节的细胞分裂。可用作癌症预后的生物标志物的DNA修复基因和蛋白质的非限制性例子包括同源重组修复基因和蛋白质(例如BRCA1、BRCA2、ATM、MRE11、BLM、WRN、RECQ4、FANCA、FANCB、FANCC、FANCDl、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM和FANCN)、核苷酸切除修复基因和蛋白质(例如XPC、XPE(DDB2)、XPA、XPB、XPD、XPF和XPG)、非同源末端连接基因和蛋白质(例如NBS、Rad50、DNA-PKcs、Ku70和Ku80)、跨损伤合成基因和蛋白质(例如XPV(POLH))、错配修复基因和蛋白质(例如hMSH2、hMSH6、hMLH1、hPMS2)、腺嘌呤的碱基切除修复基因和蛋白质(例如MUTYH)、细胞周期检查点基因和蛋白质(例如p53、p21、ATM、ATR、BRCA1、MDC1和53BP1)、以及TET家族基因和蛋白质(例如FUS、EWS、TAF15、SARF和TLS)。优选地，DNA修复基因或蛋白质是TET家族成员，特别是FUS。FUS已显示与FUSIP1、ILF3、PRMT1、RELA、SPI1和TNPO1相互作用。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为DNA修复蛋白质。
至少一种生物标志物可以是萜类主链生物合成基因或蛋白质。不受理论束缚，萜类主链生物合成基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为一些萜类例如CoQ10的生物合成据报道在癌症中是降低的。可用作癌症预后的生物标志物的萜类主链生物合成基因和蛋白质的非限制性例子包括ACAT1、ACAT2、HMGCS1、HMGCS2、HMGCR、MVK、PMVK、MVD、IDI1、IDI2、FDPS、GGPS1、PDSS1、PDSS2、DHDDS、FNTA、FNTB、RCE1、ZMPSTE24、ICMT和PCYOX1。优选地，萜类主链生物合成基因或蛋白质是PDSS2。
至少一种生物标志物可以是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)途径基因或蛋白质。不受理论束缚，PI3K基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为该途径部分调节细胞凋亡。PI3K途径的非限制性例子包括配体(例如胰岛素、IGF-1、IGF-2、EGF、PDGF、FGF和VEGF)、受体酪氨酸激酶(例如胰岛素受体、IGF受体、EGF受体、PDGF受体、FGF受体和VEGF受体)、激酶(例如PI3K、AKT、mTOR、GSK3-β、IKK、PDK1、CDKN1B、FAK1和S6K)、磷酸酶(例如PTEN和PHLPP)、核糖体蛋白(例如核糖体蛋白S6)、衔接蛋白质(例如GAB2、GRB2、GRAP、GRAP2、PIK3AP1、PRAS40、PXN、SHB、SH2B1、SH2B2、SH2B3、SH2D3A和SH2D3C)、亲免素(例如FKBP12、FKBP52和FKBP5)、以及转录因子(例如FoxO1、Hif1-α、DEC1和PLAG1)。优选地，PI3K基因或蛋白质是核糖体蛋白，例如核糖体蛋白S6，特别是磷酸-rpS6，或转录因子基因或蛋白质，特别是PLAG1。PLAG1已显示调节IGF-2以及其它靶基因包括CRLF1、CRABP2、CRIP2和PIGF的转录。因此，为了本申请的目的，CRLF1、CRABP2、CRIP2和PIGF被视为PI3K蛋白质。
至少一种生物标志物可以是转化生长因子-β(TGF-β)途径基因或蛋白质。不受理论束缚，TGF-β基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为TGF-β信号传导途径使细胞周期停止在G1期以停止增殖，并且还促进细胞凋亡。TGF-β信号传导的破坏增加增殖且减少细胞凋亡。TGF-β途径成员的非限制性例子包括配体(例如激活蛋白A、GDF1、GDF11、BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、Nodal、TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)、I型受体(例如TGF-βR1、ACVR1B、ACVR1C、BMPR1A和BMPR1B)、II型受体(例如TGF-βR2、ACVR2A、ACVR2B、BMPR2B)、SARA、受体调节的SMAD(例如SMAD1、SMAD2、SMAD3、SMAD5和SMAD9)、coSMAD(例如SMAD4)、细胞凋亡蛋白质(例如DAXX)、以及细胞周期蛋白质(例如p15、p21、Rb和c-myc)。优选地，TGF-β途径基因或蛋白质是SMAD，特别是SMAD2或SMAD4。
至少一种生物标志物可以是电压依赖性阴离子通道基因或蛋白质。不受理论束缚，电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为它们已显示在细胞凋亡中起作用。电压依赖性阴离子通道的非限制性例子包括VDAC1、VDAC2、VDAC3、TOMM40和TOMM40L。优选地，电压依赖性阴离子通道是VDAC1。VDAC1已显示与凝溶胶蛋白、BCL2-样1、PRKCE、Bcl-2-相关X蛋白质和DYNLT3相关。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为电压依赖性阴离子通道。
至少一种生物标志物可以是RNA剪接基因或蛋白质。不受理论束缚，RNA剪接基因和蛋白质可以与癌症预后关联，因为异常剪接的mRNA也在高比例的癌性细胞中发现。RNA剪接基因和蛋白质的非限制性例子包括snRNP(例如U1、U2、U4、U5、U6、U11、U12、U4atac和U6atac)、U2AF和YBX1。优选地，RNA剪接基因或蛋白质是YBX1。YBX1已显示与RBBP6、PCNA、ANKRD2、SFRS9、CTCF和P53相互作用。因此，为了本申请的目的，这些基因和蛋白质被视为RNA剪接蛋白质。
本发明的优选预后决定因素包括ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、pS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5、pPRAS40。本发明的更优选的预后决定因素包括ACTN1、FUS、SMAD2、DERL1、pS6、YBX1、SMAD4、VDAC1、DCC、CUL2、PLAG1和PDSS2。十二种更优选的生物标志物在下表1中更详细地列出。
表1.预后决定因素和示例性NCBI参考编号
如本文使用的，术语“ACTN1”指辅肌动蛋白，α1。ACTN1还可以称为辅肌动蛋白α1、α-辅肌动蛋白细胞骨架同种型、非肌肉α-辅肌动蛋白-1、F-肌动蛋白交联蛋白质、辅肌动蛋白1平滑肌或α-辅肌动蛋白-1。它是可将肌动蛋白锚定至各种细胞内结构的F-肌动蛋白交联蛋白质。例如，ACTN1蛋白质序列可以包含SEQIDNO：1，并且ACTN1mRNA序列可以包含SEQIDNO：2。
如本文使用的，术语“CUL2”指Cullin-2。它是基于多重cullin-RING的E3泛素-蛋白连接酶复合体的核心组分。例如，CUL2蛋白质序列可以包含SEQIDNO：3，并且CUL2mRNA序列可以包含SEQIDNO：4。
如本文使用的，术语“DCC”指结直肠癌缺失。DCC还可以称为IGDCC、结直肠肿瘤抑制子、结直肠癌抑制子、结直肠癌蛋白质缺失、免疫球蛋白超家族DCC亚类成员1、免疫球蛋白超家族，DCC亚类成员1、肿瘤抑制蛋白质DCC、神经生长因子受体DCC2CRC18和CRCR1。它是依赖性受体。在神经生长因子的存在下，它促进轴突生长，并且当神经生长因子不存在时，诱导细胞凋亡。例如，DCC蛋白质序列可以包含SEQIDNO：5，并且DCCmRNA序列可以包含SEQIDNO：6。
如本文使用的，术语“DERL1”指Derlin1。DERL1还可以称为DER1、DER-1、DER1样结构域家族成员、内质网蛋白质1降解、DERtrin-1、FLJ13784、MGC3067、PRO2577和Der1样蛋白质。它参与ER相关的降解应答，并且将错折叠或展开的蛋白质从ER腔逆向易位到细胞溶质，用于蛋白酶体降解。例如，DERL1蛋白质序列可以包含SEQIDNO：7，并且DERL1mRNA序列可以包含SEQIDNO：8。
如本文使用的，术语“FUS”指肉瘤中融合。FUS还可以称为TLS、ALS6、FUS1、癌基因FUS、癌基因TLS、脂肪肉瘤中易位蛋白质、75kDaDNA配对蛋白质、肌萎缩侧索硬化6、hnRNP-P2、ETM4、HNRNPP2、PoMP75、fus样蛋白质、粘液样脂肪肉瘤中的融合基因、核不均一核糖核蛋白P2、RNA结合蛋白FUS和POMp75。它是TET蛋白质家族的成员，其牵涉包括基因表达的调节、基因组完整性的维持和mRNA/微小RNA加工的细胞过程。例如，FUS蛋白质序列可以包含SEQIDNO：8，并且FUSmRNA序列可以包含SEQIDNO：10。
如本文使用的，术语“PDSS2”指异戊二烯基(十异戊二烯基)二磷酸合成酶，亚基2。PDSS2还可以称为DLP1；hDLP1；COQ10D3；C6orf210；bA59I9.3；十异戊二烯基焦磷酸合成酶亚基2；十异戊二烯基-二磷酸合成酶亚基2；全反式十异戊二烯基-二磷酸合酶亚基2；十异戊二烯基二磷酸合成酶的亚基2；十异戊二烯基焦磷酸合酶亚基2；EC2.5.1.91；和染色体6开放读码框210。它是合成呼吸链中的关键元素辅酶Q或泛醌的异戊二烯基侧链的酶。例如，PDSS2蛋白质序列可以包含SEQIDNO：11，并且PDSS2mRNA序列可以包含SEQIDNO：12。
如本文使用的，术语“PLAG1”指多形性腺瘤基因1。PLAG1还可以称为PSA；SGPA；ZNF912；COL1A2/PLAG1融合物；锌指蛋白PLAG1；和多形性腺瘤基因1蛋白质。它是具有2个假定核定位信号的锌指蛋白。例如，PLAG1蛋白质序列可以包含SEQIDNO：13，并且PLAG1mRNA序列可以包含SEQIDNO：14。
如本文使用的，术语“RpS6”指核糖体蛋白S6。RpS6还可以称为S6；磷蛋白NP33；和40S核糖体蛋白S6。它是细胞质核糖体蛋白，其为40S核糖体亚基的组分。例如，RpS6蛋白质序列可以包含SEQIDNO：15，并且RpS6mRNA序列可以包含SEQIDNO：16。
如本文使用的，术语“SMAD2”指SMAD家族成员2。SMAD2还可以称为JV18；MADH2；MADR2；JV18-1；hMAD-2；hSMAD2；SMAD家族成员2；SMAD，母亲抗DPP同系物2(果蝇(Drosophila))；母亲抗DPP同系物2；母亲抗生存因子(decapentaplegic)同系物2；Sma-和Mad-相关蛋白2；MAD同系物2；Mad相关蛋白2；母亲抗DPP同系物2；和MAD，母亲抗生存因子同系物2(果蝇)。它是Smad家族蛋白质的成员，其是信号转导蛋白和转录调节物，其介导多重信号传导途径，例如TGF-β途径、细胞增殖过程、细胞凋亡过程和分化过程。例如，SMAD2蛋白质序列可以包含SEQIDNO：17，并且SMAD2mRNA序列可以包含SEQIDNO：18。
如本文使用的，术语“SMAD4”指SMAD家族成员4。SMAD4还可以称为JIP；DPC4；MADH4；MYHRS；胰腺癌缺失基因座4；母亲抗生存因子同系物4；母亲抗生存因子，果蝇，同系物4；胰腺癌缺失靶4；SMAD，母亲抗DPP同系物4；MAD同系物4；hSMAD4；MAD，母亲抗生存因子同系物4(果蝇)；母亲抗DPP同系物4；和SMAD，母亲抗DPP同系物4(果蝇)。它是Smad家族蛋白质的成员，并且可以与其它活化Smad蛋白质形成同聚复合物和异聚复合物，其随后在核中累积且调节靶基因的转录。例如，SMAD4蛋白质序列可以包含SEQIDNO：19，并且SMAD4mRNA序列可以包含SEQIDNO：20。
如本文使用的，术语“VDAC1”指电压依赖性阴离子通道1。VDAC还可以称为VDAC-1；PORIN；MGC111064；线粒体外膜蛋白孔蛋白1；电压依赖性阴离子选择性通道蛋白质1；质膜孔蛋白；VDAC；孔蛋白31HL；hVDAC1；和孔蛋白31HM。它是电压依赖性阴离子通道蛋白质，其为线粒体外膜的主要组分。它可以促进代谢产物和离子跨越线粒体外膜的交换，并且可以调节线粒体功能。例如，VDAC1蛋白质序列可以包含SEQIDNO：21，并且VDAC1mRNA序列可以包含SEQIDNO：22。
如本文使用的，术语“YBX1”指Ybox结合蛋白1。YBX1还可以称为YB1；BP-8；YB-1；CSDA2；NSEP1；MDR-NF1；NSEP-1；核酸酶敏感元件结合蛋白1；DBPB；增强因子I亚基A；CBF-A3；EFI-A；CCAAT结合转录因子I亚基A；DNA结合蛋白B；Y-box转录因子；CSDB；Y-box结合蛋白1；主要组织相容性复合物，II类，Y-box结合蛋白I；和核酸酶敏感元件结合性蛋白1。它介导mRNA前体可变剪接调节。例如，它可以与mRNA前体中的剪接位点结合，并且调节剪接位点选择。它还可以结合且稳定细胞质mRNA。例如，YBX1蛋白质序列可以包含SEQIDNO：23，并且YBX1mRNA序列可以包含SEQIDNO：24。
本文提及的另一种生物标志物是HSPA9。如本文使用的，术语“HSPA9”指热休克70kDa蛋白9(致死蛋白)。HSPA9还可以称为CSA；MOT；MOT2；GRP75；PBP74；GRP-75；HSPA9B；MTHSP75；或HEL-S-124m。针对人HSPA9的EntrezGeneID是3313。人HSPA9mRNA序列在NM_004134.6(SEQIDNO:26)中提供。人HSPA9蛋白质序列在NP_004125.3(SEQIDNO:25)中提供。例如，HSPA9蛋白质序列可以包含SEQIDNO：25。例如，HSPA9mRNA序列可以包含SEQIDNO：26。
本文呈现的序列仅是举例说明性的。本发明的生物标志物涵盖所有具体描述的生物标志物的所有形式和变体，包括但不限于多态性或等位基因变体、同种型、突变体、衍生物、前体包括核酸和前蛋白、切割产物、以及包含生物标志物中的任一种作为完全装配结构的组成成分亚基的结构。
生物标志物实验对象组的构建
如上所述，PD与癌症预后关联的能力可以通过组合使用它们得到扩大。因此，本发明的生物标志物实验对象组可以用本文描述的两种或更多种PD进行构建。本发明的生物标志物实验对象组可以包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种生物标志物，其中每种生物标志物独立地选自至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质。优选地，生物标志物实验对象组包含六、七、八或九种生物标志物，最优选七种生物标志物。
本发明的优选生物标志物实验对象组可以包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种生物标志物，其中每种生物标志物独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、pS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。本发明的优选生物标志物实验对象组可以包含二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种生物标志物，其中每种生物标志物独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、DERL1、pS6、YBX1、SMAD4、VDAC1、DCC、CUL2、PLAG1和PDSS2。优选地，生物标志物实验对象组包含六、七、八或九种生物标志物，最优选七种生物标志物。生物标志物的精确组合和权重可取决于待寻求的预后信息而改变。
考虑了下述生物标志物组合：
1.PD1和PD2，其中PD1和PD2是不同的；
2.PD1、PD2和PD3，其中PD1、PD2和PD3是不同的；
3.PD1、PD2、PD3和PD4，其中PD1、PD2、PD3和PD4是不同的；
4.PD1、PD2、PD3、PD4和PD5，其中PD1、PD2、PD3、PD4和PD5是不同的；
5.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6是不同的；
6.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7是不同的；
7.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7和PD8，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7和PD8是不同的；
8.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8和PD9，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8和PD9是不同的；
9.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9和PD10，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9和PD10是不同的；
10.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10和PD11，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10和PD11是不同的；
11.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12是不同的；
其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12各自独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、pS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。
下述生物标志物组合是优选的：
1.PD1和PD2，其中PD1和PD2是不同的；
2.PD1、PD2和PD3，其中PD1、PD2和PD3是不同的；
3.PD1、PD2、PD3和PD4，其中PD1、PD2、PD3和PD4是不同的；
4.PD1、PD2、PD3、PD4和PD5，其中PD1、PD2、PD3、PD4和PD5是不同的；
5.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6是不同的；
6.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7是不同的；
7.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7和PD8，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7和PD8是不同的；
8.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8和PD9，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8和PD9是不同的；
9.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9和PD10，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9和PD10是不同的；
10.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10和PD11，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10和PD11是不同的；
11.PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12是不同的；
其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6、PD7、PD8、PD9、PD10、PD11和PD12各自独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、DERL1、pS6、YBX1、SMAD4、VDAC1、DCC、CUL2、PLAG1和PDSS2。
任选地，生物标志物的组合包含至少ACTN1、YBX1、SMAD2和FUS。备选地，生物标志物的组合包含(1)至少ACTN1、YBX1和SMAD2；(2)至少ACTN1、YBX1和FUS；(3)至少ACTN1、SMAD2和FUS；或(4)至少YBX1、SMAD2和FUS。生物标志物的一些优选组合在表6中提供，其公开于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,003中，所述美国临时申请的完整内容通过引用并入本文。
组织样品
在本发明的方法中使用的组织样品可以是通过活组织检查获得的肿瘤样品(例如前列腺肿瘤样品)。如果来自初始测试例如前列腺特异性抗原(PSA)血液测试或直肠指检(DRE)的结果提示前列腺癌，则医疗保健提供者可以下令活组织检查(例如前列腺活组织检查)。为了获得前列腺活组织检查，医疗保健提供者可以使用细针来收集来自前列腺的许多组织样品(也称为“芯吸”样品)(还参见下文讨论)。用于本发明的方法的组织样品还可以通过手术(例如前列腺切除术)获得，所述手术由泌尿科医生或机器人外科医生执行。通过手术获得的组织样品可以是整个或部分前列腺，并且可以包含一个或多个淋巴结。在实施方案中，组织样品可以是福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)的块。切片可以通过任何适当手段从FFPE块中切割且置于载玻片上。含有来自多重肿瘤或患者的样品的载玻片可以组合成一个分批，作为组织微阵列(TMA)用于加工。同样可以使用冷冻组织。合适的对照载玻片或对照核心例如由细胞系制备的那些可以加入分批中，所述细胞系具有ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的广泛范围表达。
可以选择对于每种生物标志物(例如ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1)显示高、中间和低表达水平的对照细胞系集合。这些细胞系随后可以使用标准组织学技术，用福尔马林固定，加工且掺入石蜡块内。通过将来自每种细胞系石蜡块的核心置于新的接受块内，可以建立细胞系对照TMA。这种细胞系对照TMA可以进行切片，并且所得到的切片可以与患者组织样品平行染色。因为细胞系代表生物标志物表达的同质性和重现性来源，所以此类细胞系对照TMA可以用作参考点，用于测量患者组织样品中的生物标志物表达的定量免疫染色测定法。比较随着时间过去的定量控制水平允许用户测定设备是否趋于失准。需要时，用户还可以针对对照值标准化患者样品，用于分批之间的绝对定量。
生物标志物的测量
本发明的生物标志物可以以各种形式进行测量。例如，生物标志物的水平可以在基因组DNA水平下进行测量(例如测量拷贝数、异质性、缺失、插入或点突变)、mRNA水平(例如测量转录水平或转录位置)、蛋白质水平(例如蛋白质表达水平、翻译后修饰的定量或活性水平)、或在代谢产物/分析物的水平下。用于测量在基因组DNA、mRNA、蛋白质和代谢产物/分析物水平下的生物标志物水平的方法是本领域已知的。优选地，生物标志物的水平在蛋白质水平下、在全细胞和/或亚细胞区室(例如核、细胞质和细胞膜)中进行测定。在蛋白质水平下测定水平的示例性方法包括但不限于免疫测定法，例如免疫组织化学测定法(IHC)、免疫荧光测定法(IF)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法和免疫酶促测定法。在免疫测定法中，可以使用例如与生物标志物或其片段结合的抗体。抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合或人源化的。抗体可以是双特异性的。还可以使用完整抗体的抗原结合片段，例如单链抗体、Fv片段、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fd片段、单链Fv分子(scFv)、双特异性单链Fv二聚体、纳米抗体、双抗体、结构域缺失抗体、单结构域抗体和/或两种或更多种特异性单克隆抗体的寡克隆混合物。
例如，组织样品例如上文描述的活组织检查载玻片，可以在例如免疫组织化学(IHC)测定法中进行测定，以测量适当生物标志物的水平。在IHC测定法中，针对各种生物标志物的可检测标记的抗体可以用于染色前列腺组织样品，并且结合水平可以通过例如荧光或发光发射进行指示。同样可以使用生色染料(例如DAB、坚固红)。在实施方案中，前列腺组织载玻片用一种或多种抗体进行染色，所述抗体分别与ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1结合。在本发明的方法中使用的抗体可以是单克隆或多克隆的。还可以使用完整抗体的抗原结合部分，或可以与生物标志物特异性结合的任何其它分子实体(例如肽模拟物和实体)。
在蛋白质水平下测量生物标志物的其它方法包括例如色谱法、质谱法、LuminexxMAP技术、基于微流体芯片的测定法、表面等离子体共振、测序、蛋白质印迹分析、适体结合、分子印记、拟肽、基于亲和力的肽结合、基于亲和力的化学结合或其组合。为了测定生物标志物的全细胞和/或亚细胞水平，还可以使用方法例如(参见例如美国专利7,219,016和7,709,222；Camp等人，NatureMedicine，8(11):1323-27(2002))，和DefiniensTissueStudioTM(参见例如美国专利7,873,223、7,801,361、7,467,159和7,146,380，以及Baatz等人，CombChem高ThroughputScreen，12(9):908-16(2009))。
在一些实施方案中，测量的生物标志物水平针对标准化蛋白质，包括看家基因例如GAPDH、Cyn1、ZNF592或肌动蛋白的表达产物进行标准化，以去除变异来源。标准化方法是本领域众所周知的。参见例如Park等人，BMCBioinformatics.4:33(2003)。
限定目标区域
为了改善测定法的准确度，可以希望限定目标区域且仅定量该目标区域中的生物标志物。目标区域可以通过对样品应用“肿瘤面具”进行限定，使得仅测量肿瘤区域中的生物标志物水平。“肿瘤面具”指允许鉴定目的组织中的肿瘤区域的生物标志物组合。例如，前列腺癌通常为表达上皮标志物例如细胞角蛋白8(CK8或KRT8)和细胞角蛋白18(CK18或KRT18)，同时不表达前列腺基底标志物例如细胞角蛋白5(CK5或KRT5)的癌。因此，针对前列腺癌的“肿瘤面具”可能需要使用与这些标志物特异性结合的抗体的混合物。我们还已惊讶地发现TRIM29(一些其它癌症的肿瘤标志物)是前列腺组织中的基底标志物，而不是肿瘤标志物；因此，抗TRIM29抗体也可以用于前列腺肿瘤面具中。例如，在本发明中有用的前列腺肿瘤面具可以包含抗CK5、抗CK8、抗CK18和抗TRIM29抗体的混合物，其中前列腺肿瘤区域定义为由抗CK8和抗CK18抗体结合，且不由抗CK5和抗TRIM29抗体结合的前列腺组织区域。前列腺肿瘤区域可以定义为由抗CK8或抗CK18抗体优选两者结合的前列腺组织区域。类似地，前列腺肿瘤区域可以定义为不由抗CK5抗体或不由抗TRIM29抗体结合的前列腺组织区域。优选地，前列腺肿瘤区域不由抗CK5或抗TRIM29抗体结合。基底前列腺肿瘤区域可以定义为由抗CK5或抗TRIM2抗体优选两者结合的前列腺组织区域。优选地，基底肿瘤区域不由抗CK8或抗CK18抗体结合。备选地，可以使用上皮和基底标志物的其它组合，例如用于上皮的ESA抗体和用于基底细胞的p63抗体。在除前列腺癌外的癌症中，可以使用允许肿瘤区域鉴定的其它标志物组合，例如对于恶性黑素瘤特异性的S100标志物。
因此，本发明的一个方面提供了用于限定组织样品中的目标区域的方法，其包括使组织样品与特异性用于鉴定目标区域的一种或多种第一试剂接触。目标区域可以包含癌细胞例如前列腺癌细胞。为了鉴定前列腺癌细胞，一种或多种第一试剂可以包含抗细胞角蛋白8抗体、抗细胞角蛋白18抗体或两者。该方法可以进一步包括通过使组织样品与特异性用于鉴定待排除区域的一种或多种第二试剂接触，限定待从目标区域中排除的组织样品区域，例如非癌性细胞。例如，为了排除基底、非癌性前列腺细胞，一种或多种第二试剂可以包含抗细胞角蛋白5抗体、抗TRIM29抗体或两者。
为了允许测量在亚细胞区域例如核、细胞质和细胞膜中的生物标志物，需要使用针对这些区域的特异性标志物。用于鉴定上皮区域的细胞角蛋白8和18提供了细胞质和膜特异性染色模式，并且因此可以用于限定该亚细胞定位。为了鉴定细胞的核区域，前列腺组织样品可以用核特异性荧光染料例如DAPI或Hoechst33342进行染色。
在已执行适当染色后，例如通过对载玻片应用抗褪色试剂和/或盖玻片，活组织检查载玻片可以进行处理，以保存用于检测的信号。载玻片随后可以贮存且通过成像仪读取。如此获得的图像随后可以进行加工，并且定量生物标志物表达。该过程也称为定量多路免疫荧光获取(QMIF获取)。
本发明的多路原位蛋白质组学技术提供了超过常规遗传学平台的几个优点，在所述常规遗传学平台中测量基因表达而不是蛋白质表达/活性。首先，肿瘤面具的使用允许取得仅来自肿瘤组织的标志物信息，而无来自正常组织的“稀释”，因此增强测试的准确度。目前技术还允许定量肿瘤组织的不同区域中的标志物，所述肿瘤组织已知是非常异质性的。来自肿瘤的最侵袭性区域的读出提供了对患者的临床结果的更准确展望，并且因此更可用于帮助医生确定用于患者治疗的最佳过程。另外，本发明的多变量诊断方法已设计为即使对较不具代表性的肿瘤区域也可预测结果，从而减轻由于肿瘤异质性由随机取样误差造成的问题。此外，活化状态抗体的使用和标志物的亚细胞定位允许定量功能活性标志物，进一步增强测试的准确度。
数据加工
得自肿瘤样品的免疫荧光的图像可以输出到模式识别软件内，其使用适合于从图像获取的数据的自动化定量分析的算法(例如使用DefiniensDeveloperXDTM开发的算法，或其它图像分析软件例如INFORM(PerkinElmer)。在本发明的一些实施方案中，此类算法测量抗体的存在和/或水平，所述抗体染色ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1中的一种或多种。算法可以用于将该测量集中于通过CK8和CK18染色的存在以及CK5和TRIM29染色的不存在限定的肿瘤区域。在一些实施方案中，算法用于针对ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1中的一种或多种生成具有最大侵袭性区域的热图。算法还可以用于测量肿瘤体积。
得自组织样品的图像加工的数据用于计算风险得分。风险得分可以测量肿瘤(例如前列腺肿瘤)的侵袭性。例如，风险得分可以预测肿瘤(例如前列腺肿瘤)在诊断时是活跃进展或无痛感/休眠的概率。风险得分还可以预测肿瘤(例如前列腺肿瘤)在诊断时间后的以后某个点进展的概率。风险得分还可以指示癌症(例如前列腺癌)的致死结果/疾病特异性死亡(DSD)，即患有肿瘤的患者死于癌症的概率(例如预期存活的年数)，或肿瘤(例如前列腺肿瘤)进展或转移的风险。这些概率可以在样品中测量的标志物值下，通过评估被训练为预测该风险的模型/分类器来获得。几种概率性二元分类器可以使用，并且是本领域已知的，例如随机森林或逻辑回归。在下文呈现的实施例中，使用逻辑回归。风险得分还可以用于检测在肿瘤组织样品中具有转移潜力的细胞。风险得分还可以掺入其它诊断结果或癌症参数，例如直肠指检(DRE)结果、前列腺特异性抗原(PSA)水平、PSA动力学、格里森评分、肿瘤分期、肿瘤大小、发病年龄和淋巴结状态。风险得分还可以与医疗保健提供者和/或患者通讯，并且用于测定用于患者的治疗方案(例如手术)。
临床应用
呈现的诊断方法对于医疗保健提供者可用于测定用于癌症患者(例如前列腺癌患者)的最适当治疗。当基于医疗史、DRE和/或PSA水平，医疗保健提供者怀疑患者中的癌症(例如前列腺癌)时，他或她可以下令活组织检查(例如前列腺活组织检查)。为了执行活组织检查，全科医生或泌尿科医生可以使用经尿道超声(TRUS)引导的芯吸针，来获得多重(例如8-18)个芯吸样品，各自长约1/2英寸和宽1/16英寸。如果通过形态检查发现癌性细胞，则可以完成进一步检测(例如成像检测，例如骨扫描、CT扫描和MRIProstastintTM扫描)，以帮助给癌症分期。随后可以执行本发明的诊断方法，以进一步预测癌症的侵袭性、进展风险或结果。如果该方法预测1)肿瘤的活跃进展；2)高进展风险；或3)致死结果，则医疗保健提供者可以决定使用侵袭性治疗。例如，除前列腺切除术之外，医生可以使用放射疗法(例如外线束辐射、质子疗法和近距离放射疗法)、激素疗法(例如睾丸切除术、LHRH激动剂或拮抗剂、和抗雄激素)、化学疗法、以及其它适当的处理(例如Sipuleucel-T疗法、冷冻手术和高强度激光疗法)。然而，如果患者预测为具有无痛感PCA，则他可以提交至主动监督且实施重复活组织检查，而无需经历激进治疗。
因此，本发明的一个方面提供了用于预测癌症患者的预后的方法。该方法可以包括在得自患者的样品中，测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质，其中所测量的水平指示癌症患者的预后。任选地，两种或更多种PD选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，两种或更多种PD选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。该方法可以进一步包括从患者获得样品的步骤。预后可以是癌症是侵袭性形式的癌症，患者处于患有侵袭性形式的癌症的风险中，或患者处于具有癌症相关的致死结果的风险中。癌症可以是前列腺癌。
本发明的另一个方面提供了用于鉴定需要辅助疗法的癌症患者的方法，其包括获得来自患者的组织样品；在样品中测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质；其中所测量的水平指示患者需要辅助疗法。任选地，两种或更多种PD选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，两种或更多种PD选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
本发明的另外方面提供了用于治疗癌症患者的方法，其包括测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质；并且如果所测量的水平指示患者具有活跃进展的癌症、或癌症进展的风险、或具有癌症相关的致死结果的风险，则用辅助疗法治疗患者。任选地，两种或更多种PD选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，两种或更多种PD选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。备选地，该方法包括鉴定在至少两种PD中具有水平变化的患者，其中所述水平变化选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1中的一种或多种的上调，以及ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1中的一种或多种的下调；并且用辅助疗法治疗患者。患者可以患有前列腺癌。
辅助疗法可以选自放射疗法、化学疗法、免疫疗法、激素疗法和靶向治疗。在一些实施方案中，靶向疗法靶向信号传导途径的组分，在所述信号传导途径中所选择的PD中的一种或多种是组分，并且其中靶向组分不同于所选择的PD。备选地，靶向疗法靶向所选择的PD中的一种或多种。患者可以实施标准护理疗法，例如手术、放射、化学疗法或雄激素消融。
本发明的进一步方面提供了鉴定能够降低癌症进展的风险，或者延迟或减缓癌症进展的化合物的方法，其包括提供表达选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1的PD的细胞；使细胞与候选化合物接触；和测定所述候选化合物是否改变所选择的PD的表达或活性；从而在化合物的存在下观察到的改变指示该化合物能够降低癌症进展的风险，或者延迟或减缓癌症进展。
本发明的另一个方面提供了用于治疗癌症患者的方法，其包括测量选自下述的两种或更多种PD的水平：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质；并且施用调节所选择的PD的水平的试剂。任选地，两种或更多种PD选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，两种或更多种PD选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。备选地，该方法包括鉴定在至少两种PD中具有水平变化的患者，其中所述水平变化选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1中的一种或多种的上调，以及ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1中的一种或多种的下调；并且施用调节至少一种PD的水平的试剂。
在上述方法的任一种中，可以测量至少三、四、五、六、七、八、九、十、十一或十二种PD的水平。任选地，测量由PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6组成的六种PD的水平，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6是不同的，并且独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，PD1、PD2、PD3、PD4、PD5和PD6是不同的，并且独立地选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
任选地，测量由PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7组成的七种PD的水平，其中PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7是不同的，并且独立地选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、PD6和PD7是不同的，并且独立地选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。该方法可以进一步包括测量选自下述的一种或多种PD的水平：HOXB13、FAK1、COX6C、FKBP5、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。
至少一种PD的测量水平相对于参考值可以是上调的。优选地，上调的PD选自CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、SMAD2和VDAC1。进一步地，至少一种PD的测量水平相对于参考值可以是下调的。优选地，下调的PD选自ACTN1、RpS6、SMAD4和YBX1。因此，至少一种PD的测量水平相对于参考值可以是上调的，并且至少一种PD的测量水平相对于参考值可以是下调的。参考值可以是癌性细胞中的PD的测量水平。
上述方法中的任一种均可包含测量每种PD的基因组DNA水平、mRNA水平或蛋白质水平。例如，该方法可以包括使样品与对于每种PD特异性的寡核苷酸、适体或抗体接触。PD水平可以例如使用多路反应分离或同时测量。优选地，测量每种PD的蛋白质水平。例如通过免疫组织化学或免疫荧光，抗体或抗体片段可以用于测量蛋白质水平。当从单一样品测量超过一种PD时，抗体或其片段可以各自通过不同荧光团进行标记或结合。来自不同荧光团的信号可以通过自动化成像仪同时进行检测。
PD的蛋白质水平可以在特异性亚细胞区室中进行测量。例如，DAPI染剂可以用于鉴定每种细胞的核，因此可以测量核和/或细胞质中的每种PD的量。
类似地，PD的水平可以仅在限定目标区域中进行测量。例如，在癌症中，癌细胞包括在目标区域中，而非癌细胞可以从目标区域中排除。在前列腺中，癌细胞表达细胞角蛋白-8和细胞角蛋白-18，并且基底(非癌)细胞表达细胞角蛋白-5和TRIM29。因此，目标区域可以通过抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体染色进行限定，并且进一步通过抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体染色的缺乏进行限定。排除区域可以通过抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体染色进行限定，并且进一步通过抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体染色的缺乏进行限定。
在上述方法的任一种中，样品是固体组织样品或血液样品，优选固体组织样品。固体组织样品可以是福尔马林固定石蜡包埋的组织样品、快速冷冻的组织样品、乙醇固定的组织样品、用有机溶剂固定的组织样品、用塑料或环氧树脂固定的组织样品、交联的组织样品、手术摘除的肿瘤组织、或活组织检查样品，例如核心活组织检查、和切除组织活组织检查、或切口组织活组织检查。优选地，样品是癌性组织样品。样品可以是前列腺组织样品，例如福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的前列腺肿瘤样品。因此，上述方法可以进一步包括使FFPE前列腺肿瘤样品的横截面与抗细胞角蛋白8抗体、抗细胞角蛋白18抗体、抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体接触，其中在由抗细胞角蛋白8抗体和抗细胞角蛋白18抗体结合，但不由抗细胞角蛋白5抗体和抗TRIM29抗体结合的横截面中的区域中进行所述测量步骤。
上述方法的任一种均可进一步包括测量与癌症相关的至少一种标准参数。标准参数包括但不限于格里森评分、肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤的视觉特征、肿瘤部位、肿瘤生长、淋巴结状态、肿瘤厚度(布瑞斯罗夫得分)、溃疡、发病年龄、PSA水平和PSA动力学。
另外的预后因素
本发明的生物标志物实验对象组可以与另外的生物标志物、临床参数或已知存在或与目的临床结果相关的常规实验室风险因素结合使用。一种或多种临床参数可以用于本发明的实践中，作为在公式中的生物标志物输入，或作为使用特定生物标志物实验对象组和公式，限定待测量的有关群体的预选准则。一种或多种临床参数还可以用于生物标志物标准化和预加工、或生物标志物选择、实验对象组构建、公式类型选择和导出、和公式结果后加工中。类似方法可以用常规实验室风险因素获得。临床参数或常规实验室风险因素是通常在临床实验室中评估，且用于常规总体风险评价算法中的临床特征。针对肿瘤转移的临床参数或常规实验室风险因素可以包括例如肿瘤分期、肿瘤分级、肿瘤大小、肿瘤视觉特征、肿瘤位置、肿瘤生长、淋巴结状态、组织学、肿瘤厚度(布瑞斯罗夫得分)、溃烂、增殖指数、肿瘤浸润性淋巴细胞、发病年龄、PSA水平或格里森评分。针对肿瘤转移的其它常规实验室风险因素是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中，通过呈现的方法获得的生物标志物得分可以与格里森得分结合使用，以获得更佳的预测结果。格里森得分基于前列腺组织的显微镜外观而给予前列腺癌，并且它已在临床上用于预测PCA预后。为了获得格里森得分，前列腺组织样品可以用苏木精和伊红(H&E)染色，并且通过病理学家在显微镜下检查。样品中的前列腺肿瘤模式在1-5的量表上进行分级，其中5是最少分化和最侵入性的。最常见模式的级别(超过50％的肿瘤)与第二最常见模式的级别(小于50％但超过5％)相加，以形成肿瘤格里森得分。2-6的得分指示具有低复发风险的低级别PCA。7(3+4或4+3)的得分指示中间级别的PCA，具有中间的复发风险，而4+3的得分比3+4的得分更严重。8-10的得分指示具有高复发风险的高级别PCA。如通过本文描述的方法测定的风险得分可以与格里森得分一起使用，并且可以改善格里森得分的预测能力。例如，7(3+4)的中间格里森得分不给出患者的PCA复发风险的良好预测。但添加如通过本文描述的方法计算的风险得分改善中间格里森得分的预测力。
用于检测生物标志物的试剂盒
本发明的另一个方面是生成用于测量选自下述的两种或更多种PD的水平的能力：至少一种细胞骨架基因或蛋白质；至少一种泛素化基因或蛋白质；至少一种依赖性受体基因或蛋白质；至少一种DNA修复基因或蛋白质；至少一种萜类主链生物合成基因或蛋白质；至少一种PI3K途径基因或蛋白质；至少一种TFG-β途径基因或蛋白质；至少一种电压依赖性阴离子通道基因和蛋白质；和至少一种RNA剪接基因或蛋白质；包含用于特异性测量所选择的PD的水平的试剂。任选地，两种或更多种PD选自ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6、FAK1、YBX1、SMAD4、VDAC1、COX6C、FKBP5、DCC、CUL2、PLAG1、PDSS2、PXN、AKAP8、DIABLO、CD75、LATS2、DEC1、LMO7、EIF3H、CDKN1B、MTDH2、MAOA、CCND1、HSD17B4、MAP3K5和pPRAS40。优选地，两种或更多种PD选自ACTN1、CUL2、DCC、DERL1、FUS、PDSS2、PLAG1、RpS6、SMAD2、SMAD4、VDAC1和YBX1。
试剂可以测量所选择的PD的基因组DNA水平、mRNA转录水平或蛋白质水平。例如，试剂可以包含一种或多种抗体或其片段、寡核苷酸或适体。
用于选择生物标志物的方法
本发明的另一个方面提供了用于鉴定针对目标疾病的预后决定因素的方法，其包括生物学步骤；技术步骤；执行步骤；和验证步骤。
生物学步骤可以包括由可公开获得的数据生成对于目标疾病汇编的候选物列表，所述可公开获得的数据包括科学文献、数据库和会议时的展示；并且基于生物学相关、计算机模拟分析、已知的表达信息和必需单克隆抗体的商业可用性，将候选物列表区分优先次序。
技术步骤可以包括获得针对候选预后决定因素的抗体；使用3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色，在免疫组织化学测定法中测试抗体，以评估染色特异性和强度；并且在免疫荧光(IF)测定法中，用DAB以足够的染色特异性和强度测试抗体，以测定IF特异性、信号强度和动态，以鉴定通过技术要求的抗体。
执行步骤可以包括使微型组织微阵列(TMA)与通过技术要求的抗体接触，其中微型TMA包含在目标疾病的不同阶段时的几种样品；定量针对每种抗体的免疫荧光强度；使针对每种抗体的免疫荧光强度与微型TMA中的每种样品的预后关联；并且测定哪些抗体在微型TMA上证实针对与目标疾病预后关联的多变量表现。任选地，执行步骤进一步包括使更大型的TMA与通过技术要求的抗体接触，其中更大型的TMA包含在目标疾病的不同阶段时的几种样品；定量针对每种抗体的免疫荧光强度；使针对每种抗体的免疫荧光强度与微型TMA中的每种样品的预后关联；并且测定哪些抗体在更大型的TMA上证实针对与目标疾病预后关联的多变量表现。在一些实施方案中，执行步骤进一步包括执行生物信息学分析，以鉴定针对与目标疾病的预后关联的PD的抗体组合。
验证步骤可以包括获得来自患有目标疾病的患者的组织样品；使组织样品与针对目标疾病的PD的抗体或针对目标疾病的PD的抗体组合接触；定量针对每种抗体或抗体组合的免疫荧光强度；并且使针对每种抗体或抗体组合的免疫荧光强度与受试者针对目标疾病的预后关联。
示例计算机系统
与本公开内容一致的本文描述的各个方面和功能可以作为硬件、软件、或硬件和软件的组合在一个或多个计算机系统上实现。存在目前使用的计算机系统的许多例子。一些例子尤其包括网络应用、个人计算机、工作站、大型机、联网的客户端、服务器、介质服务器、应用服务器、数据库服务器、网络服务器和虚拟服务器。计算机系统的其它例子可以包括移动计算设备例如手机和个人数字助理，以及网络设备例如负载均衡器、路由器和交换机。另外，与本公开内容一致的方面可以位于单一计算机系统上，或可以分布在与一种或多种通信网络连接的多个计算机系统中。
例如，各个方面和功能可以分布在一个或多个计算机系统中，所述一个或多个计算机系统配置为对一个或多个客户端计算机提供服务，或执行作为分布系统的部分的总体任务。另外，方面可以在客户服务器或多层系统上执行，所述客户服务器或多层系统包括执行各种功能的分布在一个或多个服务器系统中的部件。因此，公开内容并不限于在任何特定系统或系统组上执行。进一步地，方面可以在软件、硬件或固件或其任何组合中实现。因此，与本公开内容一致的方面可以在使用各种硬件和软件配置的方法、动作、系统、系统布局和部件内实现，并且公开内容并不限于任何特定分布的体系结构、网络或通信协议。此外，与本公开内容一致的方面可以作为专门编程的硬件和/或软件实现。
图26显示了分布式计算机系统100的方框图，在其中可以实践与本公开内容一致的各个方面和功能。分布式计算机系统100可以包括一个或多个计算机系统。例如，如举例说明的，分布式计算机系统100包括三个计算机系统102、104和106。如所示的，计算机系统102、104和106通过通信网络108互联，并且可以通过通信网络108交换数据。网络108可以包括计算机系统可以通过其交换数据的任何通信网络。为了经由网络108交换数据，计算机系统102、104和106以及网络108可以使用各种方法、协议和标准，尤其包括令牌网、以太网、无线以太网、蓝牙、TCP/IP、UDP、HTTP、FTP、SNMP、SMS、MMS、SS7、JSON、XML、REST、SOAP、CORBAIIOP、RMI、DCOM和网络服务。为了确保数据传送安全，使用各种安全措施包括在其它安全技术中的TSL、SSL或VPN，计算机系统102、104和106可以经由网络108传递数据。虽然分布式计算机系统100举例说明了三个联网的计算机系统，但分布式计算机系统100可以包括使用任何介质和通信协议联网的任何数目的计算机系统。
与本公开内容一致的各个方面和功能可以作为在一个或多个计算机系统中执行的专门硬件或软件实现，所述一个或多个计算机系统包括图1中所示的计算机系统102。如预期的，计算机系统102包括处理器110、存储器112、总线114、界面116和存储系统118。可以包括一个或多个微处理器或其它类型的控制器的处理器110可以执行处理数据的一系列指令。处理器110可以是众所周知的、商购可得的处理器，例如IntelPentium、IntelAtom、ARMProcessor、MotorolaPowerPC、SGIMIPS、SunUltraSPARC或Hewlett-PackardPA-RISC处理器，或可以是任何其它类型的处理器或控制器，因为许多其它处理器和控制器是可获得的。处理器110可以是移动设备或智能手机处理器，例如ARMCortex处理器、QualcommSnapdragon处理器或Apple处理器。如所示的，处理器110通过总线114与其它系统布局包括存储器112连接。
存储器112可以用于在计算机系统102的操作过程中储存程序和数据。因此，存储器112可以是相对高性能、易失性、随机存取存储器，例如动态随机存取存储器(DRAM)或静态存储器(SRAM)。然而，存储器112可以包括用于储存数据的任何设备，例如磁盘驱动器或其它非易失性存储装置，例如闪速存储器或相变存储器(PCM)。与本公开内容一致的各个实施方案可以将存储器112组构到具体化结构，以及在一些情况下，独特结构内，以执行本文公开的方面和功能。
计算机系统102的部件可以通过互联元素例如总线114联接。总线114可以包括一个或多个物理总线(例如在相同机器内整合的部件之间的总线)，并且可以包括在系统布局之间偶联的任何通讯，包括专门或标准计算总线技术例如IDE、SCSI、PCI和InfiniBand。因此，总线114允许通信(例如数据和指令)在计算机系统102的系统部件之间交换。
计算机系统102还包括一个或多个界面设备116，例如输入设备、输出设备和组合输入/输出设备。界面设备116可以接受输入，提供输出或两者。例如，输出设备可以提供用于外部展示的信息。输入设备可以接受来自外部来源的信息。界面设备的例子尤其包括键盘、鼠标设备、轨迹球、麦克风、触摸屏、打印设备、显示屏、扬声器、网络接口卡等。界面设备116允许计算机系统102与外部实体例如用户及其它系统交换信息且通讯。
存储系统118可以包括计算机可读和计算机可写非易失性存储介质，在其中储存限定待由处理器执行的程序的指令。存储系统118还可以包括在介质上或中记录的信息，并且该信息可以通过程序加工。更具体而言，信息可以储存于专门配置为保存存储空间或增加数据交换性能的一种或多种数据结构。指令可以作为编码信号永久储存，并且指令可以促使处理器执行本文描述的功能中的任一种。可以与各个实施方案一起使用的介质尤其可以包括例如光盘，磁盘或闪速存储器。在操作中，处理器110或一些其它控制器可以促使数据从非易失性记录介质阅读到另一个存储器例如存储器112内，其允许通过处理器110比存储系统118中包括的存储介质更快速接近信息。存储器可以位于存储系统118或存储器112中。处理器110可以处理存储器112内的数据，并且随后在加工完成后，将数据拷贝至与存储系统118相关的介质。各种部件可以管理在介质和存储器112之间的数据移动，并且公开内容并不限于此。
进一步地，公开内容并不限于特定存储器系统或存储系统。尽管计算机系统102例如作为一类计算机系统显示，与本公开内容一致的各个方面和功能可以在所述计算机系统上进行实践，但公开内容的方面并不限于在图1中所示的计算机系统上实现。与本公开内容一致的各个方面和功能可以在一种或多种计算机上进行实践，所述一种或多种计算机具有与图1中所示那种不同的体系结构或部件。例如，计算机系统102可以包括专门编程的专用硬件，例如定制为执行本文公开的特定操作的专用集成电路(ASIC)。另实施方案可以执行相同功能，使用具有MotorolaPowerPC处理器，运行MACOSSystemX的几种通用计算设备，以及运行有专利权的硬件和操作系统的几种专门计算设备。
计算机系统102可以包括操作系统，其管理在计算机系统102中包括的硬件布局的至少一部分。处理器或控制器例如处理器110可以执行操作系统，其尤其可以是可得自MicrosoftCorporation的基于Windows的操作系统(例如WindowsNT、Windows2000/ME、WindowsXP、Windows7或WindowsVista)，可得自AppleComputer的MACOSSystemX操作系统，许多基于Linux的操作系统分布之一(例如可得自RedHatInc.的EnterpriseLinux操作系统)，可得自SunMicrosystems的Solaris操作系统，或可得自各种来源的UNIX操作系统。操作系统可以是移动设备或智能手机操作系统，例如WindowsMobile、Android或iOS。可以使用许多其它操作系统，并且实施方案并不限于任何特定操作系统。计算机系统102可以包括虚拟化功能，其为虚拟机(例如模拟物理机器)内的操作系统提供服务。系统体系结构的各种部件可以位于分离的“虚拟机”内的操作系统的个别实例上，因此彼此略微绝缘运行。
处理器和操作系统一起限定计算平台，对于其可以书写以高水平编程语言的应用程序。这些组分应用可以是可执行的、中间的(例如C#或JAVA字节码)或说明代码，其使用通信协议(例如TCP/IP)经过通信网络(例如因特网)通讯。类似地，与本公开内容的方面一致的功能可以使用面向对象的编程语言例如SmallTalk、JAVA、C++、Ada或C#(C-Sharp)实现。还可以使用其它面向对象的编程语言。备选地，可以使用程序、脚本或逻辑编程语言。
另外，与本公开内容的方面一致的各种功能可以在非编程环境下实现(例如以HTML、XML或其它格式创建的文件，当在浏览器程序的窗口中察看时，所述文件提供图形用户界面的方面或执行其它功能)。进一步地，与本公开内容的方面一致的各个实施方案可以作为编程或非编程布局或其任何组合实现。例如，网页可以使用HTML实现，而由网页内调用的数据对象可以以C++书写。因此，公开内容并不限于具体编程语言，并且还可以使用任何合适的编程语言。
在实施方案内包括的计算机系统可以执行超出公开内容范围的功能。例如，系统的方面可以使用现有产品来实现，例如Google搜索引擎，可得自Sunnyvale，California的Yahoo！的Yahoo搜索引擎，或可得自MicrosoftofSeattleWashington的Bing搜索引擎实现。系统的方面可以在数据库管理系统上实现，例如可得自Seattle，Washington的Microsoft的SQLServer；来自RedwoodShores，California的Oracle的OracleDatabase；以及来自SantaClara，California的SunMicrosystems的MySQL；或整合软件例如来自Armonk，NewYork的IBM的WebSphere中间件。然而，运行例如SQLServer的计算机系统可能能够支持与本公开内容一致的方面，以及不在公开内容范围内的各式各样应用的数据库两者。
另外，本文描述的方法可以掺入其它硬件和/或软件产品内，例如网络出版产品、网络浏览器、或者网络营销或搜索引擎优化工具。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。示例性方法和材料在下文描述，尽管与本文描述的那些相似或等价的方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中。本文提及的所有出版物和其它参考文献通过引用全文并入。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。尽管本文引用了许多文件，但这种引用不构成这些文件中的任一种形成本领域的公知常识的部分的承认。本说明书和实施方案自始至终，单词“包含(comprise)”或其变化例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将理解为暗示包括所述整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。材料、方法和例子仅是举例说明性的，并且不预期是限制性的。
实施例
本发明的进一步细节在下述非限制性实施例中描述。应当理解这些实施例虽然指示本发明的一些优选实施方案，但仅作为举例说明而给出，并且不应解释为限制所附实施方案或权利要求。根据本公开内容和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的某些特征，并且无需背离其精神和范围，可以作出这些实施例的变化和修饰以使其适应各种使用和条件。
实施例1：肿瘤微阵列的制备
实施例2-4中所述的实验利用四种不同的肿瘤微阵列(TMA)：细胞系对照TMA、微型TMA、高观察格里森TMA和低观察格里森TMA。
A.细胞系对照TMA的制备
选择细胞系对照集合来测量多路免疫荧光测定法的可靠性和重现性。这些细胞系具有针对肿瘤标志物的一系列表达水平，所述肿瘤标志物可以在多路免疫荧光测定法中进行分析。细胞系及其生物标志物表达水平在下表2中描述。
表2：细胞系对照处理和肿瘤标志物表达模式。
所选细胞系在标准条件下生长，并且如果需要，则用PI3K激酶抑制剂处理(参见表2)。细胞用PBS洗涤，在平板上用10％福尔马林直接固定5分钟，刮取且在固定剂中收集，在室温下连续固定总共1小时。细胞随后离心下来并且用PBS洗涤两次。将细胞沉淀物重悬浮于以70℃的温Histogel中，并且在Eppendorf管中快速离心下来，以形成浓缩的细胞-Histogel沉淀物。将沉淀物包埋在石蜡中，置于标准石蜡块内，并且用作组织微阵列(TMA)构建的供体块。
使用经修饰的琼脂糖块程序制备TMA块(Yan等人，JHistochemCytochem55(1)：21-24(2007)。简言之，将0.7％琼脂糖块包埋到石蜡块内，并且用作TMA受体块。使用TMAMASTER(3DHISTECH)仪器，将受体块预钻孔1mm核心。从细胞系对照的供体块中取出一mm核心，并且置于TMA受体块内，以制备细胞系对照TMA。随后通过将TMA块面朝下按压到载玻片上，并且将其置于65℃热板上15分钟，以使得石蜡熔化且将核心完全融合在块内，来排列核心。使具有块的载玻片冷却，从载玻片取出TMA块，修剪且从TMA块切割5μm连续切片。
B.微型TMA的制备
为了生成微型TMA，我们使用来自患者的注释队列的福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)前列腺肿瘤样品块，所述患者已经历根治性前列腺切除术且已测定其格里森得分。队列由约40个无痛感肿瘤(格里森n≤3+3)和约40个侵袭性肿瘤(格里森≥4+3)组成。
使用经修饰的琼脂糖块程序制备TMA块(Yan等人，同上)。简言之，将0.7％琼脂糖块包埋到石蜡块内，并且用作TMA受体块。使用TMAMASTER(3DHISTECH)仪器，将受体块预钻孔1mm核心。从约80个队列供体块中取出一mm核心，并且置于TMA受体块内，以制备微型TMA。细胞系对照穿插有队列样品，以充当载玻片内或核心间染色重现性、载玻片间染色重现性以及日间染色重现性的对照。随后通过将TMA块面朝下按压到载玻片上，并且将其置于65℃热板上15分钟，以使得石蜡熔化且将核心完全融合在块内，来排列核心。使具有块的载玻片冷却，从载玻片取出TMA块，修剪且从TMA块切割5μm连续切片。
C.高和低观察格里森TMA的制备
来自患者的注释队列的福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)前列腺肿瘤样品块得自FolioBiosciences(Powell，OH)，所述患者已经历根治性前列腺切除术。
从每个FFPE块切割一系列5μm切片，并且切片用于组织质量控制加工和后续格里森得分注释。一些切片经历免疫荧光染色，以测定组织质量是否适合于进一步研究，且确保组织含有足够的肿瘤区域用于进一步研究。简言之，将这些对照FFPE切片加工用于免疫荧光染色，并且用抗磷酸STAT3-T705兔单克隆抗体(mAb)、抗STAT3小鼠mAb、Alexa488缀合的抗细胞角蛋白8小鼠mAb、Alexa488缀合的抗细胞角蛋白18小鼠mAb、Alexa555缀合的抗细胞角蛋白5小鼠mAb、和Alexa555缀合的抗TRIMmAb染色(参见表1)。在荧光显微镜(VectraSystem，PerkinElmer)下，就通过每种抗体的染色目视检查载玻片。基于染色强度和自体荧光，将切片及其相应的FFPE块分级成指示组织质量的四个类别，如表2中所示。肿瘤区域定义为缺乏基底细胞标志物的前列腺上皮结构。抗细胞角蛋白8和抗细胞角蛋白18mAb用于指示上皮特异性染色。抗细胞角蛋白5和抗TRIM29mAb用于指示基底细胞染色。仅将含有足够量的肿瘤面积且落入最高两个质量类别内的FFPE块用于进一步研究中。
由每个FFPE块最后切割的5μm切片用苏木精和伊红(H&E)进行染色，并且使用AperioXT系统(Aperio，Vista，CA)进行扫描。将扫描的图像保藏于SPECTRUM数据库(Aperio，Vista，CA)。H&E染色切片的图像进行远程审查，并且经由ImageScope软件(Aperio，Vista，CA)，通过在BrighamandWomen’sHospital(Boston，MA)和JohnsHopkinsUniversity(Baltimore，MD)的美国病理学委员会认证的解剖病理学家，以不知情形式注释格里森得分。病理学家将对应于1mm核心的注释圆圈置于每个切片图像上的最高格里森得分模式的四个区域和最低格里森得分模式的两个区域上(参见例如图1)。选择一个最高格里森切片和一个最低格里森切片用于分别包括在高和低观察格里森TMA内。在其中肿瘤相对均匀的情况下，高和低切片大致相同。
使用经修饰的琼脂糖块程序制备TMA块(Yan等人，同上)。简言之，将0.7％琼脂糖块包埋到石蜡块内，并且用作TMA受体块。使用TMAMaster(3DHistech)仪器，将受体块预钻孔1mm核心。从细胞系对照(上文描述的)的供体块中取出一mm核心，并且置于受体块的三个分离区域内：顶部、中间和底部部分。以这种排列，细胞系对照可以充当载玻片内或核心间染色重现性、载玻片间染色重现性以及日间染色重现性的对照。细胞系对照的一个重要特征是它们在TMA块的远处切片之间一致。当核心切割成切片时，组织样品改变，而细胞系对照是贯穿核心深度的细胞的均匀混合物并且不改变。
通过了质量控制的前列腺肿瘤样品的FFPE块选择为患者样品供体块。这些供体块在对应于按照病理学家注释的所选高和低观察格里森切片的区域中芯吸。患者样品置于受体块内的次序是随机化的。当一式两份核心取自每个供体块(即一个高观察格里森核心和一个低观察格里森核心)，并且置于两个分离的受体块之一内时，第二核心置于相对于第一核心的位置随机化的位置中。换言之，高观察格里森TMA与低观察格里森TMA随机分离。因此，所得到的两个一式两份TMA块就患者样品组成而言是相同的，但其位置随机化。随后通过将TMA块面朝下按压到载玻片上，并且将其置于65℃热板上15分钟，来排列核心，使得石蜡熔化且将核心完全融合在块内。使具有块的载玻片冷却，从载玻片取出TMA块，修剪且从TMA块切割5μm连续切片。得自前列腺肿瘤样品的每个核心随后通过病理学家注释，以给出观察到的格里森得分(仅基于分离的核心，与先前获得的整个肿瘤“实际”格里森得分分离)。例如，从侵袭性肿瘤选择且置于LTMA上的核心可以已注释为具有3+3的“观察到的”格里森得分，尽管肿瘤的“实际”手术格里森得分大于4+3。
实施例2：用于生物标志物选择的工具
我们开发了生物标志物选择和验证工具，其可以用于鉴定针对任何疾病或病况的生物标志物(图2)。该工具具有四个主要阶段：生物学阶段、技术阶段、表现阶段和验证阶段。
在生物学阶段，由可公开获得的数据汇编针对目标疾病的起始生物标志物候选物列表，所述可公开获得的数据包括科学文献、数据库和会议时的展示。随后基于生物学相关性、计算机模拟分析、人类蛋白质图谱(HumanProteinAtlas)的审查和必需单克隆抗体的商业可用性，将生物标志物列表区分优先次序。生物学相关性审查基于其在细胞且特别是疾病中的作用机制。计算机模拟分析基于先前已知的基因扩增、缺失和突变，以及在这些遗传改变和疾病之间的单变量表现或进展关联。人类蛋白质图谱提供了跨越疾病状态在各种组织中的蛋白质表达水平。基于它们是否以跨越健康和疾病状态的一系列表达水平表达，将生物标志物排序。
在技术阶段，从厂商获得商业抗体且测试其检测来自临床样品的标志物的能力。首先，使用常规3,3’-二氨基联苯胺(DAB)染色，在免疫组织化学测定法中测试抗体，以评估染色特异性和强度。因为DAB比免疫荧光染色更灵敏，所以重要的是鉴定通过DAB以足够强度检测的标志物也通过免疫荧光检测到。满足DAB标准的抗体和标志物随后通过免疫荧光(IF)进行评估，以测定特异性、信号强度和动态(即，表达范围)。满足IF标准的抗体和标志物前进至表现阶段。
在表现阶段，抗体在微型TMA上进行测试。针对表达和疾病状态之间的单变量关联评估表现。显示表达和疾病状态之间的单变量关联的抗体和标志物随后在更大型的TMA队列上评估单变量关联和与其它标志物组合的表现。前导生物标志物组合随后使用临床验证队列进行验证。
实施例3：前列腺癌生物标志物的选择
使用实施例2中所述的生物标志物选择工具，如图3中所示测试且选择用于鉴定无痛感和侵袭性前列腺癌的生物标志物。
A.生物学阶段
基于前列腺癌文献的审查汇编初始靶候选物列表，以鉴定与小鼠模型中的前列腺癌关联的标志物、格里森分级特异性表达、进展关联、前列腺癌中的生物学作用和/或已知的前列腺癌标志物。因为所鉴定的标志物中的几种是一种或多种信号传导途径的部分，所以这些信号传导途径的其它成员包括在初始候选物列表中。总共160种潜在标志物包括在初始候选物靶列表中。
基于生物学相关性、计算机模拟分析、人类蛋白质图谱(在www.proteinatlas.org/处可获得)和抗体可用性，将初始靶列表区分优先次序。在评估生物学相关性中，癌基因和肿瘤抑制基因视为对于预后较不重要，因为它们不太可能与肿瘤分级相关。类似地，将在计算机模拟分析中用单变量表现和进展关联鉴定的基因区分优先次序。然而，在前列腺癌中，基因和蛋白质表达之间的关联很弱。因此，最优先次序的前列腺癌标志物基于人类蛋白质图谱，其显示在46种不同的正常人组织和20种不同的癌症类型以及47种不同的人细胞系中的蛋白质的空间分布。特别地，将其表达水平在各种肿瘤中改变的蛋白质区分优先次序，因为它们的表达水平可能与肿瘤分期更紧密关联。在这些分析后，将约120种区分优先次序的候选物列表移动到技术验证阶段。
B.技术阶段
针对120种区分优先次序的候选物的抗体得自商业厂商，并且通过免疫组织化学验证。使用标准DAB方案与通用聚合DAB检测试剂盒(ThermoFisher)，将来自各种良性和癌性前列腺FFPE组织样品的切片用候选物抗体染色。大致一半的测试抗体证实具有强烈强度的特异性染色模式，并且因此选择用于通过免疫荧光评估。
使用下文描述的免疫荧光方案与对照细胞系TMA，将来自各种良性和癌性前列腺FFPE组织样品的切片用候选物抗体染色。选择证实特异性染色模式的抗体用于进一步研究。
前列腺癌通常为表达上皮标志物例如细胞角蛋白8(CK8或KRT8)和细胞角蛋白18(CK18或KRT18)，同时不表达前列腺基底标志物例如细胞角蛋白5(CK5或KRT5)的癌。我们还已惊讶地发现TRIM29(一些其它癌症的肿瘤标志物)是前列腺组织中的基底标志物，而不是肿瘤标志物；因此，抗TRIM29抗体也可以用于前列腺肿瘤面具中。我们使用抗CK5、抗CK8、抗CK18和抗TRIM29抗体的混合物来评估肿瘤切片，其中前列腺肿瘤区域定义为由抗CK8和抗CK18抗体结合，且不由抗CK5和抗TRIM29抗体结合的前列腺组织区域。
从细胞系对照TMA块中切割五μm切片，且置于HISTOGRIP(LifeTechnologies)包被的载玻片上。将载玻片在65℃下烘烤30分钟，通过在二甲苯中的连续温育去石蜡，并且通过一系列梯度醇再水合。抗原修复在0.05％柠檬酸酐溶液中在pH7.4下在95℃下进行40分钟。
使用LabVisionAutostainer完成免疫荧光染色，其中所有温育均在室温下，所有洗涤均使用TBS-T(TBS+0.05％Tween20)，并且所有抗体均用TBS-T+0.1％BSA溶液稀释。载玻片首先用BiotinBlock(LifeTechnologies)溶液A封闭20分钟，洗涤，随后用溶液B封闭20分钟，洗涤，并且随后用BackgroundSniper(BiocareMedical)封闭20分钟且再次洗涤。应用小鼠或兔一抗且温育1小时。在一些情况下，将针对第一生物标志物的小鼠一抗和针对第二生物标志物的兔一抗应用于载玻片，且温育1小时。
在充分洗涤后，施加生物素缀合的抗小鼠IgG或FITC缀合的抗兔IgG进行45分钟。在其中两种生物标志物在相同载玻片上进行检测的情况下，施加生物素缀合的抗小鼠IgG和FITC缀合的抗兔IgG进行45分钟。在充分洗涤后，施加Alexa荧光团缀合的试剂的混合物，其由链霉抗生物素蛋白-Alexa633、抗FITCmAb-Alexa568和肿瘤面具混合物(抗细胞角蛋白8mAbAlexa488、抗细胞角蛋白18mAbAlexa488、抗细胞角蛋白5mAbAlexa555、抗TRIM29mAbAlexa555)组成。
为了允许前列腺癌肿瘤样品的自动化图像分析，我们利用针对前列腺上皮和基底标志物的抗体组合(肿瘤面具)以及基于DefiniensDeveloperXD(下文描述的)的对象识别。肿瘤区域定义为缺乏基底标志物的前列腺上皮结构。Alexa488缀合的抗细胞角蛋白8和抗细胞角蛋白18特异性小鼠mAb的混合物用于获得上皮特异性染色。基底细胞的染色基于Alexa555缀合的抗细胞角蛋白5和抗TRIM29特异性mAb的混合物。使载玻片与这些Alexa荧光团缀合的试剂一起温育1小时。在充分洗涤后，将DAPI溶液(在TBS-T中100ng/mlDAPI)施加3分钟。在几次洗涤后，将载玻片固定在ProlongGold抗褪色试剂(LifeTechnologies)中。使载玻片在-20℃下在黑暗中静置过夜以“固化”，并且在黑暗中在-20℃下长期贮存以使褪色降到最低。评估针对每种标志物的免疫荧光的量。例如图4显示针对在对照细胞系TMA的两个不同切片(切片27和41)上的两种不同标志物(FUS和DERL1)的定量免疫荧光。对于切片27中的每种细胞系检测到的免疫荧光的量在x轴上展示，而对于切片41中的每种细胞系检测到的免疫荧光的量在y轴上展示。两种细胞系中的免疫荧光的量的线性关系和高R2值证实在实验间的定量免疫荧光测定法的重现性。
接下来，我们测试标志物表达的范围。对于在我们的染色测定法中的标志物抗体的优化稀释和对于重现性，我们制备了“滴定”TMA。我们选择具有一系列格里森得分的40个前列腺癌样品FFPE块。随后，使用上文描述的经修饰的琼脂糖块程序利用来自每种供体样品的一式两份核心生成“滴定”TMA。执行用单一标志物以及肿瘤区域识别抗细胞角蛋白8、抗细胞角蛋白18、抗细胞角蛋白5和抗TRIM29抗体的免疫荧光染色。如上所述，对于小鼠单克隆候选物抗体的检测，我们使用抗小鼠生物素二抗和链霉抗生物素蛋白-Alexa633三抗。对于兔单克隆候选物抗体，使用抗兔FITC二抗和抗FITCmAb-Alexa568三抗。如下所述用Vectra系统捕获图像，并且使用Inform1.3软件定量标志物表达。基于标志物特异性、信号强度和标志物的动态范围，62种验证的候选物前进至表现阶段。
C.表现阶段
微型队列筛选
62种验证的候选物在微型TMA上进行测试，所述微型TMA如实施例1中所述进行制备。如上文技术阶段中所述，使用小鼠和兔一抗执行定量免疫荧光测定法。定量62种生物标志物，并且在约40个无痛感肿瘤样品和约40个侵袭性肿瘤样品之间测定表达水平中的差异。在62种标志物中，33种显示针对与无痛感或侵袭性肿瘤状态的关联的单变量表现。
使用高和低观察格里森TMA(HLTMA)，在扩展的活组织检查模拟研究中测试33种单变量表现标志物。因为对于在高和低TMA上的每个核心观察到的格里森得分可不同于核心来源于其的肿瘤的实际格里森得分(基于整个手术摘除的肿瘤)，可能的是鉴定不依赖于样品在肿瘤中的位置而预测真正格里森得分并且因此预测侵袭性的生物标志物。换言之，我们希望鉴定使通过肿瘤内的异质性引起的取样偏差降到最低的生物标志物。例如，无痛感、中间型和侵袭性肿瘤各自在低观察TMA上表示(针对在低观察TMA上的核心的实际格里森得分的概括，参见例如图5)。
对于在微型TMA实验中的33种具有单变量表现的生物标志物，如上文技术阶段中所述，使用小鼠和兔一抗执行定量免疫荧光测定法。由于HLTMA免疫染色和检测过程中的技术困难，弃去两种标志物。因此，对于在微型TMA实验中具有单变量表现的31种生物标志物获得且分析数据。
D.图像采集
两种Vectra智能载玻片分析系统(PerkinElmer)用于定量多路免疫荧光(QMIF)图像采集。根据制造商的说明书，伴随较小修改，运行TMA采集方案。对于所有载玻片使用相同的暴露时间。为了使TMA间变异性降到最低，在相同Vectra显微镜上加工用相同抗体组合染色的TMA载玻片。
DAPI、FITC、TRITC和Cy5长通发射过滤器立方体得自Semrock。TRITC和Cy5过滤器立方体进行优化，以允许在Alexa555、Alexa568和Alexa633染料之间的最大光谱分离。DAPI、FITC、TRITC和Cy5长通发射过滤器立方体得自Semrock。TRITC和Cy5过滤器立方体进行优化，以允许在Alexa555、Alexa568和Alexa633染料之间的最大光谱分离。
DAPI条带获取用20nm步长完成。FITC、TRITC和Cy5条带获取用10nm步长完成。获得两个20X图像立方体/核心，伴随在DAPI、FITC、TRITC和Cy5条带中的图像的连续收集。根据制造商的说明书制备光谱文库，并且Inform1.4软件(PerkinElmer)用于将图像立方体解混成具有个别荧光团信号和自体荧光信号的浮动TIFF文件。对于自体荧光产生两个通道，一个用于一般组织自体荧光，并且另一个用于分散于前列腺组织的红细胞和亮颗粒。在图像解混后，用DefiniensDeveloper软件进一步分析TIFF文件集合。针对来自较小的“滴定”TMA的数据分析，Inform1.3软件(PerkinElmer)用于解混图像立方体，并且定量标志物表达。
为了测定在两个Vectra智能载玻片分析系统(PerkinElmer)之间是否存在任何仪器间变异，我们在两个机器上平行分析CTMA，用于检测Alexa-568、Alexa-633和Alexa-647。如图6中所示，两个系统在Alexa-647检测中相差小于2％，并且在Alexa-568检测中相差约7％。然而，Alexa-633的检测在两个机器之间约20％不同。使用这些数据，我们能够确定针对每个通道的仪器间转换因子。
E.图像分析
使用DefiniensDeveloperXDTM(Definiens，Inc.，Parsippany，NJ)生成完全自动化的图像分析算法，用于肿瘤鉴定和生物标志物定量(参见例如图7)。对于每个组织微阵列(TMA)核心，获取两个20X1.0mm图像视野。使用inForm将Vectra多光谱图像文件首先转换成多层TIFF形式，并且随后使用BioFormats转换为单层TIFF文件。使用定制输入算法，将单层TIFF文件输入到Definiens工作空间内。根据制造商的说明书，对于每个TMA核心，将两个图像视野TIFF文件作为“地图”装载到单个“场景(scene)”内。
在我们的图像分析算法中内置自适应阈值用于限定针对每个个别组织样品中的组织区段的荧光截断。基于预定义的核心位置，自动鉴定细胞系对照。使用荧光上皮和基底细胞标志物连同DAPI，将组织样品分段，用于分类成上皮细胞、基底细胞和间质，以及进一步区室化成细胞质和核。细胞系对照使用自发荧光通道进行分段。通过严格的多参数质量控制算法去除具有假象染色、不足够的上皮组织和失焦的视野(参见例如图8)。基于基底细胞和邻近上皮结构之间的相关特征结合对象相关特征例如腺厚度，将组织样品中的个别腺区域进一步分类为恶性或良性(参见例如图9)。
上皮标志物和DAPI强度在恶性和非恶性上皮区域中作为质量控制测量进行定量。基于预定亚细胞定位，生物标志物值在恶性组织细胞质、核或全细胞中独立地进行测量(参见例如图10)。恶性区室中的平均生物标志物像素强度在具有可接受的质量参数的地图之间求平均值，以获得针对每种组织样品和细胞系对照核心的单个值。
得自Definiens分析的数据输出用于生物信息学分析或临床实验室改进修正案实验室信息系统(LIS)分析。
F.数据分析
对于在微型TMA实验中具有单变量表现的31种生物标志物获得的平均生物标志物值就其与肿瘤侵袭性和致死率的关联进行检查。如上所述，无痛感、中间型和侵袭性肿瘤各自在高和低观察TMA两者上表示(针对在低观察TMA上的每个类别的分解，参见例如图5)。对于侵袭性研究，我们在四个不同样品集中使生物标志物表达与侵袭性关联：(1)具有观察到的格里森得分≤3+3的所有核心；(2)具有观察到的格里森得分≤3+4的所有核心，其中排除具有手术中间型格里森得分的核心；(3)具有观察到的格里森得分≤3+4的所有核心，其中具有手术中间型格里森得分的核心计数为侵袭性的；和(4)具有观察到的格里森得分≤3+4的所有核心，其中具有手术中间型格里森得分的核心计数为无痛感的(图11)。对于致死结果研究，我们在两个不同样品集中使生物标志物表达与致命侵袭性关联：(1)具有观察到的格里森得分≤3+4的所有核心；和(2)所有核心(图10)。使用T检验、Wilcoxson检验和置换检验，使生物标志物值在单变量基础上关联。在测试的31种生物标志物中，17种生物标志物证实在侵袭性和致死结果测定两者中的单变量表现(图11)。
我们接下来使用两种不同方法评估生物标志物组合是否与肿瘤侵袭性关联：(1)查看在侵袭性和致死结果测定两者中证实单变量表现的17种生物标志物的组合；和(2)在HLTMA分析中测试的所有31种生物标志物的组合的无偏分析(图12)。分析在选自17种单变量表现生物标志物的三至十种生物标志物的组合，并且分析来自31种生物标志物集合的三至五种生物标志物的组合。对于每种标志物组合，通过自举生成500个训练集(即随机放回取样)，并且获得相关测试集。通过对训练集的逻辑回归衍生的模型在相关测试集上进行测试。每轮获得训练和测试C统计量(即曲线下面积)以及训练Akaike信息准则(AIC)。对于所有三种统计量获得中值和95％置信区间。对于每种分析方法的单变量表现预选的组合中，针对肿瘤侵袭性的最高排序模型在表3中列出。
表3:17种单变量表现生物标志物的最高组合
如预期的，当数据基于训练数据或AIC分选时，各种组合与侵袭性的关联随着组合大小增加而增加。换言之，10成员组合比9成员组合对侵袭性更具预测性，等等。这是符合预期的，因为随着组合中的每个另外的成员，另外的自由度被添加至训练分析中。然而，当数据基于测试数据分选时，具有七个成员或六个成员的组合比具有八、九和十个成员的组合更有关联，因为当数据用更多自由度训练时，归纳测试数据变得更困难。因此，在一些情况下，六或七种生物标志物的组合在于临床测定法中预测肿瘤侵袭性中更有用。测定了每种生物标志物出现在针对每种AIC和测试数据的最高组合中的频率。对于通过AIC分选的3至10成员组合的最高1％中的最高生物标志物，参见图13；对于通过AIC分选的3至10成员组合的最高5％中的最高生物标志物，参见图14；以及对于通过AIC和测试C统计量数据分选的七成员组合的最高1％和最高5％中的最高生物标志物，参见图15。通过测试数据分选的七成员组合的最高5％呈现于表6中，其公开于2013年3月15日提交的美国临时申请号61/792,003中，所述美国临时申请的整个内容通过引用并入本文。
未对于每种分析方法的单变量表现进行预选的组合中的针对肿瘤侵袭性的最高排序模型在表4中列出。测定了每种生物标志物出现在针对每种AIC和测试数据的最高组合中的频率。对于生物标志物出现在通过AIC和测试数据分选的5成员组合的最高1％中的频率，参见图16。对于生物标志物出现在通过AIC和测试数据分选的5成员组合的最高5％中的频率，参见图17。图16和17的肥尾提示这些生物标志物中的许多是可互换的，并且可以提供很少的附加表现。
表4：31种HLTMA测试的生物标志物的最高组合
当所有上述数据组合时，可以鉴定在针对前列腺肿瘤侵袭性的所有选择方法中一致地出现的七种标志物的核心集合(即ACTN1、FUS、SMAD2、HOXB13、DERL1、RpS6和CoX6C)(参见图18中的最右列中具有100％或75％的标志物)。还可以容易地鉴定针对前列腺肿瘤侵袭性的七种标志物的第二集合(即YBX1、SMAD4、VDAC1、DCC、CUL2、PLAG1和PDSS2)(参见图18中的最右列中具有50％的标志物)。
我们还使用在侵袭性和致死结果测定两者中显示单变量表现的17种生物标志物的组合来评估生物标志物组合是否与致死结果关联的。通过逻辑回归分析选自17种单变量表现生物标志物的三至十种生物标志物的组合。通过C统计量、AIC和95％置信区间分析利用自举(即随机放回取样)和多轮交叉验证的训练/测试队列。对于每种分析方法的单变量表现预选的组合中的针对致死结果的最高排序模型在表5中列出。
表5：针对致死结果的最高组合
类似于上述肿瘤侵袭性模型，六或七种生物标志物的组合在于临床测定法中预测致死结果中可以是最有用的。对于致死结果分析，测定了每种生物标志物出现在针对每种AIC和测试数据的最高组合中的频率。对于通过AIC分选的3至10成员组合的最高1％中的最高生物标志物，参见图19；对于通过AIC分选的3至10成员组合的最高5％中的最高生物标志物，参见图20；以及对于通过AIC和测试数据分选的七成员组合的最高1％和最高5％中的最高生物标志物，参见图21。有趣的是，当比较图15和21时，8种生物标志物出现在针对肿瘤侵袭性和致死结果两者的最高12种生物标志物中。因此，可能的是选择在其预测肿瘤侵袭性和致死结果的能力中部分重叠的生物标志物集合(图22)。
实施例4：生物标志物组合的临床验证
使用上述实施例3中鉴定的最高生物标志物组合，我们设计了用于就肿瘤侵袭性评估临床肿瘤样品且验证我们的上述模型结果的测定法。图像采集硬件可以检测多至六个不同的荧光通道。因此，可能的是检测多至三种生物标志物(或预后决定因素，“PD”)以及两种肿瘤面具信号和核染剂(例如DAPI)，即三重染色。例如图23显示了针对三种生物标志物(HSD17B4、FUS和LATS2)、两种肿瘤面具信号(CK8+CK18-Alexa488和CK5+TRIM29-Alexa555)和核染色(DAPI)，来自单个载玻片的六种不同荧光信号的检测。例如，第一通道可以用于检测第一生物标志物(例如PD1)，其一抗缀合至FITC分子并且可以通过抗FITC-Alexa-568进行检测。第二通道可以用于检测第二生物标志物(例如PD2)，其一抗是可以使用缀合至生物素的抗兔Fab和缀合至Alexa-633的链霉抗生物素蛋白进行检测的兔抗体。第三通道可以用于检测第三生物标志物(例如PD3)，其一抗是可以用缀合至辣根过氧化物酶(HRP)的抗小鼠Fab和缀合至Alexa-647的抗HRP进行检测的小鼠抗体。第四通道可以用于检测癌的上皮标志物，例如细胞角蛋白8(CK8或KRT8)和细胞角蛋白18(CK18或KRT18)。例如，抗CK8-Alexa-488和抗CK18-Alexa-488的组合可以用于限定样品的肿瘤区域。第五通道可以用于检测基底上皮标志物，例如细胞角蛋白5(CK5或KRT5)和TRIM29。例如，抗CK5-Alexa-555和抗TRIM29-Alexa-555的组合可以用于限定样品的非肿瘤区域。第六通道可以用于检测细胞结构，例如用DAPI染色检测核。根据七种标志物的核心集合和七种标志物的第二集合，我们鉴定了适合于在4个载玻片的集合上三重染色的针对这些标志物的12种商购可得的抗体(参见图24)。
为了证实在三重染色中用多重抗体的染色不影响这些抗体的检测，我们比较了在肿瘤面具标志物的背景下单独地或存在针对另一种生物标志物(PD2)的抗体时进行的测定中，来自针对生物标志物(PD1)的抗体的信号。如图25中所示，针对第二生物标志物的抗体的添加对第一标志物的检测具有最低限度影响。使用这种分析，我们证实可以在每种生物标志物的检测的最低限度干扰的情况下使用图24中列出的标志物组合。
我们接下来获得前列腺癌肿瘤样品的两个队列：来自ClevelandClinic的350个肿瘤的队列和来自HarvardSchoolofPublicHealth的180个肿瘤的队列。我们从队列中的每个肿瘤样品中分离五个5μm连续切片。切片中的四个用于生物标志物检测，如图24中所述。第五个切片用于通过评估自体荧光来测定肿瘤样品的质量。两个通道就自体荧光进行评估，一个用于一般组织自体荧光(AFL)，并且另一个用于分散于前列腺组织的红细胞和亮颗粒(BAFL)。参见例如图23。
具体地，从石蜡包埋的肿瘤样品块中切割五μm切片，且置于Histogrip(LifeTechnologies)包被的载玻片上。将载玻片在65℃下烘烤30分钟，通过在二甲苯中的连续温育去石蜡，并且通过一系列梯度醇再水合。抗原修复在0.05％柠檬酸酐溶液中在pH7.4下在95℃下进行40分钟。
使用LabVisionAutostainer完成免疫荧光染色，其中所有温育均在室温下，所有洗涤均使用TBS-T(TBS+0.05％Tween20)，并且所有抗体均用TBS-T+0.1％BSA溶液稀释。载玻片首先用BiotinBlock(LifeTechnologies)溶液A封闭20分钟，洗涤，随后用溶液B封闭20分钟，洗涤，并且随后用BackgroundSniper(BiocareMedical)封闭20分钟且再次洗涤。施加FITC缀合的、小鼠和兔一抗(参见图23)的混合物且温育1小时。
在充分洗涤后，施加生物素缀合的抗兔IgG和HRP缀合的抗兔IgG45分钟。在充分洗涤后，施加Alexa荧光团缀合的试剂的混合物，其由链霉抗生物素蛋白-Alexa633、抗FITCmAb-Alexa568、抗HRPmAb-Alexa647和肿瘤面具混合物(抗细胞角蛋白8mAbAlexa488、抗细胞角蛋白18mAbAlexa488、抗细胞角蛋白5mAbAlexa555、抗TRIM29mAbAlexa555)组成。如上所述，我们利用针对前列腺上皮和基底标志物的抗体组合(肿瘤面具)以及基于DefiniensDeveloperXD的对象识别，以允许前列腺癌肿瘤组织的自动化图像分析。肿瘤区域定义为缺乏基底标志物的前列腺上皮结构。Alexa488缀合的抗细胞角蛋白8和抗细胞角蛋白18特异性小鼠mAb的混合物用于获得上皮特异性染色。基底细胞的染色基于Alexa555缀合的抗细胞角蛋白5和抗TRIM29特异性mAb的混合物。使载玻片与这些Alexa荧光团缀合的试剂一起温育1小时。在充分洗涤后，施加DAPI溶液(在TBS-T中100ng/mlDAPI)3分钟。在几次洗涤后，将载玻片固定在ProlongGold抗褪色试剂(LifeTechnologies)中。使载玻片在-20℃下在黑暗中静置过夜以“固化”，并且在黑暗中在-20℃下长期贮存以使褪色降到最低。如实施例3中所述采集且分析图像。
实施例5：自动化定量多路蛋白质组学原位成像平台的开发和在 预测前列腺癌致死结果中的应用
概述
基于基因的癌症预后方法中已存在显著进展，有希望对于高风险患者早期干预和避免对于低风险患者的过度治疗。在蛋白质组学方法中存在较小进展，尽管扰乱的蛋白质水平和翻译后修饰与表型更直接联系。大多数目前的、基于基因表达的平台需要组织裂解，导致结构分子信息的丧失，并且因此对肿瘤异质性和形态特征不知情。此处呈现的是自动化、整合的多路蛋白质组学原位成像平台，其定量测量在限定的其中目标生物标志物产生其表型的完整组织区域中的蛋白质生物标志物水平和活性状态。作为概念证据，证实四种先前报道的预后标志物PTEN、SMAD4、CCND1和SPP1可以预测人前列腺癌的致死结果。此外，通过证实PTEN可以替换为两种PI3K途径调节的蛋白质活性，显示基于机制的蛋白质表达能力。总之，该平台可以重现性且同时地定量且评价癌基因和肿瘤抑制基因在完整组织中的多重功能活性。该平台可广泛应用且充分适合于在疾病早期时的预后，在疾病早期中关键信号传导蛋白质水平和活性被扰乱。
引言
虽然针对复发性、经验证的基因突变的测试具有极大的预后和预测价值1-5，但这些突变在早期癌症中是相对罕见的。多变量的基于基因的测试需要具有肿瘤和良性组织的可变比的均质化组织，导致较不准确的生物标志物测量6,7。在这些类型的测试中，表型必须由基因和突变模式推断。相比之下，蛋白质水平和翻译后修饰的直接原位测量应更直接反映癌基因信号传导途径的状态。因此，预期基于蛋白质的方法对于预后有价值是合理的。
其它问题使预后测试复杂化。在前列腺癌中，肿瘤异质性是显著的，并且取样误差可以促成不正确的预测。格里森分级和肿瘤分期的病理学家不一致也致使这种多病灶疾病的预后变得困难。为了解决这些缺点，我们开发了用于完整组织的自动化定量多路蛋白质组学成像平台，其整合来自在个别载玻片水平下限定的相关组织区域的形态学对象识别和分子生物标志物测量。这种系统用于使用四种先前报道的标志物PTEN、SMAD4、CCND1和SPP18来从根治性前列腺切除术组织预测致死结果。重要的是，此处还证实反映PI3K/AKT和MAPK信号传导状态的蛋白质活性状态的定量测量可以取代PTEN，所述PTEN是经高度验证的前列腺标志物，其本身调节PI3K/AKT途径信号传导9-13。总之这些数据鉴定了新型致死结果预测标志：SMAD4、CCND1、SPP1、磷酸-PRAS40(pPRAS40)-T246和磷酸-核糖体S6(pS6)-S235/236。
材料与方法
试剂和抗体
如表7中所述，本研究中使用的所有抗体和试剂均获自商购可得来源。根据制造商的说明书(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)，通过内部使用适当的蛋白质缀合试剂盒，使抗FITCMAb-Alexa568、抗CK8-Alexa488、抗CK18-Alexa488、抗CK5-Alexa555和抗Trim29-Alexa555与Alexa染料缀合。
表7：抗体
福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的前列腺癌组织块的获取、加工和质量控制
我们从FolioBiosciences(Powell，OH)获取了具有临床注释和长期患者结果信息的FFPE人前列腺癌组织块队列。样品在适当的IRB批准下收集，并且将所有患者记录去识别化。我们纳入了来自其它商业来源(BioOptions，Brea，CA；Cureline，So.SanFrancisco，CA；ILSBio，Chestertown，MD；OriGene，Rockville，MD)的多个FFPE人前列腺癌组织块，以验证个别抗体和组合的多路染色形式染色强度，开发质量控制程序，评价实验内重现性研究，以及证实染色对前列腺肿瘤组织的特异性。
由每个FFPE块产生10-12个切片(5μm切割)。最后一个切片用苏木精和伊红(H&E)染色，并且用Aperio(Vista，CA)XT系统扫描。H&E染色的图像保藏于Spectrum数据库(Aperio，Vista，CA)用于远程审查，并且使用ImageScope软件(Aperio，Vista，CA)，通过专家委员会认证的解剖病理学家以不知情方式集中格里森注释。通过使用目前标准14，将对应于1mm核心的注释圆圈置于每个前列腺切除术样品上最高格里森模式的四个区域和最低格里森模式的两个区域上。
组织质量控制程序
如下所述，用抗磷酸STAT3T705兔单克隆抗体(mAb)、抗STAT3小鼠mAb和目标区域标志物染色来自每个FFPE块的5μm切片。在荧光显微镜下检查载玻片。如表8和图27E中所示，基于染色强度和自体荧光，将组织定性地分级成四个类别。包括属于最高两个质量类别的FFPE块用于研究。
表8：组织分级
定义：
高-亮荧光染色。对于CK8和18一致
低-几乎看不到染色，部分地处于本底水平
不存在-未观察到染色
细胞系对照
待用作阳性和阴性对照的所选细胞系在标准条件下生长，并且如所示的在收获前用药物和抑制剂处理(表10)。将细胞用PBS洗涤，用10％福尔马林直接在板上固定5分钟，随后刮取且收集到PBS中。接下来，将细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤两次，在70℃重悬浮于的Histogel(ThermoScientific，Waltham，MA)，并且旋转5分钟(10,000g)，以形成浓缩的细胞-Histogel沉淀物。将沉淀物包埋在石蜡中，置于标准石蜡块内，并且用作组织微阵列构建的供体块。
肿瘤微阵列(TMA)块的生成
使用经修饰的琼脂糖块程序15制备TMA块。简言之，将0.7％琼脂糖块包埋到石蜡内，并且用作TMA受体块。使用TMAMaster(3DHistech，Budapest，Hungary)仪器，从对应于根据病理学家注释的最高格里森模式的区域，在供体块内钻取两个1mm核心。将这些核心之一置于一个受体块的随机化位置中，而第二受体块中的另一核心的位置相对于第一核心是随机化的。这用91、170和157种经注释的前列腺肿瘤样品重复(表9)，以分别形成3对TMA块(MPTMAF1A和1B、2A和2B、3A和3B)。所得到的配对块在患者样品组成方面是相同的，但在样品位置方面是随机化的。将细胞系对照核心加入这些受体块的顶部、中间和底部部分。装载后，将TMA块面朝下置于以65℃的载玻片上15分钟，以允许TMA核心融合到主体石蜡内。随后将石蜡块切割成5μm连续切片。从商购可得的仅具有有限(格里森得分)注释的FFPE前列腺肿瘤病例生成较小型的测试TMA。这种TMA用于在主要队列研究之前比较PTEN值与磷酸标志物以及证实重现性。重现性通过比较在测试TMA的连续切片上的个别标志物信号加以证实(表9和图27F)。
表9：TMA地图
MPTMAF1a块
MPTMAF1B块
MPTMAF2A块
MPTMAF2B块
MPTMAF3A块
MPTMAF3B块
MPTMA1块
载玻片加工和定量多路免疫荧光(QMIF)染色方案
TMA切片以5um厚度切割，并且置于Histogrip(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)包被的载玻片上。将载玻片在65℃下烘烤30分钟，通过在二甲苯中的连续温育去石蜡，并且通过一系列梯度醇再水合。抗原修复在0.05％柠檬酸酐溶液中使用PT模块(ThermoScientific，Waltham，MA)在95℃下进行45分钟。Autostainers360和720(ThermoScientific，Waltham，MA)用于染色。
染色程序涉及两个封闭步骤，随后为四个温育步骤，伴随在两者之间的适当洗涤。封闭由生物素步骤随后Sniper试剂(BiocareMedical，Concord，CA)组成。第一温育步骤包括抗生物标志物1小鼠mAb和抗生物标志物2兔mAb。第二步骤包括抗兔IgGFab-FITC和抗小鼠IgGFab-生物素，随后为第三“显现”步骤，其包括抗FITCMAb-Alexa568、链霉抗生物素蛋白-Alexa633和荧光团缀合的目标区域抗体(抗CK8-Alexa488，抗CK18-Alexa488，抗CK5-Alexa555和抗Trim29-Alexa555)。最后，使切片与DAPI一起温育用于核染色(对于染色形式概括，参见图27B)。将载玻片用ProlongGold(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)固定，并且盖上盖玻片。在成像前将载玻片在-20℃下保持过夜且用于长期贮存。针对涵盖测试的所有生物标志物的各种抗体组合在单个染色期间中对6个MPTMAF载玻片的完全集合染色。
抗体验证
在敲低前后通过蛋白质印迹测试：为了测试mAb针对PTEN、SMAD4和CCND1的特异性，我们采用目标蛋白质标志物的可诱导shRNA敲低。简言之，通过用携带pTRIPZ(ThermoScientific，Waltham，MA)的病毒转导幼稚DU145细胞来生成具有可诱导shRNA的DU145细胞。细胞使用2μg/ml嘌呤霉素稳定选择一周。随后，将细胞用0.1μg/ml或2μg/ml多西环素诱导72小时。使细胞受胰蛋白酶作用并且加工用于RNA提取或细胞裂解物生成。针对每种蛋白质标志物的最佳shRNA首先通过RT-PCR随后通过蛋白质印迹加以证实。当在蛋白质印迹上的预期分子条带大小在shRNA诱导后减少时，抗体视为特异性的。为了测试针对SPP1的mAb，我们使用具有高或低SPP表达的细胞系。来自这些细胞系(如图30中所示)的裂解物也用于蛋白质印迹。为了测试针对AKT信号传导途径的成员的抗磷酸抗体，使DU145细胞血清饥饿过夜，用PI3K抑制剂LY294002以10μM处理2小时，并且裂解。来自用抑制剂处理的细胞的裂解物用作用于蛋白质印迹的阴性对照；来自在标准条件下生长的细胞的裂解物用作阳性对照。
20μg细胞裂解物在4-15％CriterionTGX预制凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)上运行。其后，使用iBlot(LifeTechnologies，GrandIsland，NY)将凝胶转移到硝酸纤维素膜上。一抗稀释根据产品数据单推荐使用。使用SuperSignalWestFemtoMaximumSensitivitySubstrate(ThermoScientific，Waltham，MA)使膜显色。使用FluroChemQ系统(ProteinSimple，SantaClara，CA)捕获图像。图像使用AlphaView(ProteinSimple，SantaClara，CA)和ImageJ16进行处理。
在靶敲低前后通过免疫组织化学测试：来自如上所述处理的细胞系的FFPE细胞沉淀物在TMA块中集合到一起。切割5μm切片，并且在60℃下干燥一小时，随后在三次二甲苯更换中去石蜡并在一系列浓度递减乙醇洗涤中再水合。使载玻片在0.05％柠檬酸酐(Sigma，SaintLouis，MO)中在95℃下加热40分钟用于抗原修复。根据制造商的说明书，使用LabVisionTMUltraVisionTMLPDetectionSystem：HRPPolymer/DABPlusChromogenKit(ThermoScientific，Waltham，MA)染色载玻片。将载玻片用AperioScanscopeATTurbo系统(Aperio，Vista，CA)扫描。用AperioImageScope软件(Aperio，Vista，CA)分析图像。
图像采集
两个Vectra智能载玻片分析系统(Perkin-Elmer，Waltham，MA)用于自动化图像采集。DAPI、FITC、TRITC和Cy5长通发射过滤器立方体进行优化以允许最大光谱分辨率且使在荧光团之间的交叉干扰降到最低。Vectra2.0和Nuance2.0软件包(PerkinElmer，Waltham，MA)分别用于自动化图像采集和光谱文库的开发。
根据制造商说明书(Perkin-Elmer，Waltham，MA)，以自动化模式运行TMA采集方案。使用多光谱采集方案使两个20X视野/核心成像，其包括使用DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器的连续曝光。为了确保生物标志物定量的重现性，在针对每个TMA载玻片的图像采集之前，用X-CiteOpticalPowerMeasurementSystem(LumenDynamics，Mississauga，ON，Canada)校准光源强度。相同的曝光时间用于含有相同抗体组合的所有载玻片。为了使实验内变异性降到最低，使用相同抗体组合染色的TMA载玻片在相同Vectra显微镜上成像。
对于每种荧光染料以及FFPE前列腺组织自体荧光生成光谱特征谱。有趣的是，在FFPE前列腺组织中观察到两类自体荧光。典型的自体荧光信号在良性和肿瘤组织两者中是共同的，而非典型“亮”自体荧光对于主要在良性组织的上皮细胞中存在的亮颗粒是特异性的。含有这两种光谱特征谱的组合的光谱文库用于使个别染料信号与自体荧光本底分离或“解混”(图27A和图27C)。
图像分析
我们使用DefiniensDeveloperXD(DefiniensAG，Munich，德国)开发了自动化的图像分析算法，用于肿瘤鉴定和生物标志物定量。对于每个1.0mmTMA核心，获取两个20X图像视野。使用inForm(PerkinElmer，Waltham，MA)和定制的光谱文库，将Vectra多光谱图像文件首先转换成多层TIFF形式，随后使用BioFormats(OME17)转换为单层TIFF文件。使用定制输入算法，将单层TIFF文件输入到Definiens工作空间内，使得对于每个TMA核心，将两个图像视野TIFF文件作为单个“场景”内的“地图”装载且分析。
自适应阈值用于限定针对每个个别组织样品中的组织区段的荧光强度截断。使用DAPI连同荧光上皮和基底细胞标志物，将组织样品分段，以允许分类为上皮细胞、基底细胞和间质，并且进一步区室化成细胞质和核。良性前列腺含有基底细胞和腔细胞，而前列腺癌腺缺乏基底细胞且具有更小的腔轮廓。因此，基于基底细胞和邻近上皮结构之间的相关特征结合对象相关特征例如腺大小，将个别腺区域分类为恶性或良性(参见图27D)。在评分前去除具有假象染色、不足够的上皮组织或失焦图像的视野。
上皮标志物和DAPI强度在良性和恶性上皮区域中定量作为质量控制测量。基于预定的亚细胞定位标准，生物标志物强度水平在细胞质、核或整个癌细胞中进行测量。癌区室中的平均生物标志物像素强度跨越具有可接受的质量参数的地图求平均值，以生成针对每种组织样品和细胞系对照核心的单个值。
患者队列组成
图28A描述了在目前研究中使用的FOLIO队列组成，并且包括与PHS队列8的比较。
标志物值测定
因为每个样品由两个核心表示，所以我们基于关联方向生成针对每种标志物的总分。对于与致死率正相关的标志物，我们使用具有最高值的核心；对于负相关的标志物，我们使用具有最低值的核心。例如，对于在所有染色切片上存在的肿瘤抑制子SMAD4，我们使用针对三个核心的最低核心值。
单变量分析
对于每种生物标志物训练单变量cox模型。对于每种标志物，计算危害比和对数秩p值，以比较由针对正相关标志物的风险得分的最高三分之一和最低三分之二组成的群体，以及由针对负相关标志物的风险得分的最低三分之一和最高三分之二组成的群体(图28B和C)。
多变量分析
我们使用多变量分析来测定标志物集合预测致死结果的能力。我们利用了两种建模方法和两种度量。具体地，生成10,000个自举训练样品，并且对每种训练样品训练多变量Cox模型和逻辑回归模型两者。对补充集合执行测试。一致性指数(CI)和曲线下面积(AUC)用于估计模型表现。生成卡普兰-迈耶曲线，以比较具有风险得分的最低三分之二的群体与具有风险得分的最高三分之一的群体。基于来自逻辑回归模型的风险得分，对于整个队列生成接受者操作特征(ROC)曲线。在我们的模型中测试的标志物组合如下：1)PTEN、SMAD4、CCND1和SPP1，和2)SMAD4、CCND1、SPP1、以及下述磷酸标志物组合之一：pS6、pPRAS40和pS6+pPRAS40。图31呈现了多变量分析方法的概括。
结果
平台开发
开发自动化多路蛋白质组学成像平台需要满足许多技术要求：1)定量限定目标区域中(即肿瘤相对于周围良性组织中)的多重标志物的能力，2)严格的组织质量控制，3)平衡的多路测定染色形式，和4)实验重现性。
为了解决第一点，我们优化长通DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器集合，以具有足够的激发能量和发射带通，伴随在通道之间的最低限度干扰。我们进一步通过图像的光谱解混使生物标志物信号与内源自体荧光分离(图27A；18)。为了仅定量测量肿瘤上皮中的生物标志物，我们需要实现“组织分段”，从而区分肿瘤与良性区域。使用特征抽取和蛋白质共定位算法的组合实现分段。使用Alexa488缀合的抗CK8和CK18抗体染色总上皮，而Alexa555缀合的抗CK5和Trim29抗体染色基底上皮19，20。使用自动化Definiens(Munich、德国)图像分析，具有基底细胞外层的上皮结构视为良性的，而缺乏基底细胞的那些视为癌症20。非上皮区域视为间质。最终，定量的生物标志物值仅从癌症上皮(‘目标区域’；图27B-D)中提取。
为了评估用于研究包括的组织样品质量，我们评价几种蛋白质标志物在良性组织中的染色强度。可变质量的大量前列腺组织块的检查揭示：分别在良性上皮区域和毛细血管内皮中的细胞角蛋白8和18以及pSTAT3强度，从‘高’到‘低’或‘不存在’不等(数据未显示；MassimoLoda，个人通信)。在这个基础上，我们将福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的前列腺癌组织块分类成四个质量组(图27E和表8)。仅来自最佳两个组的块用于生成肿瘤微阵列块(TMA)，从而控制因分析前变异引起的生物样本降解和变异性21-23。总之，我们取得且测试了其致死结果注释可获得的508个独特的前列腺切除术样品(FolioBiosciences，Powell，OH)。在这些中，418个通过质量测试且用于我们的TMA(表10)。
表10：细胞系对照
为了平衡我们的多路测定法形式中的生物标志物信号水平，将具有高表达水平的蛋白质，如细胞角蛋白和Trim29用直接缀合的抗体显现，而具有较低表达水平的生物标志物需要通过使用二抗和三抗的信号放大。通过使用含有低和高级别肿瘤材料的测试前列腺TMA，每种抗体的稀释度进行优化以使本底降到最低且使特异性达到最大，并且确保在低和高信号值之间至少3倍差异的动态范围(图28B)。来自连续TMA切片的信号显示具有超过0.9的典型R2关联值的高重现性和在绝对值中通常小于10％的差异(图28B和未显示的数据)。
预测致死结果的能力
我们使用在由Ding等人8公开的近期研究中报道的四蛋白质标志来测试平台。通过使用包含来源于Physician’sHealthStudy(PHS)的405个病例的TMA，该作者已证实基于半定量、病理学家评估的PTEN、SMAD4、CCND1和SPP1蛋白质水平的多变量模型可以预测致死结果。我们询问我们是否可以通过使用我们的自动化平台代替病理学家评估独立的前列腺切除术队列中的蛋白质水平来预测致死结果。在我们的TMA中的418个合格病例中，340个被发现可用于分析，损耗主要是由于在切片过程中移位的核心而引起(对于队列描述和与PHS队列的比较，参见图28A)。从每种样品中提取定量的肿瘤上皮生物标志物上皮，并且对值实施单变量分析。PTEN、SMAD4和CCND1均被发现是独立致死结果预测性的，分别具有2.74、2.48和1.99的危害比(HR)，而SPP1不具有显著的预测表现(图28B)。
接下来，进行多变量Cox和逻辑回归分析。四标志物模型的表现测定为曲线下面积(AUC)和一致性指数(CI)(分别为图29A和表11)。对于逻辑回归分析，病例定义为死于前列腺癌的患者。AUC对于训练模式中的四种标志物为大约0.75，并且通过逻辑回归和Cox分析在测试模式中分别为0.69-0.70(图29A)。通过对整个队列训练的Cox模型生成基于四种标志物比较风险得分的最高三分之一与最低三分之二的卡普兰-迈耶曲线。这个曲线显示风险组之间的明显存活差异(图29B)。图29B呈现了我们的结果和PHS研究的结果之间的比较。我们的0.75的平均AUC[95％置信区间(0.67，0.83)]与0.83的PHS平均AUC[95％置信区间(0.76，0.91)]的表现是可比较的。注意到置信区间中的大量重叠。
表11：一致性指数
作为多变量标志的部分掺入的蛋白质活性状态
因为蛋白质活性状态反映肿瘤中与侵袭性行为相关的功能事件，所以我们测试我们的平台是否可以不仅定量测量蛋白质水平，还定量测量如通过翻译后修饰或改变的亚细胞定位反映的蛋白质活性状态。磷酸化是翻译后修饰的特别充分研究的例子；在特定位点处的蛋白质磷酸化的化学计量学是亲本信号传导途径的活性状态的间接测量24， 25。具体地，我们检查核心PTEN调节的信号传导途径PI3K/Akt和MAPK中的一种或多种信号传导分子的活性状态是否可以取代四标志物模型中的PTEN。与PI3K/AKT途径相对地，PTEN蛋白质仅在前列腺癌的子集中改变11，26，因此我们的目标是鉴定可以更广泛提供关于PI3K/Akt途径活性状态的信息的替代磷酸标志物26，27。为此，我们获得许多针对关键磷蛋白的磷酸特异性单克隆抗体(P-mAb)，并且就技术适合性测试它们(表7)。测试包括通过细胞系中的敲低的特异性分析、人前列腺癌组织中的信号强度以及重要地，基于前列腺癌FFPE样品间的信号保存的表位稳定性23，27(图30和未显示的数据)。我们纳入磷酸标志物是因为PI3K/AKT途径活性通常不依赖于PTEN蛋白质状态12，13。基于这些标准，选择下述磷酸特异性抗体且测试单变量和多变量致死结果预测表现：p90RSK-T359/S363、pPRAS40-T246、pS6-S235/236和pGSK3-S21/9(CellSignalingTechnology，Danvers，MA；27)。我们还选择抗Foxo3A抗体用于测试，因为当PI3K途径活化时，它从核中排出28。对标志物实施卡普兰-迈耶图中的单变量分析。当比较最高三分之一与最低三分之二的信号值时，pPRAS40和pS6具有显著的单变量表现，HR为约2(图28C)。
我们随后检查不含PTEN的四种原始标志物的表现(图29A)。AUC(训练)从0.75降至0.72-0.73。pS6(基本上用pS6取代PTEN)的添加使CI和AUC分别增至0.75和0.76，而用pPRAS40取代不导致AUC和CI的显著增加(数据未显示)。最后，用pS6和pPRAS40两者取代PTEN使AUC(训练)值增至～0.76和～0.77(图29A)。针对三种标志物连同pS6+pPRAS40的相应卡普兰-迈耶曲线显示于图29B中。这些结果证实我们可以成功地用两种磷酸标志物pS6和pPRAS40替换PTEN(已知的致死结果预测标志物)，同时维持预测致死结果的能力。
讨论
这项工作建立了自动化成像平台，其准确地且重现性整合形态和蛋白质组学信息。我们通过使用据报道预测致死结果的相同的4种标志物，通过与先前研究的直接比较来评价平台表现。两个研究的简单元分析估计在平均AUC中0.08的不显著差异[95％置信区间(-0.03，0.19)]。表现中的差异可能是由于两个研究之间的方法差异。首先，我们使用在蛋白质印迹和免疫组织化学中通过siRNA寡核苷酸介导的敲低就特异性验证的单克隆抗体(图30)，而PHS研究中使用的两种抗体是多克隆的，并因此对于持续的应用前景不是理想的。此外，本研究中的定量测量是完全自动化的，而PHS研究依赖病理学家解释并因此总体上预期会是较不可重现的。最后，我们的队列包括更高比例的格里森≤6病例，其致死结果比较高级别病例更难以预测，并且致死结果预测进一步受限于11.92年的随访中值，这不够长以捕获所有死亡。考虑到这些方法区别以及AUC中差异的评价，我们的结果是可比较的，证实了此完全自动化平台的有用性和不依赖于人为解释的预后。
在本文表征的实施方案中，通过组合Vectra多光谱图像分解与可编程的DefiniensTissueDeveloper，在肿瘤上皮区域中实现了强大的组织分段算法和定量生物标志物测量。本文提供的方法提供了自动化方法，其是高度灵敏的，无需主观干预操作，并且可以成功地评估极小量的癌症组织。
本发明的平台的重要应用是掺入蛋白质活化状态作为生物标志物的能力。此处证实测量核心PI3K和MAPK途径中的信号传导分子的活化状态的p-mAb可以取代PTEN(其是高度结果预测性标志物)。肿瘤抑制子PTEN仅在15-20％的早期前列腺癌中改变，并且通常通过各种其它机制功能失活，这会反映在改变的PI3K/Akt途径活性中12。不希望受理论束缚，可能的是PI3K/AKT途径活性状态测量在早期前列腺癌病损中比PTEN提供更多信息。我们此处显示了针对根治性前列腺切除术的新的五标志物标志的致死结果预测表现：SMAD4、CCND1、SPP1、pPRAS40和pS6。
总之，我们已用能够使用前列腺切除术组织预测致死结果而不依赖于病理学家解释的自动化、客观性的生物标志物测量来开发了多路蛋白质组学原位成像平台。重要的是，我们证实了将蛋白质活性状态的定量测量(如通过翻译后修饰反映的)掺入致死结果的多变量蛋白质预测物的能力。该平台可在疾病状态间广泛应用。特别地，我们已经将其应用于开发针对其中组织量通常是有限的早期病损的预后前列腺癌活组织检查测试。
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实施例6：尽管存在活组织检查取样误差，但仍预测前列腺癌侵 袭性的蛋白质组学生物标志物的鉴定和临床评价
概述
本研究描述了尽管存在取样误差但仍预测前列腺癌侵袭性和致死结果的完整组织蛋白质生物标志物的鉴定和临床评估。
前列腺癌侵袭性和适当疗法的确定基于临床病理学参数，包括活组织检查格里森分级和肿瘤牵涉程度、前列腺特异性抗原(PSA)水平和患者年龄。对于基于活组织检查格里森分级预测肿瘤侵袭性的关键挑战包括前列腺癌的异质性、活组织检查取样误差和活组织检查解释的变异。所导致的风险评价不确定性导致显著的过度治疗，伴随相关的成本和发病率。我们开发了基于表现的策略，以鉴定适于在尽管存在活组织检查取样变异的情况下仍更准确地反映真正的前列腺癌侵袭性的蛋白质生物标志物。来自具有长期随访的大型患者队列的具有病理学和致死结果注释的前列腺切除术样品通过专家病理学家不知情地进行评价，所述专家病理学家鉴定来自每个患者的具有最高和最低格里森级别的组织区域。为了模拟活组织检查取样误差，来自每个患者样品的高和低格里森区域的核心分别用于生成‘高’和‘低’肿瘤微阵列。使用定量原位蛋白质组学方法，我们从160种候选物中鉴定出大部分新型的12种生物标志物，其在高和低格里森区域中强力地预测前列腺癌侵袭性(手术格里森得分和病理学TNM分期)和致死结果。相反，先前报道的用于前列腺切除术组织的致死结果预测性标志物标志不能在最大取样误差的情况下执行。我们的工作对于一般的癌症生物标志物发现以及对于在活组织检查时预测前列腺癌病理学的临床测试，提供对活组织检查取样误差的抗性。
引言
前列腺癌占在美国男性中诊断的发病癌症的27％，并且美国癌症学会估计在全国范围内在2014年将作出233,000例新的前列腺癌诊断(1)。尽管由于前列腺癌的死亡威胁已由于较早检测和改善的治疗选择而显著下降(1)，但存在对于该常见癌症的过度诊断和过度治疗的担忧(2、3)。在所有新近诊断的前列腺癌病例中，七个中仅约一个将在其一生中进展至转移性疾病，而大约一半的新近诊断患有前列腺癌的男性具有局限性疾病，其具有极低的进展风险(1、4)。尽管这种低风险，但在美国多达90％的诊断有低风险前列腺癌的男性经历根治疗法，通常为根治性前列腺切除术或消融放射疗法(5)。对于不太可能变得临床上明显的疾病，此类治疗可能是过度的并且常常导致长期不利事件，包括尿失禁以及勃起和大肠机能障碍(2、6、7)。
用于前列腺癌的诊断和管理的目前指导和公认的护理标准推荐使用临床和病理学参数，对活组织检查评价疾病级别和分期(8、9)。通过针吸活组织检查获得的组织的病理学评估是证实前列腺癌诊断和给癌症分级两者所必需的。如通过活组织检查格里森得分(GS)测定的级别是重要的结果预测物，并且已视为对于指导管理决策提供最多信息。所有前列腺癌活组织检查的大约80–85％具有3+3＝6或3+4＝7的GS，代表具有低至中间至高进展风险的一系列病例(10)。视为具有无痛疾病的患者是主动监督的候选人(3、8、9)。然而，目前的活组织检查评估方法通常不能沿该系列将个别患者准确地放置(5、10)。
存在影响基于活组织检查的格里森评分的准确度的两种公认因素：一种是取样变异(即未能对具有最高格里森级别的区域取样)，第二种是格里森评分中的病理学家不一致(10-12)。尽管目前存在多核心活组织检查取样的标准实践，但肿瘤的最侵袭性区域通常代表不足或过度代表(11、13)。事实上，在前列腺切除术组织的分析和分级后，25–50％的前列腺癌病例需要从其初始活组织检查得分上调或下调级别至更准确的手术GS(10、14、15)。在格里森分级中在病理学家之间的不一致源自特别应用于小样品的格里森评分系统的主观方面。此类不一致增加确保一致和准确预后的困难，并且可以高达30％(16、17)。
已开发了几种临床和病理学风险分层系统以改善前列腺癌侵袭性的预测，包括D’Amico分类系统、前列腺癌风险评价(CAPRA)得分、和美国国家综合癌症网络(NCCN)指南(9、18-20)。所有这样的系统均将活组织检查GS识别为风险评价中的单个最有力的变量。GS包括两个格里森模式，其中首先指定更普遍的模式。将该两者总计以测定格里森得分。根据2005年格里森得分共识在活组织检查上，通常识别仅三个模式(3、4和5)(21)。公认的GS预后类别为3+3＝6、3+4＝7、4+3＝7、8和9–10。重要的是，尽管3+4＝7和4+3＝7具有等价的格里森总和，但基于更高量的模式4，后者具有显著更严重的预后(16、22)。重要的是，用于指导临床管理的所有风险分层系统均依赖有效和一致的格里森评分，并且因此易受取样变异和通过病理学家的不一致评分的影响。
增强的活组织检查策略已提议作为克服取样变异和误差的一种手段。在这些中，增加取样核心的数目或密度可能确保肿瘤组织的更代表性捕获。然而，收集的活组织检查样品数目增加至超过目前推荐的12个可以增加来自过度取样的不利事件风险，并且存在很少证据显示这改善病理学分类(23、24)。还存在对新型形式的图像引导的活组织检查的兴趣。目前，MRI引导的活组织检查看起来改善侵袭性癌症的检测，但需要长期研究来确定MRI是否可以改善用于主动监督(AS)的患者选择(25)。
通过使用定量多路蛋白质组学原位成像系统，其允许来自完整肿瘤上皮的准确生物标志物测量(26)，我们在此报道能够预测前列腺癌侵袭性(通过前列腺切除术(手术)格里森得分和病理学TNM分期定义)和致死结果的12种生物标志物的鉴定和评估。标志物被特异性选择为对取样误差是稳健的。该研究对前列腺切除术组织执行，并且涉及基于来自每个患者的高和低GS区域的芯吸的有偏活组织检查取样误差的模拟。通过使用这种方法，生物标志物基于其反映如通过前列腺切除术GS和病理分期测定的真正前列腺病理状态的能力进行选择，而与它们是在高还是低得分格里森区域中测量无关。除反映侵袭性病理学之外，还就其跨越异质性癌症的低和高级别区域预测前列腺癌特异性死亡率的能力，评估生物标志物候选物。这种基于表现的方法鉴定新型生物标志物，并且确认了预测前列腺癌侵袭性和致死结果的已知生物标志物。
结果
活组织检查模拟
开发活组织检查取样模型，以模拟且扩大在临床实践中观察到的活组织检查样品变异。为了这个目的，我们将来自注释前列腺切除术组织的核心包埋到组织微阵列(TMA)内。基于通过专家泌尿科病理学家的集中格里森分级，对于每个患者从具有最小侵袭性肿瘤(低GS)的区域中取得核心且包埋在低级别组织微阵列(LTMA)中；平行地，从基于格里森分级具有最侵袭性肿瘤(高GS)的区域中取得核心且包埋在高级别组织微阵列(HTMA)中(图32)。因此，我们开发了其中样品在两个方向上有偏的配对组织TMA，代表来自每个患者的较多和较少侵袭性的肿瘤区域。
表12a描述了针对380个患者的多机构队列的临床特征，由所述患者制备配对TMA。表12b描述了在LTMA上具有3+3或3+4的核心格里森的301个病例的子集，连同其在HTMA上的相应核心格里森及其手术(前列腺切除术)格里森。
表12a和12b显示了用于制备L和HTMA的队列的临床特征。
表12a.380个患者的单个队列提供了用于两个TMA的样品。出于技术原因，仅在LTMA上的360个样品和在HTMA上的363个样品可用。TMA，组织微阵列。
表12b：在具有3+3或3+4的LTMA核心格里森的301个患者中，HTMA核心格里森得分和手术格里森得分的分布。
针对LTMA的取样被特别设计为低估疾病严重性。如表12a和表12b中所示，64.7％的LTMA样品具有低于或等于6的核心GS，而这些LTMA样品中仅30％来自具有低于或等于6的手术GS的患者。对于来自具有核心GS≤3+4的病例的LTMA中的样品的级别上调(表12b)至更高手术GS的概率为0.64(95％威尔逊置信区间[CI]：0.59–0.69)。这个级别上调概率高于临床实践中所见的(12)，如由使用的取样方法和患者队列所预期的。因此，通过扩大临床实践中预期的样品变异，这种活组织检查模拟程序提供了鉴定生物标志物的有用模型，所述生物标志物可靠地预测前列腺癌侵袭性，而与样品变异无关。
取样误差对已知生物标志物模型表现的作用
为了评价取样变异对预后标志物表现的作用，我们最初就其对活组织检查模拟组织使用时预测致死结果和侵袭性疾病的能力，测试已建立的生物标志物组合，其据报道在对前列腺切除术组织使用时对于致死结果是预测性的。先前研究已证实7或更高的根治性前列腺切除术(RP)GS和前列腺癌扩展到前列腺外是转移和前列腺癌特异性死亡率的显著预测物(27-29)。因此，我们基于前列腺病理学，将‘侵袭性疾病’定义为手术GS至少3+4或pT3b(精囊侵入)、N+或M+。我们在我们的取样变异TMA队列中就其预测疾病特异性死亡和疾病侵袭性两者的能力，测试先前由Ding等人(30)报道的四生物标志物模型(SMAD4、CCND1、SPP1、PTEN)。L或HTMA中的患者核心被分离成独立的“训练”和“测试”数据集，并且逻辑回归模型用于使用训练数据集估计标志物系数。我们由测试集中所得到的接受者操作特征(ROC)估计曲线下面积(AUC)，并且随后对于另外的取样重复该过程。如表13中所示，当对HTMA进行测量时，4标志物标志能够预测疾病特异性死亡，具有中值测试AUC0.65(0.59–0.74的95％CI)。然而，当对代表手术GS的有偏低估的LTMA进行测量时，4标志物标志显示不显著的中值测试AUC0.49(0.42–0.58的95％CI)。此外，当在H或LTMA中测量时，4标志物标志预测侵袭性疾病的能力也不能达到显著性(中值测试AUC分别为0.56[0.44–0.64的95％CI]和0.56[0.46–0.65的95％CI]。这些结果举例说明取样误差对预后标志物表现的影响，以及鉴定尽管存在这样的取样变异仍可准确地预测结果的备选生物标志物组合的重要性。
表13.取样变异降低已建立的致死结果预测性生物标志物标志的表现。PTEN+SMAD4+CCND1+SPP1的组合先前已显示：当对前列腺切除术组织进行测量时，对于致死结果是预测性的。我们证实当在高格里森活组织检查模拟组织(HTMA)中进行测量时，这些标志物确实预测致死结果。然而，这些标志物不能预测低格里森模拟活组织检查(LTMA)中的致死率。标志物对于侵袭性疾病不显示统计上显著的预测表现，无论是在高(HTMA)还是低(LTMA)格里森组织区域中测量。AIC，Akaike信息准则；C统计量，接受者操作特征(ROC)曲线下面积；TMA，组织微阵列。
生物标志物鉴定
在显示有偏活组织检查模拟TMA的确反映极端取样误差情况，并且此类取样变异致使已知的预测性标志物标志不能重现性表现后，我们接下来追求鉴定生物标志物的主要目标，所述生物标志物强力地预测癌症侵袭性，而与活组织检查取样变异无关。通过利用来自具有长期随访的大型患者队列的具有丰富临床和病理学注释的前列腺切除术组织样品，我们建立了选择潜在标志物的基于表现的策略。该逐步方法涉及：1)鉴定候选生物标志物，2)评估其生物学和技术适合性，和3)分析在H和LTMA队列中的表现(图33)。
该过程从公开的参考文献和可公开获得的基因表达数据集的搜索开始，其基于针对前列腺癌的生物学相关(30-48)鉴定160种生物标志物候选物。我们进一步基于适当单克隆抗体(MAb)的可用性，将其中的120种区分优先次序(对于综合的生物标志物候选物列表，参见表14)。候选物包括充分表征的对于前列腺癌侵袭性有关的标志物，例如EZH2、MTDH、FOXA1(49-51)，以及先前鉴定为对前列腺切除术组织预测致死结果的标志物PTEN、SMAD4、细胞周期蛋白D1、SPP1、磷酸-PRAS40-T246(pPRAS40)和磷酸-S6-Ser235/236(pS6)(26，30)。
表14.从公开的文献和基因表达数据库鉴定的候选物生物标志物。注：DAB染色和特异性。通过的：具有基于DAB的免疫组织化学染色的抗体证实与公开的文献相当的良性和肿瘤前列腺组织的信号强度和染色模式。免疫荧光信号和特异性。通过的：具有免疫荧光染色的抗体显示出高信号水平以及与公开的文献相当的良性和肿瘤前列腺组织的染色模式。组织中的标志物稳定性。通过的：跨越可变质量的组织区域显示与上皮标志物染色强度关联的信号强度的抗体。MPTMA10。通过的：证实在表达和手术(前列腺切除术)格里森得分之间的关联的抗体。
我们接下来取得针对120种区分优先次序的候选生物标志物的MAb并就对于定量多路免疫荧光(QMIF)测定法的特异性和适合性，测试其。如其它地方描述的(26)，基于信号强度和特异性免疫荧光(IF)染色模式，选择候选MAb用于进一步分析。我们将相对于间质细胞优先染色癌细胞的MAb区分优先次序。基于大量染色样品，我们观察到上皮标志物的IF染色强度在看起来固定或保存很差的组织中很低。基于相对于上皮标志物的信号更稳定的信号，选择候选生物标志物抗体。
在第三个步骤中，我们测试通过先前步骤的62种MAb，并且测定其动态范围以及其预测表现。通过使用设计为代表来自具有高和低总体GS的前列腺肿瘤的最小侵袭性区域的小型测试TMA，基于信号强度与手术GS的关联选择生物标志物。具体地，我们要求在最低和最高表达值之间的三倍信号差异，加上证实的在非侵袭性和侵袭性病例之间的信号值分布差异。符合这些标准的最终39种候选MAb对通过上文描述的H和LTMA块代表的临床队列进行测试。
单变量分析
我们接下来的目标是进一步基于在取样误差环境下的单变量预后能力和分析表现，评估候选生物标志物。当在低和高格里森区域中进行测量时，上文鉴定的39种生物标志物各自就其预测疾病侵袭性(手术GS≥3+4或病理分期pT3b、和/或N+或M+)和来自疾病的死亡(存活分析)的能力进行测试。用两个星号显示的个别标志物证实针对侵袭性疾病或来自前列腺癌的死亡的预测价值(P<0.1)，其基于增加或减少的表达，而与它们是在低还是高格里森区域中测量无关(图34)。这个结果提示这些标志物对不同程度的取样误差有抗性。存在仅当在高而不是低格里森区域中测量时，预测侵袭性的2种标志物和预测致死结果的3种标志物，表明这些标志物对取样误差不够稳健。相反，我们未鉴定出当在低而不是高格里森区域中测量时，具有预测表现的标志物。值得注意的是，侵袭性疾病和致死结果之间的强联系通过下述发现揭示：在对于侵袭性具有显著单变量表现的14种标志物中，其中12种还显示出针对致死结果的显著单变量表现。作为基于表现的生物标志物选择方法的进一步验证，我们证实在致死结果与三种如先前报道的(49-51)已知前列腺癌进展标志物EZH2、HoxB13和MTDH2的表达之间的强关联。总之，我们鉴定了对于侵袭性疾病和致死结果两者具有单变量表现的许多标志物候选物，其还对取样误差具有抗性。此外，我们鉴定了仅在最低限度取样误差的情况下是预测性的标志物(在H而不是LTMA中的表现)。
多变量分析：预测肿瘤侵袭性的生物标志物
为了探究预测疾病侵袭性的最佳多变量生物标志物组合，我们以多至且包括五种生物标志物的组合穷举搜索所有可能模型(图35A)。多变量分析集中于基于技术标准从原始39种集合中精炼的31种生物标志物，所述技术标准包括MAb检测信号强度、动态范围和特异性(参见材料与方法)。最初，‘极端’模型方法用于多变量分析，其包括对于模型构建和测试去除中间型样品(GS＝3+4、≤T3a和N0)。我们将LTMA中的患者核心分离成独立的训练和测试集，并且就跨越取样变异的多变量表现，对L和HTMA两者测试所得到的模型。为了这个目的，我们使用逻辑回归模型来使用训练数据集估计生物标志物系数，由测试集中所得到的ROC估计AUC，并且随后对于另一个取样重复该过程。
在每种情况下，测定在通过AIC(Akaike信息准则)(52)和测试集AUC分选的模型的最高5％或1％中最频繁出现的生物标志物。对于通过测试的排序、通过AIC的排序和两种排序生成最终记录(对于通过AIC和测试排序的五生物标志物模型的代表性例子，参见图35B)。我们观察到在最高表现生物标志物模型中的高度保守的生物标志物次序(参见图35C和表15)。下述生物标志物在至少50％的排序列表中的最高标志物中出现：ACTN1、FUS、SMAD2、DERL1、YBX1、DEC1、pS6、HSPA9、HOXB13、PDSS2、SMAD4、CD75。另外，CUL2存在于许多高度排序模型中。(对于排序结果的进一步细节，参见表15)
表15.基于表现的生物标志物排序：侵袭性。生成多至五种生物标志物的组合且测试其预测严重疾病(侵袭性)的能力。最佳模型中的每种生物标志物频率用于排序。
多变量分析：预测致死结果的生物标志物
对于致死结果执行相似的建模分析(表16)。包括在至少50％的排序列表中的最高标志物中出现的生物标志物：MTDH2、ACTN1、COX6C、YBX1、SMAD2、DERL1、CD75、FUS、LMO7、PDSS2、FAK1、SMAD4、DEC1。(对于排序结果的进一步细节，参见表16)
表16.基于表现的生物标志物排序：致死结果。生成多至五种生物标志物的组合且测试其预测致死结果(致死率)的能力。最佳模型中的每种生物标志物频率用于排序。
最终生物标志物集合
我们基于单变量和多变量表现的谨慎整合以及分析考虑，包括对于所有抗体跨越肿瘤样品的最低限度3倍动态信号强度范围，选择最终12种生物标志物集合。图36A显示了针对侵袭性的单变量预测，与这12种生物标志物相关的估计的比值比(OR)，并且还概括了基于单变量和多变量分析两者用于选择每种生物标志物的基础。图36B提供了所选择的生物标志物的生物学概括。最终生物标志物集合包含：FUS、PDSS2、DERL1、HSPA9、PLAG1、SMAD2、VDAC1、CUL2、YXB1、pS6、SMAD4、ACTN1。
12种标志物抗体各自在靶特异性敲低前后，通过包括蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)测定法的特异性分析严格地验证，如图37中所示。有趣的是，通过该过程，我们发现作为销售针对DCC特异性的MAb不检测DCC，而是检测HSPA9(也称为致死蛋白)(图38)。因为DCC敲低不导致在WB上的唯一条带的消失，所以我们采取质谱法测序分析来鉴定蛋白质为HSPA9。该蛋白质在癌症进展和存活中具有充分描述的作用的事实(53)，进一步验证了基于表现和功能的生物标志物鉴定方法。
我们接下来使用先前描述的建模方法来评价最终12生物标志物集合对整个患者队列上的疾病侵袭性和疾病特异性死亡两者的预测潜力。来自LTMA和HTMA的数据随机划分成训练和测试集，对LTMA训练集执行逻辑回归，对LTMA和HTMA测试集评估表现，并且重复该过程以开发用于疾病侵袭性的12标志物模型。如图36C中所示，这导致0.72的LTMA测试AUC(95％CI：0.64–0.79)，以及20/风险得分中的单位变化(95％CI：4.3–257)的对于侵袭性疾病的相应OR。为了证实跨越取样误差一般化的能力，衍生自LTMA训练集的模型还对HTMA就具有一致结果的侵袭性疾病预测进行测试(图36C)。无需对侵袭性模型的任何进一步变化，我们通过将侵袭性风险得分与来自疾病的死亡关联，检查其对致死结果预测的表现。值得注意的是，我们发现在L和HTMA两者上对于致死结果与对于侵袭性相似的AUC，分别为0.72(95％CI：0.60–0.83)和0.71(95％CI：0.61–0.81)。针对在L和HTMA上的致死结果的相应HR分别为66/单位变化(95％CI：5.1–6756)和36(95％CI：3.3–2889)。我们得出结论，12种鉴定的生物标志物对取样误差是稳健的，并且可能预测疾病侵袭性和致死结果两者。
讨论
存在对于在初始诊断时更准确地评价前列腺癌侵袭性且作为进行中的患者随访的一部分的持续临床需要，所述患者包括指定至主动患者监督的那些以及接受针对该疾病的积极疗法的那些(4、29、54)。目前，在患有早期疾病的男性中，3+4＝7或更高的活组织检查GS是预后因素之一，其作用于指示积极疗法的需要(9、55)，但如讨论的，起因于肿瘤异质性和不一致的格里森评分的活组织检查取样误差可以影响评估患者的癌症进展风险、侵袭性和致死率的准确度和可靠性。这种不确定已促成其中前列腺癌显著过度治疗的情况，因为难以准确预测针对具有活组织检查格里森级别3+3或3+4的患者的预后(2、5、10、54、56、57)。
预测前列腺癌侵袭性和致死率的生物标志物
本文描述的是基于表现的方法的成功开发，以鉴定且评估即使在极端取样变异的情况下(在前列腺活组织检查取得过程中通常遇到的问题)也预测前列腺癌侵袭性和致死结果的生物标志物。使用具有针对致死结果的长期随访的注释临床前列腺切除术样品的大型队列(N＝380)，通过专家病理学家以不知情方式标记每个前列腺切除术组织上的最高和最低GS区域。通过对来自每个患者样品的这些‘高’和‘低’区域芯吸，我们生成代表整个队列的配对TMA，从而模拟针对每个患者的具有取样误差的活组织检查。通过使用这些配对TMA，我们就下述能力评价大量生物标志物候选物：当在来自每个患者的低或高级别癌症区域中进行测量时，预测侵袭性前列腺病理学和致死结果。我们特别地首先选择当在LTMA组织中进行测量时，具有针对侵袭性和致死结果的表现的生物标志物，以鉴定对极端取样误差最稳健的那些。为了这个目的，我们仅包括具有核心格里森≤3+4的LTMA样品作为临床相关的，因为具有GS4+3或更高的活组织检查不可避免地是侵袭性疗法候选物。使用整合的多路蛋白质组学原位成像平台定量生物标志物候选物，所述平台提供了自动化、客观生物标志物测量(26)。基于单变量分析，大多数鉴定的生物标志物预测疾病侵袭性和前列腺癌特异性死亡率两者，而与是在L还是HTMA组织样品中测量无关，并且因此对取样变异是稳健的(图34)。此外，先前报道为预测进展风险和致死结果的几种前列腺癌生物标志物包括SMAD4、EZH2、MTDH2、HoxB13和PTEN，均证实对于致死结果阳性，从而支持该方法的有效性。
作为我们的抗体的特异性验证的一部分，我们通过靶敲低分析和基于质谱法的蛋白质测序分析发现作为抗DCC销售的MAb实际上识别不相关的蛋白质HSPA9或致死蛋白。我们发现HSPA9作为多变量模型的一部分是预测性的，并且因此包括在最终12标志物集合中。当实施功能分析时，我们的确发现HSPA9涉及克隆形成细胞集落测定形成和细胞增殖，与先前发现一致(参见图38和(53))。这进一步支持无偏的、基于表现的标志物选择方法的有效性。
基于单变量表现以及标志物在针对疾病侵袭性和致死结果的多变量模型中的出现频率，选择了12种生物标志物(图36A)。基于这12种标志物的多变量模型显示针对侵袭性的跨越组织取样变异的相似预测表现(图36C)。有趣的是，基于12标志物侵袭性模型生成的风险得分同等地预测跨越组织取样变异的致死结果的分离终点(图36C)。预测通过前列腺格里森等级和分期定义的前列腺癌侵袭性的标志物也预测致死结果，强烈提示关于手术病理学的侵袭性特征与致死率的联系。更重要的是，它验证我们的病理学终点用于构建我们的与长期患者结果相关的生物标志物实验对象组的使用。12种鉴定的生物标志物对于预测肿瘤行为是相关的，并且提供针对用于评价前列腺癌侵袭性的临床的、基于证据的多变量活组织检查测试的基础。活组织检查在初始诊断时和在监控经历主动监督的患者中的疾病状态中起关键作用(8、9)。像这样，如此处描述的，多变量活组织检查测试可以在管理患有前列腺癌的患者中告知早期决策制定步骤。
对取样误差稳健的生物标志物
本发明的研究鉴定且选择对取样误差高度稳健的标志物。对于活组织检查取样误差的关键原因之一是前列腺癌的异质性。不能从肿瘤的最侵袭性部分一致地获取组织导致肿瘤侵袭性和进展风险的频繁低估。通过在来自每个患者的最高和最低格里森区域内芯吸，我们生成设计为模型来自每个患者的两个活组织检查的整个队列研究的配对TMA，一个具有‘最大’取样误差(LTMA)，并且另一个具有最低限度取样误差(HTMA)。我们集中于具有核心格里森≤3+4的LTMA，因为这代表其中护理标准对于准确预后不足够的临床相关病例。我们发现这些LTMA病例的～54％级别上调至更高的手术格里森得分，这高于临床实践中所观察到的(12)，证实我们的方法提供了有偏取样误差模型(表12b)。
通过检查基于细胞周期蛋白D1、SMAD4、PTEN和SPP1的良好建立的4标志物标志(其先前报道为基于前列腺切除术队列预测致死结果)(30)，强调了对取样误差抗性的生物标志物的鉴定的需要。虽然模型预测代表最低限度取样误差情况的HTMA中的致死结果，但该模型在代表最大限度取样误差的LTMA组织核心中，完全不是致死结果预测性的(表13)。该发现与近期报道一致：4标志物标志不能预测低格里森得分前列腺肿瘤中的致死结果(58)。
基于单变量标志物分析，我们鉴定了对于疾病侵袭性和致死结果具有跨越L和HTMA样品的取样误差稳健表现的分别14和18种标志物(在图34上用**标记的标志物)。这些单变量选择的标志物中的大多数跨越取样变异预测该两种指示，这再次支持疾病侵袭性和致死结果之间的关联，如上文对于上述多变量分析所讨论的。有趣的是，虽然在LTMA上对于疾病侵袭性和致死结果显示单变量表现的所有标志物在HTMA上也是预测性的，但2种标志物(PXN和MTDH2)和3种标志物(NCOA2、CCND1(细胞周期蛋白D1)和AKAP8)仅在HTMA上而不是在LTMA上测量时分别预测侵袭性疾病和致死结果(图34)。这指示这些标志物主要在最低限度取样误差的情况下是预测性的。事实上，所有这5种标志物已显示作为细胞增殖、迁移和瘤形成中的重要调节物(参见例如(30、51、59-61))。细胞周期蛋白D1仅在HTMA中而不是在LTMA中预测致死结果的观察与下述发现一致：通过Ding等人报道的4标志物标志在我们的LTMA组织中，以及在低级别前列腺癌样品上不预测致死结果(58)。考虑到我们主要选择可以在LTMA中预测侵袭性或致死结果的标志物以反映最大限度取样误差稳健性，有趣的是没有标志物仅在LTMA而不是在HTMA上预测侵袭性疾病或致死结果。这指示所鉴定的标志物可能反映来自更侵袭性肿瘤区域的场效应，这与其在L和HTMA组织中的相似表现一致。
遗传和蛋白质组学方法
在发现前列腺癌中的新的和更佳的生物标志物的搜索中，在鉴定可能的遗传标志物中存在极大兴趣并取得了进展，所述遗传标志物可以告知临床风险预后(31、32、39、48、62、63)。然而，对于鉴定的许多基因，存在关于此类标志物在疾病预后中的可靠性的冲突或不佳结果。例如，尽管TMPRSS2–ERG基因融合物据报道与高风险肿瘤相关，但具有大型队列的更近期研究未报道这些融合物和患者结果之间的强关联(64)。基于来自英国的适当管理的患者队列(65)，以及在美国的主动管理队列中的治疗后的生物化学复发(66、67)，多变量基于基因表达的测试近期据报道预测转移性疾病和致死结果。取样变异对该测试的影响仍有待确定。
本发明研究的结果证实采取蛋白质组学方法可以改善在活组织检查阶段时的准确风险分类，所述蛋白质组学方法测量仅来自完整组织的肿瘤区域的蛋白质。针对该观点的理由是双重的。首先，因为前列腺癌是异质的多病灶疾病，所以活组织检查频繁地仅含有较低级别组分，并且病理学家可以将它们分类为低风险癌症。然而，在形态上不反映的较高级别分子特征据报道扩展到整个癌症(68、69)，并且因此在看起来含较低级别的活组织检查中可测量。通过仅测量来自完整组织肿瘤区域的蛋白质的蛋白质组学方法，即使在具有可变量的肿瘤相对于良性组分的组织样品中，也可能准确地且灵敏地原位评价这样的高级别分子特征。基于基因表达的技术的优点是需要组织匀浆化，导致取决于混杂的良性组织的量较高级别分子特征的可变稀释。其次，在活组织检查上的格里森分级是主观的，在多至30％的病例上具有专家病理学家不一致(16、17)。可以客观地测量的分子特征将改善风险分类。
在该研究中鉴定的12种生物标志物代表具有一系列功能的蛋白质，包括转录、蛋白质合成以及细胞增殖和细胞凋亡以及细胞结构的调节(30)。尽管存在活组织检查取样误差，生物标志物仍能够表现的事实指示：基于蛋白质的生物标志物可以进一步改善基于格里森的风险分类，作为指导前列腺癌治疗的初始管理的手段。
结论
考虑到对于诊断有早期癌症的患者预测存活结果的困难和所导致的过度治疗，存在对于针对患有前列腺癌的患者的可靠和准确预后测试的迫切需要。针对本文描述的蛋白质生物标志物的鉴定策略还可以应用于其它肿瘤类型，并且允许基于表现的生物标志物选择，所述生物标志物可以用于开发针对其它肿瘤的预后或预测测试，在所述肿瘤中组织学评价对于风险分层和预后是至关重要的。
材料与方法
试剂和抗体
该研究中使用的所有抗体和试剂均得自商购可得的来源，如表17中所述。使用适当的蛋白质缀合试剂盒(LifeTechnologies)，使抗异硫氰酸荧光素(FITC)MAb–Alexa568、抗CK8–Alexa488、抗CK18–Alexa488、抗CK5–Alexa555和抗Trim29–Alexa555与Alexa染料缀合。
表17.抗体来源。
载玻片加工和染色方案
从TMA块切割5μm切片，置于Histogrip(LifeTechnologies)包被的载玻片上，并且如先前描述的(补充材料)进行加工。简言之，在去石蜡后，使用LabVisionPT模块(ThermoScientific)在0.05％柠檬酸酐溶液中在95℃下进行抗原修复45分钟。手动或以自动化方式用Autostainer360或720(ThermoScientific)执行染色。
如先前描述的(参见补充材料与方法)，执行组合具有目标区域标志物的两种抗生物标志物抗体的QMIF染色程序。对于基于二氨基联苯胺(DAB)的IHC染色，具有组织的载玻片如上所述进行加工，用SniperreagentTM(BiocareMedical)封闭且与一抗溶液一起温育。UltraVision(ThermoScientific)用作第二试剂。最后，组织用苏木精复染且加上盖玻片。
FFPE前列腺癌组织块的获取、加工、质量控制和注释
从FolioBiosciences获取具有临床注释和长期患者结果信息的FFPE人前列腺癌组织块集合。样品在适当的机构审查委员会批准下收集，并且所有患者记录是去识别化的。对于候选生物标志物抗体的评估，从其它商业来源获取具有有限临床注释的FFPE人前列腺癌组织块。
从每个FFPE块切割一系列5μm切片。对于注释，由每个FFPE块最后切割的5μm切片用苏木精和伊红(H&E)进行染色，并且使用ScanScopeXT系统(Aperio)进行扫描。将扫描的图像远程审查，并且通过专家临床委员会认证的解剖病理学家以不知情形式注释GS。将对应于1mm直径核心的圆圈置于最高格里森得分模式的四个区域和最低格里森得分模式的两个区域上(参见图32，顶部)。
TMA块的生成
使用经修饰的琼脂糖块程序(70)制备TMA块。为了生成测试TMA(MPTMA10)，我们选择具有可获得的GS和病理分期注释的前列腺切除术样品的72个FFPE组织块。在这些中，37个具有3+3＝6的GS伴随T2分期，而35个具有4+3＝7的GS或者3+3＝6或3+4＝7的GS伴随T3b分期。从最低格里森模式的区域取得一个1mm核心/患者样品，并且置于受体块内。
对于H和LTMA的构建，我们使用具有临床注释和长期患者结果信息的FFPE人前列腺癌组织块的队列。对于每个患者样品，从具有最高格里森模式的区域取得核心且布置于H受体块内。随后从具有最低格里森模式的区域取得第二核心且置于L受体块内。样品核心置于H块内的次序是随机化的，并且L块中的核心位置等同于H块中的位置。另外，来自细胞系对照(表18)的FFPE块的核心置于所有H和LTMA块的上部和下部部分中。在完成后，从每个块中切割5μm连续切片，并且将代表性切片用H&E染色并用ScanScopeXT系统扫描。随后通过委员会认证的解剖病理学家以不知情方式就观察到的格里森模式独立地注释H&E-染色的核心的图像。
表18.细胞系对照。列出的细胞系作为样品包括在TMA上，以提供针对使用的抗体的阳性对照。(Dox＝多西环素)
所得到的H和LTMA块对于患者样品集合是相同的，但在可观察的格里森模式中不同(图32，底部)。对于该研究，用来自380个患者样品的核心生成两对TMA块(MPTMAF5H和5L，6H和6L)。
生物标志物选择
为了鉴定针对前列腺癌侵袭性的生物标志物，我们开发了选择和评估过程，其可以跨越疾病和病况广泛地应用。图33中所示的过程具有生物学、技术、表现和验证阶段。
在生物学阶段，由可公开获得的数据汇编针对前列腺癌侵袭性的潜在生物标志物的初始列表。该列表随后基于生物学相关性、计算机模拟分析、人类蛋白质图谱的审查(www.proteinatlas.org)和必需MAb的商业可用性，将该列表区分优先次序。生物学相关性审查基于在细胞且特别是疾病中的作用机制。计算机模拟分析基于先前已知的基因扩增、缺失和突变，以及在这些遗传改变和疾病之间的单变量表现或进展关联。人类蛋白质图谱含有在各种组织中跨越疾病状态的蛋白质表达水平。
在技术阶段，获得商业MAb且测试其检测来自临床样品的生物标志物的能力。最初，我们使用基于DAB的IHC染色程序染色恶性和良性前列腺组织的样品，并且选择显示出良好的信噪比且对于上皮细胞染色特异性的候选抗体。我们进一步在恶性和良性前列腺组织样品上使用IF连同目标区域标志物、上皮细胞角蛋白CK8和CK18以及基底标志物CK5和Trim29测试成功的候选物，如所描述的(补充材料与方法)。满足IF标准的抗体和生物标志物前进至表现阶段。
在表现阶段，MAb在TMA上进行测试。就肿瘤上皮表达和疾病状态之间的单变量关联评估表现。证实表达和疾病状态之间的单变量关联的MAb和生物标志物随后在更大型的H和LTMA集合上结合其它标志物评估单变量关联和表现。
图像采集
如所述的(补充材料与方法)，两个Vectra智能载玻片分析系统(PerkinElmer)用于自动化图像采集。将多光谱图像加工成针对每种分离的荧光信号的图像，并且用于使用DefiniensDeveloper脚本(DefiniensAG)的分析。
Definiens自动化图像分析
我们使用DefiniensDeveloperXD开发了自动化的图像分析算法，用于肿瘤鉴定和生物标志物定量。对于每个1.0mmTMA核心，获取两个20×图像视野。使用inForm(PerkinElmer)和定制的光谱文库，将Vectra多光谱图像文件首先转换成多层TIFF文件，并且随后使用BioFormats(OME)转换为单层TIFF文件。使用定制输入算法，将单层TIFF文件输入到Definiens工作空间内，使得对于每个TMA核心，将两个图像视野TIFF文件作为单个“场景”内的“地图”装载和分析。
在我们的图像分析算法中自适应阈值用于限定针对每个个别组织样品中的组织区段的荧光强度截断。基于预定义的核心坐标，在Definiens算法中自动鉴定TMA内的细胞系对照核心。使用荧光上皮和基底细胞标志物连同4'-,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)，将组织样品分段，以分类成上皮细胞、基底细胞和间质，并且进一步区室化成细胞质和核。基于基底细胞和邻近上皮结构之间的相关特征结合对象相关特征例如腺厚度，将个别腺区域分类为恶性或良性。上皮标志物不存在于所有细胞系中，因此使用自体荧光通道，将细胞系对照分段成组织相对本底。通过严格的多参数质量控制算法，去除具有假象染色、不足够的上皮组织或失焦图像的视野。
上皮标志物和DAPI强度在恶性和非恶性上皮区域中作为质量控制测量进行定量。基于预定亚细胞定位标准，生物标志物强度水平在恶性组织中的细胞质、核或全细胞中进行测量。恶性区室中的平均生物标志物像素强度跨越具有可接受的质量参数的地图求平均值，以获得针对每种组织样品和细胞系对照核心的单个值。
分析中的数据分层和终点
使用H和LTMA检查39种生物标志物的表达与肿瘤侵袭性和致死率的关联。基于前列腺病理学(侵袭性疾病＝手术格里森≥3+4或T3b、N+或M+)定义疾病侵袭性。对于侵袭性分析，我们基于在核心格里森≤3+4的LTMA样品和相应的匹配HTMA样品两者中的测量，检查标志物关联。
对于致死结果分析，我们制备两个不同的样品集：(1)具有观察到的GS≤3+4的所有核心；和(2)所有核心。
队列比较
表12a呈现了队列组成。仅包括具有临床信息的完全集合的那些样品。当使用某一生物标志物集合执行分析时，仅考虑具有针对那些标志物的值的样品。因此，表中的数目是上限。
侵袭性和致死率的单变量分析
我们针对单变量分析的目的是双重的：表征单变量行为作为用于潜在包括在最终标志物集合中的表现评价，和提供用于穷尽多变量模型探究的减少标志物集合。所有建模均使用标准函数和包，包括glm、存活、KMsurv、binom和pROC，在R3.0中完成。基于两种结果评价生物标志物：手术GS的预测和死亡(致死率)的预测。分类为无痛感或更严重的手术GS的预测用OR(逻辑回归)和生物标志物平均值(线性回归)两者进行建模。致死率使用HR(常规Cox比例风险)、OR(逻辑回归)和标志物平均值(线性回归)进行建模。另外，为了提供非参数和强力的评价，应用Wilcoxon和置换检验。
图34A-B显示了关键结果。单变量结果还在最终标志物集合的选择中直接加以考虑，如图36A中可见的。
经由多标志物模型的穷举搜索，针对侵袭性的生物标志物排序
我们通过在多标志物模型中的重要性给生物标志物排序；从原始39种集合中精炼以进一步改善技术表现的31种生物标志物，用于穷尽生物标志物搜索中。我们考虑来自在LTMA以及H和LTMA分析中测试的31种生物标志物的多至五种生物标志物的所有组合。对于每种生物标志物组合，通过自举生成500个训练集，并且获得相关补充测试集。将逻辑回归模型应用于每个训练集，并且随后对相关测试集各自进行测试。在每轮中获得训练和测试AUC(即C统计量)以及训练AIC。对于所有三种统计量获得中值和95％CI。
我们随后考虑在模型中的生物标志物选择频率，并且通过其AIC以及单独地通过其测试AUC将它们分选。对于每个所得到的模型的排序，测定在列表的最高1％和最高5％中的生物标志物利用频率。随后鉴定在至少50％的模型中包括的生物标志物。
表15显示在侵袭性评价预测中的生物标志物频率。最高排序模型的表现是相似的。此外，在最高排序的模型中的生物标志物数目不同。为了解决看起来与模型大小相关的这个问题，我们考虑了通过测试AUC分选的模型的最高1％。我们研究了对于许多不同的群体假定所得到的分布，包括其中中间型核心GS从分析中排除、或与无痛感得分一起包括、或与高得分一起包括的病例。在最终分析中，我们得出结论，八生物标志物模型在该实验数据集中提供表现和复杂性之间的最佳权衡。
经由多标志物模型的穷举搜索，针对致死率的生物标志物排序
遵循相同模型构建方法用于预测致死率的生物标志物排序。表16显示了针对致死率的生物标志物利用频率(最高5％)。
在最终生物标志物集合中的结果整合
最终12种生物标志物集合的选择需要反映其生物学意义，如在患者样品测量的单变量和多变量分析中所评价的。合并且调和最终选择是可用于研究的特异性MAb的技术局限性的考虑。最终生物标志物集合选择在图36中描述。
补充附录
结果
在本研究中鉴定的十二种标志物前进至前列腺癌FFPE活组织检查样品的另一个独立研究，以开发用于临床使用的锁定模型(提交的原稿)。在该项新研究中，我们鉴定了12种标志物的最佳标志物子集，并且锁定所得到的含有下述生物标志物的8标志物模型：SMAD4、FUS、CUL2、YBX1、DERL1、PDSS2、HSPA9和pS6。为了完全性的利益，我们对本研究中的TMA样品分析该标志物集合，理解TMA队列促成标志物选择过程。我们再次使用相同的患者分配，且在LTMA上进行训练，随后在LTMA和HTMA样品两者上测试。我们分析了含有40个死于疾病事件的268个患者。针对预测侵袭性疾病所得到的基于LTMA的测试AUC为0.64(95％CI：0.56–0.71)，其中针对侵袭性疾病的测试比值比为13/风险得分中的单位变化(95％CI：2.3–341)。针对致死结果预测的测试危害比为14/风险得分中的单位变化(95％CI：1.3–393)。为了证实跨越取样误差一般化的能力，源自LTMA训练的模型还对测试HTMA进行测试，对于两种指示具有一致结果。HTMA测试AUC为0.70(95％CI：0.62–0.78)，其中针对侵袭性疾病的比值比为46/风险得分中的单位变化(95％CI：5.6–1290)。针对致死结果预测的HTMA测试危害比为19/风险得分中的单位变化(95％CI：1.4–620)。
材料与方法
定量多路免疫荧光(QMIF)染色程序
QMIF包括两个初始封闭步骤随后四个MAb温育步骤，伴随在两者之间的适当洗涤。根据制造商的说明书，封闭由生物素封闭步骤随后用Sniper试剂(BiocareMedical)处理组成。第一MAb温育步骤由抗生物标志物1小鼠MAb和抗生物标志物2兔MAb的混合物组成，随后为含有抗小鼠IgGFab–异硫氰酸荧光素(FITC)和抗兔IgGFab–生物素的混合物的第二步骤。第三“显现”步骤包括抗FITCMAb–Alexa568、链霉抗生物素蛋白–Alexa633，以及分别针对上皮(抗CK8–Alexa488和抗CK18–Alexa488)和基底上皮(抗CK5–Alexa555和抗Trim29–Alexa555)的MAb。最后第四步骤包含与4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的短暂温育用于核染色。在末次洗涤后，在加入盖玻片前，将载玻片用ProlongGoldTM(LifeTechnologies)固定。载玻片在成像前后长期保持在-20℃下。
FFPE组织块质量评估
如上所述，用抗磷酸STAT3(T705)兔MAb、抗STAT3小鼠MAb和目标区域标志物，手动染色来自每个FFPE块的5μm切片。在荧光显微镜下目视检查载玻片。基于染色强度和自体荧光，将切片及其相应的FFPE块分级成四个质量类别。
图像采集
如其它地方描述的，两个Vectra智能载玻片分析系统(PerkinElmer)用于自动化图像采集。DAPI、FITC、四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)和Cy5长通过滤器立方体对于最大多路化容量进行优化。Vectra2.0和Nuance2.0软件包(PerkinElmer)分别用于自动化图像采集和光谱文库的开发。
根据制造商说明书(Perkin-Elmer)，以自动化模式运行TMA采集方案。使用多光谱获取方案使两个20×视野/核心成像，其包括使用DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器的连续曝光。对于最大限度重现性，在针对每个TMA载玻片的图像采集之前，借助于X-CiteOpticalPowerMeasurementSystem(LumenDynamics)调整光源强度。相同的曝光时间用于含有相同抗体组合的所有载玻片。使用相同抗体组合染色的TMA载玻片集合在相同Vectra显微镜上成像。
对于每种荧光染料以及FFPE前列腺组织自体荧光生成光谱特征谱。有趣的是，在FFPE前列腺组织中观察到两类自体荧光。典型的自体荧光信号在良性和肿瘤组织两者中是共同的，而非典型“亮”类型的自体荧光对于主要在良性组织的上皮细胞中存在的亮颗粒是特异性的。含有这两种光谱特征谱的组合的光谱文库用于使个别染料信号与自体荧光本底分离或“解混”。
FFPE细胞系对照
如所示的(表18)，在收获前，所选细胞系在含和不含处理的标准条件下生长。细胞用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用10％福尔马林直接固定到平板上5分钟，随后刮取且在PBS中收集，伴随在室温下1小时的连续固定。细胞用PBS洗涤两次，重悬浮于以70℃的Histogel(ThermoScientific)中，并且在1.5ml微量离心管中快速离心下来，以形成浓缩的细胞-Histogel沉淀物。随后将沉淀物包埋在石蜡中，且置于标准石蜡块内，其充当用于TMA构建的供体块。根据制造商的说明书，使用‘Tet-one’系统(Clontech)，建立具有CCND1和SMAD4的可诱导敲低的DU145细胞。
抗体特异性测定法
通过靶特异性敲低和对照细胞的蛋白质印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)测定法，验证几种MAb，包括抗ACTN1、抗CUL2、抗Derlin1、抗FUS、抗PDSS2、抗SMAD2、抗VDAC1、抗YBX1和抗HSPA9(图37)。小干扰RNA(siRNA)序列和宿主细胞系的细节在表19中列出。将细胞种植到12孔板内，并且用25nMsiRNA和DharmaFect转染试剂(ThermoScientificDharmacon)转染；模拟转染仅包括转染试剂。还包括用两种非靶向序列转染的细胞作为对照。
表19.用于抗体验证的siRNA序列。siRNA用于降低抗体的预期靶的表达，所述抗体用于检测生物标志物。给出了在验证中使用的siRNA的序列。
对于WB测定法，在72小时收获经转染的细胞，并且用补充有Halt蛋白酶抑制剂混合物(ThermoScientific)的PierceRIPA缓冲液(ThermoScientific)进行裂解。使用PierceBCA试剂(ThermoScientific)测量蛋白质浓度。将样品调整至相等蛋白质浓度，并且随后与样品缓冲液(BostonBioProducts)混合，并且在预制CriterionTGX4–15％SDS-PAGE凝胶(Bio-Rad)上运行。使用IBlot仪器(LifeTechnologies)，将样品转移到PVDF或硝酸纤维素膜上，并且在4℃下用抗体免疫印迹过夜，随后与第二小鼠或兔MAb(SigmaAldrich)一起温育。将印迹用SuperSignalWestFemto试剂(ThermoScientific)显色，并且通过暴露于FluorChemQ系统(ProteinSimple)进行显现。
对于IHC测定法，在转染后72小时，将在12孔板中的盖玻片上生长的细胞用甲醇在冰上固定20分钟。随后用0.2％TritonX-100在冰上进行10分钟渗透化处理。根据制造商的说明书，UltraVisionLPDetectionSystemHRPPolymer/DABPlusChromogenKit(ThermoScientific)用于后续IHC测定法。
通过SMAD4阳性细胞系PC3和SMAD4阴性细胞系BxPC3的WB和IHC测定法，验证SMAD4抗体。通过首次用于幼稚和用LY294002处理的DU145细胞的WB和IHC，验证磷酸-S6抗体。
细胞增殖测定法
将HeLa细胞用两种非靶向siRNA以及对于HSPA9特异性的si9-11瞬时转染(对于siRNA序列的细节，参见表19)。在转染后48小时将细胞重新铺平板，并且以1000细胞/孔一式三份种植到96孔板中。在重新铺平板后0、24、72和120小时，根据制造商的说明书，使用LuminescentCellViabilityKit(Promega)监控细胞增殖。
克隆形成测定法
在转染后48小时，将HeLa细胞以500细胞/孔在具有2ml细胞培养基的6孔板中重新铺平板。在铺平板后7天，将细胞用结晶紫溶液(Sigma)固定。使用在FluorChemQ系统(ProteinSimple)中的AlphaView软件捕获每种细胞的图像，并且使用ImageJ软件进行加工。
细胞活力测定法
在转染后120小时收获HeLa细胞。使用胰蛋白酶收集细胞。将来自12孔板的每个孔的细胞沉淀物悬浮于500μl细胞培养基中。将细胞悬浮液(95μl)与5μl溶液5(VB-48/PI/AO)混合，并且将30μl混合物装载到NC-SlideA2(两者均来自ChemoMetec)上。根据制造商的说明书，通过NucleoCounterNC-3000TM(ChemoMetec)测量细胞活力。
半胱天冬酶测定法
使用胰蛋白酶在siRNA转染后120小时收获HeLa细胞。将细胞以2×106细胞/ml悬浮。将93μl细胞悬浮液的等分试样与5μl稀释的FLICA试剂(ImmunoChemistryTechnologies)和2μlHoechst33342(LifeTechnologies)混合。将混合物在37℃下温育1小时。将HeLa细胞用1×细胞凋亡缓冲液(ImmunoChemistryTechnologies)洗涤两次。将细胞沉淀物悬浮于100μl1×细胞凋亡缓冲液和2μl碘化丙啶中。将30μl混合物等分试样装载到NC-SlideA2上，并且使用NucleoCounterNC-3000软件读数用于半胱天冬酶测定。对于FLICA染色阳性的细胞计数为凋亡细胞。
HSPA9(致死蛋白)的鉴定
对于Leica“抗DCC”抗体靶的鉴定(图37)，执行制备型免疫沉淀。用添加有蛋白酶抑制剂的5mlRIPA缓冲液(ThermoScientific)收获十个汇合A549细胞的p100平板。将细胞裂解物以14,000rpm、5分钟离心下来；将上清液在80℃下加热5分钟，随后在冰上冷却，并且再次以14,000rpm、5分钟离心下来。收集上清液，并且在添加50μl具有2μg预结合的“抗DCC”抗体的蛋白A/G珠(ThermoScientific)后，在4℃下伴随摇动温育2小时。将珠用TBS+1％TritonX100洗涤三次，并且与30μl1×SDS-PAGE装载缓冲液一起煮沸。将上清液装载到10％SDS-PAGE凝胶上，并且在标准SDS-PAGE条件下分离。将凝胶用银染色试剂盒染色用于质谱法(ThermoScientific)；切割特异性条带，用胰蛋白酶消化，并且在TaplinMassSpectrometryFacility(HarvardMedicalSchool)处实施MS/MS测序质谱法。将鉴定的肽与人类蛋白质参考数据库比对。所鉴定的蛋白质HSPA9如所述的进一步验证。
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实施例7：用于区分有利与不利前列腺癌的蛋白质组学原位活组 织检查测试的临床验证
概述
在活组织检查取样后测定前列腺癌侵袭性和适当疗法。目前的临床和病理学参数不足以用于准确的风险预测，主要导致过度治疗，以及针对治愈性疗法的机会错失。
用于预测前列腺病理学的完整组织活组织检查的8生物标志物蛋白质组学测定法在具有匹配的前列腺切除术样本的381个患者活组织检查的研究中进行限定，并且在后续276个患者病例的不知情形式研究中加以验证。相对于关于风险分类的目前标准护理(SOC)测定了基于前列腺切除术区别病理学‘有利’相对‘不利’疾病特征谱的能力。
验证研究满足其两个预定义终点，从而将有利与不利病理学分离(AUC，0.68，P<0.0001，比值比＝20.9)。分别基于10％和5％的‘假阴性’和‘假阳性’比率，限定有利(风险得分≤0.33)和不利(风险得分>0.80)患者类别。在风险得分≤0.33时，在极低和低风险NCCN以及低风险D’Amico组中针对有利患者的预测值分别为95％、81.5％和87.2％，高于SOC风险组自身(分别为80.3％、63.8％和70.6％)。在所有风险组中在风险得分>0.8时，针对不利患者的预测值为76.9％。增加的风险得分与在所有风险组中减少的有利病例频率关联。净重新分类指数对于NCCN为0.34(P<0.00001)，并且对于D’Amico为0.24(P＝0.0001)。
8生物标志物测试为SOC风险分层系统提供了个体化、独立和补充的信息，并且可以帮助在活组织检查时的临床决策制定。
引言
在2014年，在美国将存在估计的233,000例新的前列腺癌诊断。1大多数患者具有早期、临床局限性疾病。1-5考虑到前列腺癌的显著异质性和关于其过度治疗的担忧，6-8重要的是在活组织检查后和在确定性治疗前，区别具有良好预后的无痛感病例与具有弱存活的更侵袭性病例。9通过针吸活组织检查获得的组织的病理学评估是证实前列腺癌诊断和测定患者的风险类别两者必需的。10已开发了组合可用的临床和病理学参数的许多分类系统。9,11然而，所有分类系统均为不完美的，并且无一设计来归因体化风险得分。12-14
大约25-30％在诊断时视为具有低风险疾病的患者随后具有其肿瘤病理状态级别上调。14-16事实上，在分析根治性前列腺切除术组织后，显著比例的患者将具有来自初始‘活组织检查’格里森得分的级别上调或下调至更准确的‘手术’或病理学格里森得分。16这些修订可能反映初始活组织检查取样误差，17或肿瘤分级中的病理学家不一致，18这两者均可促成疾病的过度治疗或治疗不足。7存在对于针吸活组织检查样品中格里森模式4的过度调用或调用不足的特别的担忧，1916,20,21并且持续需要能够在活组织检查上具有低至中间级别疾病的患者中测定癌症是局限于器官的，还是伴随最终的转移潜力的非局限于器官。
在鉴定告知临床风险预后的遗传标志物中已取得进展，一个此类例子是用于预测死亡风险的细胞周期进展基因集合的表达。22-25还已集中于鉴定原位蛋白质生物标志物，其在肿瘤异质性的情况下，允许来自最侵袭性肿瘤区域的测量，即使仅来自少数癌细胞。26-28使用定量多路蛋白质组学原位成像(QMPI)方法，我们在大型临床独立研究中鉴定了定制为对取样误差抗性的12种活组织检查生物标志物候选物，其预测前列腺病理学侵袭性和致死结果两者(参见实施例6和下文补充附录)。
此处报道了来源于两个分离的临床活组织检查研究中的这12种标志物的八生物标志物标志的模型开发和后续不知情验证，所述两个研究各自具有匹配的注释前列腺切除术样本。第一项研究设计为通过逻辑回归(训练-测试)分析限定且锁定生物标志物标志模型和QMPI测定法(ProMarkTM)以获得针对潜在疾病侵袭性的风险得分。不知情的临床验证研究评估活组织检查测定法在前列腺切除术时预测临床上相关的有利相对于不利病理学的二分终点的能力。通过测定法和风险得分提供的差异信息与两个风险分层系统D’Amico系统和NCCN指南类别相比较，9,11并且考虑其在预测个别患者的预后中提供另外准确度作为决策制定中的潜在帮助的潜力。
方法
针对蛋白质原位测量的QMPI方法如下文补充附录中所述。
临床模型构建研究和测定法锁定
设计使用活组织检查病例组织样品的非介入、回顾性临床模型开发研究，以限定在12种先前鉴定的显示与前列腺病理学侵袭性和致死结果两者关联的生物标志物候选物中的最佳标志物子集标志。研究目标是基于显示在前列腺切除术时具有手术格里森3+3的肿瘤不转移的研究，限定能够区别具有手术格里森3+3和≤T3a(“GS6”)相对于手术格里森≥3+4或非局限性>T3a、N或M(“非GS6”)的前列腺病理状态的模型。29,30研究方案由机构审查委员会(InstitutionalReviewBoards)(IRBs)批准，并且获得患者知情同意书或相应地放弃。
为了开发强力的测定法，召募代表典型美国患者队列的多重机构：UrologyAustin、ChesapeakeUrologyAssociates、ClevelandClinic、MichiganUrology和FolioBiosciences。活组织检查样品入选/淘汰标准匹配在测定法的常规临床使用过程中适当的那些(补充附录)。排除具有活组织检查格里森≥4+3的患者，除了有限数目的已通过两个专家病理学家不一致地分级为3+4和4+3的活组织检查之外。注释包括关于匹配的活组织检查的信息，并且需要前列腺切除术病理学报告。所有样品在实验室加工过程中均为不知情的。
生物标志物标志作为逻辑回归模型进行优化，以估计通过独立的训练和测试集的自举分析测定的“非GS6”概率。模型通过接受者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)进行表征，并且通过增加的Akaike信息准则(AIC)值、31在训练集上减少的AUC值和在测试集上减少的AUC值进行分选。标志物使用的频率随后在10％最高排序的模型中进行测定，以完成生物标志物集合。计算风险得分(0和1之间的连续数目)，以估计“非GS6”病理学的可能性。执行灵敏度分析以证实限定的锁定测定法。
临床验证研究
进行非介入、不知情、前瞻性设计、回顾性收集的临床研究，以验证八标志物活组织检查测定法单独且相对于关于患者风险分类的目前护理标准(SOC)，在预测前列腺病理学中的表现。队列包含来自在UniversityofMontreal，Canada管理的患者的具有匹配的前列腺切除术注释的活组织检查样品。知情同意书标准和IRB批准步骤与临床开发研究相同。入选标准是具有集中的格里森得分3+3或3+4(还包括具有3+4和4+3的通过两个专家病理学家的不一致分级的活组织检查)，以及具有病理学TNM分期、PSA水平和格里森得分的匹配前列腺切除术。测定法的表现使用关于诊断风险得分的ROC和相应AUC进行评价。
针对前列腺病理学的两个共同主要终点通过来源于活组织检查测定法的风险得分进行验证，如通过AUC评价的：
1.‘有利’病理学-手术格里森≤3+4和局限于器官的疾病(≤T2)
相对于
‘不利’病理学-手术格里森≥4+3或非局限于器官的疾病(T3a、T3b、N或M)
和
2.“GS6”病理学-手术格里森3+3和局限性疾病(≤T3a)相对于
“非GS6”病理学-手术格里森≥3+4或非局限性疾病(T3b、N或M)
在验证研究自始至终选择有利相对于不利病理学用于最终患者分类。它反映下述增加的认识：具有最低限度格里森4模式的局限于器官的疾病可能保持无害，具有比更高级别(占优势的格里森4模式)或非局限于器官的疾病显著更佳的长期预后。30,32,33
次要分析包括针对风险得分的最高四分位数相对于最低四分位数的比值比(OR)，以及针对连续量表的OR(点估计)。我们使用阳性预测值(PPV)，比较了来自我们的诊断测试的风险结果与如通过D’Amico和NCCN限定的SOC风险分类类别9,11。如通过Pencina描述的，完成净重新分类指数(NRI)的限定和统计分析。34
对于两个临床研究的统计计划，参见补充附录。
结果
临床模型构建研究和测定法锁定
在模型开发研究中包括的381个患者的肿瘤特征显示于表20中。图39A-C举例说明了模型优化过程。图39A显示了与评估的生物标志物相关的单变量OR。评价模型表现，并且鉴定几种高表现模型，例如0.79(95％置信区间[CI]，0.72-0.84)的测试AUC。图39B显示了针对具有最多八种生物标志物的所有模型所得到的生物标志物频率。所得到的锁定标志显示于图39C中。
表20.在临床开发和验证研究中的临床患者队列的概括(在活组织检查时和在根治性前列腺切除术/手术格里森时的肿瘤特征)。
注意到，在临床验证研究中，对于八个患者丢失手术前PSA，并且对于12个患者丢失临床分期。
SD指示标准差。
*排除具有在诊断时报告为791和600ng/ml的PSA的两个患者，其是最新诊断患者非典型的。
包括仅注释为T3的四个样品
临床验证研究
表20概括了在临床验证研究中的276个样品的肿瘤特征。如表21中所示，研究满足其两个共同主要终点，并且就两个终点验证测定法(有利病理学：AUC，0.68[95％CI，0.61-0.74]；P<0.0001；针对风险得分的OR，20.9/单位变化；“GS6”病理学：AUC，0.65[95％CI，0.58-0.72]；P<0.0001；针对风险得分的OR，12.6/单位变化)。进一步的细节显示于图41和42中。
表21.临床验证研究：对于八生物标志物标志，针对两个共同主要终点的预后测试表现。
我们具有足够的注释以根据NCCN和D’Amico标准分类256个病例。生物标志物标志测定法在该队列上针对有利病理学的表现显示于图43中，并且类似于完全队列(AUC，0.69[95％CI，0.63-0.76]；P<0.0001；针对风险得分的OR，26.2/单位变化)。
图40显示了与风险得分相关的灵敏度和特异度作为针对有利/不利疾病的预后帮助，以及在NCCN和D’Amico类别中的风险得分分布。图40A显示了基于分子标志，在该研究群体中鉴定的有利类别的例子。针对有利类别0.33的阈值导致90％(95％CI，82％-94％)的灵敏度(P[风险得分>0.33|不利病理学])，其将具有不利病理学的患者中的假阴性比率限制为10％(95％CI，6％-18％)。类似地，在图40B中，不利类别可以在该研究群体中以95％(95％CI，90％-98％)的特异度(P[风险得分≤0.80|有利病理学])进行鉴定，其将具有有利病理学的患者中的假阳性比率限制为5％(95％CI，2％-10％)。
我们评价了风险得分的预测值，并且将其与NCCN和D’Amico风险类别的那些相比较(表22)。用于在风险得分≤0.33时鉴定有利疾病的PPV为83.6％(特异度，90％)。相反，在风险得分>0.80时，23.1％的患者患有有利疾病(即76.9％患有不利疾病)。基于研究群体，这转变为具有风险得分≤0.33或>0.8的患者的39％，其中81％得到正确鉴定。
表22.临床验证研究。针对具有NCCN和D’Amico风险类别的有利病理学的生物标志物测定法的预测值比较。
CI指示置信区间；NCCN指示美国国家综合癌症网络；PPV指示阳性预测值；SOC指示护理标准。
我们进一步检查在每个NCCN类别内根据我们的风险得分患有有利疾病的患者分布(图40C和表22)。使用≤0.33的风险得分，针对有利疾病的PPV对于NCCN中间风险为75％，对于NCCN低风险为81.5％，并且对于NCCN极低风险为95％(图40C和表22)。这与对于单独的NCCN风险类别获得的PPV形成对比，其对于中间风险为40.9％，对于低风险为63.8％，并且对于极低风险为80.3％(表22)。因此，相对于NCCN风险类别，风险得分提供针对个别患者的另外信息。如图40D中所示，增加的风险得分与每个NCCN类别内减少的有利病例频率关联。当与D’Amico类别相比较时，获得相似结果(图40E和图40F)。
为了证实在SOC背景下的风险得分的益处，我们针对有利和不利类别相对于NCCN和D’Amico执行NRI分析。使用表22中所示的潜在数据，我们发现NRI对于NCCN为0.34(P<0.00001；95％CI，0.20-0.48)，并且对于D’Amico为0.24(P＝0.0001；95％CI，0.12-0.35；参见图44)。这证实测试为通过单独的SOC分类系统所提供的能力提供了另外的区分能力。
讨论
此处报道了两个临床研究的结果：开发研究和不知情验证研究，其对具有匹配的前列腺切除术样本的前列腺癌活组织检查样品执行。这些研究证实新型蛋白质组学多生物标志物测定法的准确度和有效性，其可以在活组织检查时用于预测高风险特征在前列腺中的存在，以及前列腺外扩散和转移的潜力。在我们的第一项模型构建研究中，由先前显示为预测肿瘤侵袭性和致死率的12种候选生物标志物测定优化的八生物标志物标志。研究限定八生物标志物标志，并且所得到的个体化风险得分基于用于预测“非GS6”前列腺病理学的逻辑回归分析(手术格里森得分≥3+4或非局限性的>T3a、N、M)。
第二项不知情临床验证研究满足其独立地预测临床和病理学参数的前列腺病理状态的两个共同主要临床终点，如下：“GS6”病理学，定义为手术格里森3+3＝6和≤T3a，以及‘有利’病理学，定义为局限于器官的前列腺病理学(手术格里森3+3或3+4；≤T2)。进一步地，我们的风险得分增加相对于SOC风险分层的差异性和补充性个体化信息。
近期研究指示针对患有局限于器官的格里森3+4疾病的患者的长期存活显著优于患有非局限于器官的疾病的患者或具有占优势的格里森模式4或更高的肿瘤，19,32,33并且针对前面一组的延期疗法不显著改变长期结果。35-37目前，大多数风险分层系统不区分格里森7活组织检查，并且通常视为用于主动监督的候选人的患者属于‘极低风险’或‘低风险’组，其仅含有活组织检查格里森得分≤6。3,9然而，当与手术格里森相比较时，约25％的格里森级别3+4活组织检查是‘级别下调的’，并且相似百分比的格里森级别3+3活组织检查是‘级别上调的’，主要是由于活组织检查取样误差和病理学家不一致。1620基于这点，针对基于分子证据的测试的需要对于格里森级别3+3和3+4活组织检查很高，21并且我们已开发了我们的测试用于这种指示。开发了有利终点以区分有利病例(手术格里森3+3或3+4、局限于器官的[≤T2]肿瘤)与不利病例(前列腺外扩散[T3a]、精囊侵入[T3b]、淋巴结或远处转移、或占优势的格里森4模式或更高)。
我们的研究显示在测试风险得分≤0.33时，在极低和低风险NCCN以及低风险D’Amico组中用于鉴定具有有利病理学的患者的预测值分别为95％、81.5％和87.2％，这些值高于通过这些风险组单独实现的值。此外，测试还能够鉴定可能不适合于主动监督的具有不利病理学的患者，伴随高置信度，对于两个风险分层系统，在所有风险组中在风险得分>0.8时具有76.9％的预测值。针对个别患者基于测试的患者分层的意义通过下述事实举例说明：增加的测试风险得分与在所有风险分层组中观察到的有利病例频率减少关联。相对于SOC通过风险得分提供的另外信息的量度通过NRI分析提供。我们发现NRI对于NCCN为0.34(P<0.00001；95％CI，0.20-0.48)，并且对于D’Amico为0.24(P＝0.0001；95％CI，0.12-0.35)。在具有有利和不利病理学的患者中，分别78％和76％被正确调整至比由NCCN风险组自身显而易见的更低和更高风险(图44)。
在实施方案中，使用多路蛋白质组学成像平台(补充附录)，基于完整组织中的八种生物标志物的定量测量，生成我们的风险得分。这种方法具有与基于基因表达的测试(其中组织在分析前进行匀浆化)相比较的几个潜在优点。首先，它使得测试对于良性组织相对于肿瘤组织的比率中的变异是稳健的，因为它不干扰来自完整癌细胞的标志物测量。此外，测试允许整合分子和形态信息，并且仅需要少数癌细胞。
我们模型中的八种生物标志物包含12种生物标志物候选物的子集，所述子集鉴定为尽管存在组织取样误差仍预测侵袭性和致死结果两者。这指示在本发明的研究中使用的病理学终点也对于长期结果相关，如已经报道的。29,32,33
总之，我们的结果证实了这种临床生物标志物活组织检查测试用于前列腺癌的个体化预后的效用，及其对治疗选择的影响。相对于其中预后能力目前有限的SOC，提供针对个别患者的差异信息的能力使得它成为临床决策制定中的有用帮助。
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补充材料
图41A-E、图42A-C、图43A-C、图44A-B和图45A-C提供了进一步信息，并且在上文附图描述中描述。
用于定量多路蛋白质组学成像(QMPI)的方法
使用针对完整组织的定量多路蛋白质组学成像(QMPI)平台，分析福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)前列腺癌活组织检查组织载玻片，所述平台整合在个别载玻片水平下来自肿瘤上皮的形态对象识别和分子生物标志物测量。抗体验证、染色方案、图像采集、图像分析和实验间对照在下文描述。
测定法描述和生物标志物-抗体验证
如图45中所述的染色方案中概括的，使用四个载玻片执行测定法。
使用三种(三重)生物标志物各自的四种组合：A)PLAG1、SMAD2、ACTN1；B)VDAC1、FUS、SMAD4；C)pS6、YBX1、DERL1；D)PDSS2、CUL2、DCC。使用的一抗各自对于特异性进行验证，并且发现PLAG1不足够特异性；它因此从潜在标志中排除。每个三重测定法由初始封闭步骤随后五个连续温育步骤组成，伴随在两者之间的适当洗涤。
1)与抗生物标志物2(兔单克隆抗体[MAb])和抗生物标志物3(小鼠MAb)的混合物一起温育。
2)与Zenon抗小鼠IgGFab–辣根过氧化物酶(HRP)和Zenon抗兔IgGFab–生物素的混合物一起温育。
3)与缀合至FITC的抗生物标志物1MAb一起温育。
4)用抗FITCMAb–Alexa568、链霉抗生物素蛋白–Alexa633、抗HRP–Alexa647、抗CK8–Alexa488、抗CK18–Alexa488、抗CK5–Alexa555和抗Trim29–Alexa555的混合物的显现步骤。
5)与DAPI的短暂温育用于核染色。
在末次洗涤后，将载玻片用ProlongGold(LifeTechnologies)固定，加入盖玻片，并且在图像采集前，将载玻片贮存于-20℃下过夜。
载玻片加工和染色方案
大多数载玻片加工和染色步骤是自动化的，以确保最大限度重现性。首先使用StainMate(ThermoScientific)，使切片在二甲苯/梯度醇中去石蜡。使用PT模块(ThermoScientific，Waltham，MA)用0.05％柠檬酸酐溶液在95℃下抗原修复45分钟。使用上文描述的测定法形式，用Autostainers360或720(Thermo)染色载玻片。活组织检查病例样品以25块载玻片/Autostainer的分批进行染色，对于每种三重测定法形式，具有一个细胞系组织微阵列(TMA)对照载玻片(参见下文)。
图像采集
对于每个三重测定法，一个特异性Vectra智能载玻片分析系统(200载玻片容量)用于定量多路免疫荧光图像采集，使用优化的DAPI、FITC、TRITC和Cy5长通过滤器立方体，其允许最大限度光谱分辨率和最低限度的荧光团之间的渗漏。为了使变异降到最低，在用X-CiteOpticalPowerMeasurementSystem(LumenDynamics)的每次运行之前，校准针对每种系统的光强度。分别使用Vectra2.0、Inform1.3和Nuance2.0软件(PerkinElmer)用于图像采集、组织发现算法的生成和光谱文库的开发。
在图像采集过程中，首先，使用4×单色DAPI过滤图像的拼凑来采集整个载玻片的图像。在图像采集方案中包括的初始组织发现算法随后用于定位组织，其然后进行图像的重新采集，这次使用4×DAPI和4×FITC单色过滤器两者。随后应用方案中包括的最后组织发现算法，以确保采集含有足够组织量的所有20×视野的图像(图45B)。
在图像采集方案中包括的算法将数据收集限制于含有足够组织量的那些20×视野。在测定法中使用的多光谱采集方案具有DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器的连续曝光。在图像采集完成后，图像立方体自动储存于服务器上，用于后续自动解混成个别通道且通过Definiens软件加工。
用于风险得分模型的图像分析和输入
我们使用DefiniensDeveloperXD(DefiniensAG，Munich，德国)开发了图像分析算法，用于肿瘤鉴定和生物标志物定量。该软件用于描绘活组织检查组织的恶性和良性上皮区域，允许在恶性区域上专一地测量标志物强度。对于每种活组织检查样品，扫描几个20×图像视野，并且使用CRiVectra(PerkinElmer)保存为多光谱图像文件。对于给定载玻片扫描多达140个个别视野，以便采集来自整个组织样品的图像。一式三份的十一种不同FFPE细胞系和一式两份的两个前列腺切除术组织样品用作分离的质量控制载玻片阵列上的对照。对于每个1.0-mm质量控制细胞系或组织核心，扫描两个20×图像视野(即对于每种细胞系对照总共六个图像和对于每种组织对照四个图像)。使用inForm(PerkinElmer)和定制的光谱文库，将Vectra多光谱图像文件首先转换成多层TIFF形式，并且随后使用BioFormats(OME)转换为单层TIFF文件。使用定制输入算法，将单层TIFF文件输入到Definiens工作空间内，使得对于每个活组织检查样品和每个质量控制，将所有图像视野TIFF文件作为单个“场景”内的“地图”装载和分析。
在我们的图像分析算法中自适应阈值用于限定针对每个个别组织样品中的组织区段的荧光强度截断。基于在质量控制载玻片上预定义的核心坐标，细胞系对照核心在Definiens算法中与前列腺切除术组织核心自动区别。使用荧光上皮和基底细胞标志物连同DAPI，将活组织检查和组织核心样品分段，用于分类成上皮细胞、基底细胞和间质，并且进一步区室化成细胞质和核。基于基底细胞和邻近上皮结构之间的相关特征结合对象相关特征例如腺厚度，将个别腺区域分类为恶性或良性。上皮标志物不存在于所有细胞系中，因此使用自体荧光通道，将细胞系对照分段成组织相对本底。通过严格的多参数质量控制算法，去除具有假象染色、不足够的上皮组织或失焦图像的视野。
上皮标志物、DAPI、ACTN、VDAC和DERL1强度在恶性和非恶性上皮区域中作为质量控制测量进行定量。生物标志物值也在恶性和非恶性上皮区域的细胞质、核和全细胞中进行测量。针对每个亚细胞区室的平均生物标志物像素强度跨越具有可接受的质量参数的每个个别地图求平均值，并且输出地图特异性值用于生物信息学分析。由合适的值计算加权平均值，以产生针对组织样品上的每种标志物的单一强度；对于载玻片具有在第40至第90百分位数中的平均强度值的20×视野或涵盖大肿瘤面积的20×视野视为合适的。这提供了用于风险得分模型的输入。
实验间对照：质量控制程序
细胞系对照用作分批对照。还对接受的所有活组织检查病例样品实施多步质量控制程序，充当包括或排除来自临床研究的样品的手段。对于染色和染料的存在，目视且用荧光显微镜检查具有切片的未加工的载玻片。从进一步分析中排除在活组织检查组织中具有显著量的荧光染料的样品，因为它们会处于临床病理学实验室实践过程中。接下来，来自每个活组织检查病例样品的一块载玻片用ACTN1、CK8/18–Alexa488和CK5/Trim29手动染色。手动检查染色的载玻片；如果组织很小或断裂、具有很少的肿瘤组织或对于上述三种标志物中的任一种弱染色，则病例样品未通过质量控制。
在多路免疫荧光染色后，手动检查所有20×图像，并且从进一步分析中排除含有假的/非前列腺组织(例如肠组织)的那些视野。一旦图像分析已分离恶性和良性组织，就弃去具有不足够良性或肿瘤区域的病例。还排除ACTN1、DERL1或VDAC水平低于预定最小值的病例。
染色对照开发和应用：细胞系对照
用研究中使用的每种标志物染色三十种细胞系，基于范围、信号强度和最低变异性，从其中选择11种细胞系以成为染色对照。
细胞系在预先准备的培养基中生长至具有一致性的70％-80％汇合，并且用福尔马林在板上固定。将细胞刮取且离心下来，并且由细胞沉淀物的细胞/histogel悬浮液准备细胞盘，将其石蜡包埋。使用这些沉淀物，生成TMA块用于重现性研究、主要混合物的验证、以及作为常规样品染色过程中的对照载玻片。
来自细胞系TMA的一个切片/载玻片用每个活组织检查载玻片的分批进行加工。染色、图像采集以及数据提取和分析与之前对于个别三重测定法形式描述的完全相同的方法执行。
临床研究：统计计划
在临床研究数据可用于验证研究中的分析之前，将统计分析计划(SAP)锁定，记录且与外部生物统计学专家通信。根据SAP，针对共同主要结果的所有P值在乘以二之后报告，以反映邦弗朗尼校正。使用二项式精确检验估计AUCCI和P值，而AUC标准误差使用通过DeLong等人19881描述的方法进行测量。来自逻辑回归的OR包括在SAP以及针对阳性预测值、灵敏度和特异度使用确切二项式CI与护理标准的比较中。在其它方面不涉及测定法开发的统计学家执行统计分析。
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序列表
SEQIDNO：1—ACTN1(NP_001093.1)
MDHYDSQQTNDYMQPEEDWDRDLLLDPAWEKQQRKTFTAWCNSHLRKAGTQIENIEEDFRDGLKLMLLLEVISGERLAKPERGKMRVHKISNVNKALDFIASKGVKLVSIGAEEIVDGNVKMTLGMIWTIILRFAIQDISVEETSAKEGLLLWCQRKTAPYKNVNIQNFHISWKDGLGFCALIHRHRPELIDYGKLRKDDPLTNLNTAFDVAEKYLDIPKMLDAEDIVGTARPDEKAIMTYVSSFYHAFSGAQKAETAANRICKVLAVNQENEQLMEDYEKLASDLLEWIRRTIPWLENRVPENTMHAMQQKLEDFRDYRRLHKPPKVQEKCQLEINFNTLQTKLRLSNRPAFMPSEGRMVSDINNAWGCLEQVEKGYEEWLLNEIRRLERLDHLAEKFRQKASIHEAWTDGKEAMLRQKDYETATLSEIKALLKKHEAFESDLAAHQDRVEQIAAIAQELNELDYYDSPSVNARCQKICDQWDNLGALTQKRREALERTEKLLETIDQLYLEYAKRAAPFNNWMEGAMEDLQDTFIVHTIEEIQGLTTAHEQFKATLPDADKERLAILGIHNEVSKIVQTYHVNMAGTNPYTTITPQEINGKWDHVRQLVPRRDQALTEEHARQQHNERLRKQFGAQANVIGPWIQTKMEEIGRISIEMHGTLEDQLSHLRQYEKSIVNYKPKIDQLEGDHQLIQEALIFDNKHTNYTMEHIRVGWEQLLTTIARTINEVENQILTRDAKGISQEQMNEFRASFNHFDRDHSGTLGPEEFKACLISLGYDIGNDPQGEAEFARIMSIVDPNRLGVVTFQAFIDFMSRETADTDTADQVMASFKILAGDKNYITMDELRRELPPDQAEYCIARMAPYTGPDSVPGALDYMSFSTALYGESDL(SEQIDNO：1).
SEQIDNO：2—ACTN1(NM_001102.3)
TCTGCCCCTTCCCCCCGCCCCCGCCCGCCTCGGCTCCCGCAGCGCTAGTGTGTCCGCCTAGTTCAGTGTGCGTGGAGATTAGGTCCAAGCGCCCGCCCAGAGGCAGGCAGTCCGCGAGCCCAGCCGCCGCTGTCGCCGCCAGTAGCAGCCTTCGCCAGCAGCGCCGCGGCGGAACCGGGCGCAGGGGAGCGAGCCCGGCCCCGCCAGCCCAGCCCAGCCCAGCCCTACTCCCTCCCCACGCCAGGGCAGCAGCCGTTGCTCAGAGAGAAGGTGGAGGAAGAAATCCAGACCCTAGCACGCGCGCACCATCATGGACCATTATGATTCTCAGCAAACCAACGATTACATGCAGCCAGAAGAGGACTGGGACCGGGACCTGCTCCTGGACCCGGCCTGGGAGAAGCAGCAGAGAAAGACATTCACGGCATGGTGTAACTCCCACCTCCGGAAGGCGGGGACACAGATCGAGAACATCGAAGAGGACTTCCGGGATGGCCTGAAGCTCATGCTGCTGCTGGAGGTCATCTCAGGTGAACGCTTGGCCAAGCCAGAGCGAGGCAAGATGAGAGTGCACAAGATCTCCAACGTCAACAAGGCCCTGGATTTCATAGCCAGCAAAGGCGTCAAACTGGTGTCCATCGGAGCCGAAGAAATCGTGGATGGGAATGTGAAGATGACCCTGGGCATGATCTGGACCATCATCCTGCGCTTTGCCATCCAGGACATCTCCGTGGAAGAGACTTCAGCCAAGGAAGGGCTGCTCCTGTGGTGTCAGAGAAAGACAGCCCCTTACAAAAATGTCAACATCCAGAACTTCCACATAAGCTGGAAGGATGGCCTCGGCTTCTGTGCTTTGATCCACCGACACCGGCCCGAGCTGATTGACTACGGGAAGCTGCGGAAGGATGATCCACTCACAAATCTGAATACGGCTTTTGACGTGGCAGAGAAGTACCTGGACATCCCCAAGATGCTGGATGCCGAAGACATCGTTGGAACTGCCCGACCGGATGAGAAAGCCATCATGACTTACGTGTCTAGCTTCTACCACGCCTTCTCTGGAGCCCAGAAGGCGGAGACAGCAGCCAATCGCATCTGCAAGGTGTTGGCCGTCAACCAGGAGAACGAGCAGCTTATGGAAGACTACGAGAAGCTGGCCAGTGATCTGTTGGAGTGGATCCGCCGCACAATCCCGTGGCTGGAGAACCGGGTGCCCGAGAACACCATGCATGCCATGCAACAGAAGCTGGAGGACTTCCGGGACTACCGGCGCCTGCACAAGCCGCCCAAGGTGCAGGAGAAGTGCCAGCTGGAGATCAACTTCAACACGCTGCAGACCAAGCTGCGGCTCAGCAACCGGCCTGCCTTCATGCCCTCTGAGGGCAGGATGGTCTCGGACATCAACAATGCCTGGGGCTGCCTGGAGCAGGTGGAGAAGGGCTATGAGGAGTGGTTGCTGAATGAGATCCGGAGGCTGGAGCGACTGGACCACCTGGCAGAGAAGTTCCGGCAGAAGGCCTCCATCCACGAGGCCTGGACTGACGGCAAAGAGGCCATGCTGCGACAGAAGGACTATGAGACCGCCACCCTCTCGGAGATCAAGGCCCTGCTCAAGAAGCATGAGGCCTTCGAGAGTGACCTGGCTGCCCACCAGGACCGTGTGGAGCAGATTGCCGCCATCGCACAGGAGCTCAATGAGCTGGACTATTATGACTCACCCAGTGTCAACGCCCGTTGCCAAAAGATCTGTGACCAGTGGGACAATCTGGGGGCCCTAACTCAGAAGCGAAGGGAAGCTCTGGAGCGGACCGAGAAACTGCTGGAGACCATTGACCAGCTGTACTTGGAGTATGCCAAGCGGGCTGCACCCTTCAACAACTGGATGGAGGGGGCCATGGAGGACCTGCAGGACACCTTCATTGTGCACACCATTGAGGAGATCCAGGGACTGACCACAGCCCATGAGCAGTTCAAGGCCACCCTCCCTGATGCCGACAAGGAGCGCCTGGCCATCCTGGGCATCCACAATGAGGTGTCCAAGATTGTCCAGACCTACCACGTCAATATGGCGGGCACCAACCCCTACACAACCATCACGCCTCAGGAGATCAATGGCAAATGGGACCACGTGCGGCAGCTGGTGCCTCGGAGGGACCAAGCTCTGACGGAGGAGCATGCCCGACAGCAGCACAATGAGAGGCTACGCAAGCAGTTTGGAGCCCAGGCCAATGTCATCGGGCCCTGGATCCAGACCAAGATGGAGGAGATCGGGAGGATCTCCATTGAGATGCATGGGACCCTGGAGGACCAGCTCAGCCACCTGCGGCAGTATGAGAAGAGCATCGTCAACTACAAGCCAAAGATTGATCAGCTGGAGGGCGACCACCAGCTCATCCAGGAGGCGCTCATCTTCGACAACAAGCACACCAACTACACCATGGAGCACATCCGTGTGGGCTGGGAGCAGCTGCTCACCACCATCGCCAGGACCATCAATGAGGTAGAGAACCAGATCCTGACCCGGGATGCCAAGGGCATCAGCCAGGAGCAGATGAATGAGTTCCGGGCCTCCTTCAACCACTTTGACCGGGATCACTCCGGCACACTGGGTCCCGAGGAGTTCAAAGCCTGCCTCATCAGCTTGGGTTATGATATTGGCAACGACCCCCAGGGAGAAGCAGAATTTGCCCGCATCATGAGCATTGTGGACCCCAACCGCCTGGGGGTAGTGACATTCCAGGCCTTCATTGACTTCATGTCCCGCGAGACAGCCGACACAGATACAGCAGACCAAGTCATGGCTTCCTTCAAGATCCTGGCTGGGGACAAGAACTACATTACCATGGACGAGCTGCGCCGCGAGCTGCCACCCGACCAGGCTGAGTACTGCATCGCGCGGATGGCCCCCTACACCGGCCCCGACTCCGTGCCAGGTGCTCTGGACTACATGTCCTTCTCCACGGCGCTGTACGGCGAGAGTGACCTCTAATCCACCCCGCCCGGCCGCCCTCGTCTTGTGCGCCGTGCCCTGCCTTGCACCTCCGCCGTCGCCCATCTCCTGCCTGGGTTCGGTTTCAGCTCCCAGCCTCCACCCGGGTGAGCTGGGGCCCACGTGGCATCGATCCTCCCTGCCCGCGAAGTGACAGTTTACAAAATTATTTTCTGCAAAAAAGAAAAAAAAGTTACGTTAAAAACCAAAAAACTACATATTTTATTATAGAAAAAGTATTTTTTCTCCACCAGACAAATGGAAAAAAAGAGGAAAGATTAACTATTTGCACCGAAATGTCTTGTTTTGTTGCGACATAGGAAAATAACCAAGCACAAAGTTATATTCCATCCTTTTTACTGATTTTTTTTTCTTCTATCTGTTCCATCTGCTGTATTCATTTCTCCAATCTCATGTCCATTTTGGTGTGGGAGTCGGGGTAGGGGGTACTCTTGTCAAAAGGCACATTGGTGCATGTGTGTTTGCTAGCTCACTTGTCCATGAAAATATTTTATGATATTAAAGAAAATCTTTTGAAATGGCTGTTTTTTAAGGAAGAGAATTTATGTGGCTTCTCATTTTTAAATCCCCTCAGAGGTGTGACTAGTCTCTTTATCAGCACACACTTAAAAAATTTTTAATATTGTCTATTAAAAATAGGACAAACTTGGAGAGTATGGACAACTTTGATATTGCTTGGCACAGATGGTATTAAAAAAACCACACTCCTATGACAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQIDNO：2).
SEQIDNO：3—CUL2(NP_001185707.1)
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SEQIDNO：4—CUL2(NM_001198778)
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MASNDYTQQATQSYGAYPTQPGQGYSQQSSQPYGQQSYSGYSQSTDTSGYGQSSYSSYGQSQNTGYGTQSTPQGYGSTGGYGSSQSSQSSYGQQSSYPGYGQQPAPSSTSGSYGSSSQSSSYGQPQSGSYSQQPSYGGQQQSYGQQQSYNPPQGYGQQNQYNSSSGGGGGGGGGGNYGQDQSSMSSGGGSGGGYGNQDQSGGGGSGGYGQQDRGGRGRGGSGGGGGGGGGGYNRSSGGYEPRGRGGGRGGRGGMGGSDRGGFNKFGGPRDQGSRHDSEQDNSDNNTIFVQGLGENVTIESVADYFKQIGIIKTNKKTGQPMINLYTDRETGKLKGEATVSFDDPPSAKAAIDWFDGKEFSGNPIKVSFATRRADFNRGGGNGRGGRGRGGPMGRGGYGGGGSGGGGRGGFPSGGGGGGGQQRAGDWKCPNPTCENMNFSWRNECNQCKAPKPDGPGGGPGGSHMGGNYGDDRRGGRGGYDRGGYRGRGGDRGGFRGGRGGGDRGGFGPGKMDSRGEHRQDRRERPY(SEQIDNO：9)
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AGAAAATTTTGAAATTTATGTTATTTCAGCCCTTTTATGCTGGAGGTTGCAAATGTTTTGTGAATAATCAGACCAAAAATAAAAACAAAAAATGATTGACTTCAGTCATTCAGTAAGAA
(SEQIDNO：10)
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SEQIDNO：20—SMAD4(NM_005359)
ATGCTCAGTGGCTTCTCGACAAGTTGGCAGCAACAACACGGCCCTGGTCGTCGTCGCCGCTGCGGTAACGGAGCGGTTTGGGTGGCGGAGCCTGCGTTCGCGCCTTCCCGCTCTCCTCGGGAGGCCCTTCCTGCTCTCCCCTAGGCTCCGCGGCCGCCCAGGGGGTGGGAGCGGGTGAGGGGAGCCAGGCGCCCAGCGAGAGAGGCCCCCCGCCGCAGGGCGGCCCGGGAGCTCGAGGCGGTCCGGCCCGCGCGGGCAGCGGCGCGGCGCTGAGGAGGGGCGGCCTGGCCGGGACGCCTCGGGGCGGGGGCCGAGGAGCTCTCCGGGCCGCCGGGGAAAGCTACGGGCCCGGTGCGTCCGCGGACCAGCAGCGCGGGAGAGCGGACTCCCCTCGCCACCGCCCGAGCCCAGGTTATCCTGAATACATGTCTAACAATTTTCCTTGCAACGTTAGCTGTTGTTTTTCACTGTTTCCAAAGGATCAAAATTGCTTCAGAAATTGGAGACATATTTGATTTAAAAGGAAAAACTTGAACAAATGGACAATATGTCTATTACGAATACACCAACAAGTAATGATGCCTGTCTGAGCATTGTGCATAGTTTGATGTGCCATAGACAAGGTGGAGAGAGTGAAACATTTGCAAAAAGAGCAATTGAAAGTTTGGTAAAGAAGCTGAAGGAGAAAAAAGATGAATTGGATTCTTTAATAACAGCTATAACTACAAATGGAGCTCATCCTAGTAAATGTGTTACCATACAGAGAACATTGGATGGGAGGCTTCAGGTGGCTGGTCGGAAAGGATTTCCTCATGTGATCTATGCCCGTCTCTGGAGGTGGCCTGATCTTCACAAAAATGAACTAAAACATGTTAAATATTGTCAGTATGCGTTTGACTTAAAATGTGATAGTGTCTGTGTGAATCCATATCACTACGAACGAGTTGTATCACCTGGAATTGATCTCTCAGGATTAACACTGCAGAGTAATGCTCCATCAAGTATGATGGTGAAGGATGAATATGTGCATGACTTTGAGGGACAGCCATCGTTGTCCACTGAAGGACATTCAATTCAAACCATCCAGCATCCACCAAGTAATCGTGCATCGACAGAGACATACAGCACCCCAGCTCTGTTAGCCCCATCTGAGTCTAATGCTACCAGCACTGCCAACTTTCCCAACATTCCTGTGGCTTCCACAAGTCAGCCTGCCAGTATACTGGGGGGCAGCCATAGTGAAGGACTGTTGCAGATAGCATCAGGGCCTCAGCCAGGACAGCAGCAGAATGGATTTACTGGTCAGCCAGCTACTTACCATCATAACAGCACTACCACCTGGACTGGAAGTAGGACTGCACCATACACACCTAATTTGCCTCACCACCAAAACGGCCATCTTCAGCACCACCCGCCTATGCCGCCCCATCCCGGACATTACTGGCCTGTTCACAATGAGCTTGCATTCCAGCCTCCCATTTCCAATCATCCTGCTCCTGAGTATTGGTGTTCCATTGCTTACTTTGAAATGGATGTTCAGGTAGGAGAGACATTTAAGGTTCCTTCAAGCTGCCCTATTGTTACTGTTGATGGATACGTGGACCCTTCTGGAGGAGATCGCTTTTGTTTGGGTCAACTCTCCAATGTCCACAGGACAGAAGCCATTGAGAGAGCAAGGTTGCACATAGGCAAAGGTGTGCAGTTGGAATGTAAAGGTGAAGGTGATGTTTGGGTCAGGTGCCTTAGTGACCACGCGGTCTTTGTACAGAGTTACTACTTAGACAGAGAAGCTGGGCGTGCACCTGGAGATGCTGTTCATAAGATCTACCCAAGTGCATATATAAAGGTCTTTGATTTGCGTCAGTGTCATCGACAGATGCAGCAGCAGGCGGCTACTGCACAAGCTGCAGCAGCTGCCCAGGCAGCAGCCGTGGCAGGAAACATCCCTGGCCCAGGATCAGTAGGTGGAATAGCTCCAGCTATCAGTCTGTCAGCTGCTGCTGGAATTGGTGTTGATGACCTTCGTCGCTTATGCATACTCAGGATGAGTTTTGTGAAAGGCTGGGGACCGGATTACCCAAGACAGAGCATCAAAGAAACACCTTGCTGGATTGAAATTCACTTACACCGGGCCCTCCAGCTCCTAGACGAAGTACTTCATACCATGCCGATTGCAGACCCACAACCTTTAGACTGAGGTCTTTTACCGTTGGGGCCCTTAACCTTATCAGGATGGTGGACTACAAAATACAATCCTGTTTATAATCTGAAGATATATTTCACTTTTGTTCTGCTTTATCTTTTCATAAAGGGTTGAAAATGTGTTTGCTGCCTTGCTCCTAGCAGACAGAAACTGGATTAAAACAATTTTTTTTTTCCTCTTCAGAACTTGTCAGGCATGGCTCAGAGCTTGAAGATTAGGAGAAACACATTCTTATTAATTCTTCACCTGTTATGTATGAAGGAATCATTCCAGTGCTAGAAAATTTAGCCCTTTAAAACGTCTTAGAGCCTTTTATCTGCAGAACATCGATATGTATATCATTCTACAGAATAATCCAGTATTGCTGATTTTAAAGGCAGAGAAGTTCTCAAAGTTAATTCACCTATGTTATTTTGTGTACAAGTTGTTATTGTTGAACATACTTCAAAAATAATGTGCCATGTGGGTGAGTTAATTTTACCAAGAGTAACTTTACTCTGTGTTTAAAAAGTAAGTTAATAATGTATTGTAATCTTTCATCCAAAATATTTTTTGCAAGTTATATTAGTGAAGATGGTTTCAATTCAGATTGTCTTGCAACTTCAGTTTTATTTTTGCCAAGGCAAAAAACTCTTAATCTGTGTGTATATTGAGAATCCCTTAAAATTACCAGACAAAAAAATTTAAAATTACGTTTGTTATTCCTAGTGGATGACTGTTGATGAAGTATACTTTTCCCCTGTTAAACAGTAGTTGTATTCTTCTGTATTTCTAGGCACAAGGTTGGTTGCTAAGAAGCCTATAAGAGGAATTTCTTTTCCTTCATTCATAGGGAAAGGTTTTGTATTTTTTAAAACACTAAAAGCAGCGTCACTCTACCTAATGTCTCACTGTTCTGCAAAGGTGGCAATGCTTAAACTAAATAATGAATAAACTGAATATTTTGGAAACTGCTAAATTCTATGTTAAATACTGTGCAGAATAATGGAAACATTACAGTTCATAATAGGTAGTTTGGATATTTTTGTACTTGATTTGATGTGACTTTTTTTGGTATAATGTTTAAATCATGTATGTTATGATATTGTTTAAAATTCAGTTTTTGTATCTTGGGGCAAGACTGCAAACTTTTTTATATCTTTTGGTTATTCTAAGCCCTTTGCCATCAATGATCATATCAATTGGCAGTGACTTTGTATAGAGAATTTAAGTAGAAAAGTTGCAGATGTATTGACTGTACCACAGACACAATATGTATGCTTTTTACCTAGCTGGTAGCATAAATAAAACTGAATCTCAACATACAAAGTTGAATTCTAGGTTTGATTTTTAAGATTTTTTTTTTCTTTTGCACTTTTGAGTCCAATCTCAGTGATGAGGTACCTTCTACTAAATGACAGGCAACAGCCAGTTCTATTGGGCAGCTTTGTTTTTTTCCCTCACACTCTACCGGGACTTCCCCATGGACATTGTGTATCATGTGTAGAGTTGGTTTTTTTTTTTTTTAATTTTTATTTTACTATAGCAGAAATAGACCTGATTATCTACAAGATGATAAATAGATTGTCTACAGGATAAATAGTATGAAATAAAATCAAGGATTATCTTTCAGATGTGTTTACTTTTGCCTGGAGAACTTTTAGCTATAGAAACACTTGTGTGATGATAGTCCTCCTTATATCACCTGGAATGAACACAGCTTCTACTGCCTTGCTCAGAAGGTCTTTTAAATAGACCATCCTAGAAACCACTGAGTTTGCTTATTTCTGTGATTTAAACATAGATCTTGATCCAAGCTACATGACTTTTGTCTTTAAATAACTTATCTACCACCTCATTTGTACTCTTGATTACTTACAAATTCTTTCAGTAAACACCTAATTTTCTTCTGTAAAAGTTTGGTGATTTAAGTTTTATTGGCAGTTTTATAAAAAGACATCTTCTCTAGAAATTGCTAACTTTAGGTCCATTTTACTGTGAATGAGGAATAGGAGTGAGTTTTAGAATAACAGATTTTTAAAAATCCAGATGATTTGATTAAAACCTTAATCATACATTGACATAATTCATTGCTTCTTTTTTTTGAGATATGGAGTCTTGCTGTGTTGCCCAGGCAGGAGTGCAGTGGTATGATCTCAGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCGGGTTCAACTGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCTGGTAGCTAGGATTACAGGTGCCCGCCACCATGCCTGGCTAACTTTTGTAGTTTTAGTAGAGACGGGGTTTTGCCTGTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACTCCTGACCTCAAGTGATCCATCCACCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACGGGCGTGAGCCACTGTCCCTGGCCTCATTGTTCCCTTTTCTACTTTAAGGAAAGTTTTCATGTTTAATCATCTGGGGAAAGTATGTGAAAAATATTTGTTAAGAAGTATCTCTTTGGAGCCAAGCCACCTGTCTTGGTTTCTTTCTACTAAGAGCCATAAAGTATAGAAATACTTCTAGTTGTTAAGTGCTTATATTTGTACCTAGATTTAGTCACACGCTTTTGAGAAAACATCTAGTATGTTATGATCAGCTATTCCTGAGAGCTTGGTTGTTAATCTATATTTCTATTTCTTAGTGGTAGTCATCTTTGATGAATAAGACTAAAGATTCTCACAGGTTTAAAATTTTATGTCTACTTTAAGGGTAAAATTATGAGGTTATGGTTCTGGGTGGGTTTTCTCTAGCTAATTCATATCTCAAAGAGTCTCAAAATGTTGAATTTCAGTGCAAGC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SEQIDNO：21—VDAC1(NP_003365.1)
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SEQIDNO：22—VDAC1(NM_003374.2)
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SEQIDNO：23—Ybx1(NP_004550.2)
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SEQIDNO：24—Ybx1(NM_004559)
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SEQIDNO：25—HSPA9(NP_004125.3)
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Claims (229)

1.一种评估来自患者的癌症样品例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法，其包括：
鉴定FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)的1、2、3、4、5、6、7或8种肿瘤标志物或者所述肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平例如量或表达水平，
从而评估所述肿瘤样品。
2.权利要求1的方法，其包括例如直接或间接获取针对肿瘤标志物的信号。
3.权利要求2的方法，其包括直接获取所述信号。
4.权利要求1的方法，其包括直接或间接获取所述样品。
5.一种反应混合物，其包含：
癌症样品；和
针对FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)的1、2、3、4、5、6、7或8种肿瘤标志物或者所述肿瘤标志物的DNA或mRNA的检测试剂。
6.权利要求5的反应混合物，其中所述癌症样品包含多个部分，例如薄片或等分试样。
7.权利要求5的反应混合物，其中所述癌症样品的第一部分包含针对第一所述标志物而非全部所述标志物的检测试剂，并且所述癌症样品的第二部分包含针对所述标志物之一的检测标志物的检测试剂，但不包含针对所述第一标志物的检测试剂。
8.一种评估来自患者的样品，例如组织样品，例如癌症样品，例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法，其包括：
(a)在来自所述样品的目标区域(ROI)中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，
从而评估所述样品。
9.权利要求8的方法，其中所述样品是癌症样品。
10.权利要求8的方法，其中所述样品包含来自实体瘤的细胞。
11.权利要求8的方法，其中所述样品包含来自液体肿瘤的细胞。
12.权利要求8的方法，其中通过形态特征来限定或选择所述ROI。
13.权利要求8的方法，其中通过手动或自动手段以及ROI与其它细胞或材料的物理分离，例如通过使ROI例如癌性区域从其它组织例如非癌性细胞剥离，来限定或选择所述ROI。
14.权利要求8的方法，其中通过非形态特征例如ROI标志物来限定或选择所述ROI。
15.权利要求8的方法，其中通过细胞分选的方式借助ROI标志物的包含来鉴定或选择所述ROI。
16.权利要求8的方法，其中通过形态和非形态选择的组合来鉴定或选择所述ROI。
17.权利要求8的方法，其中在第一ROI例如第一癌性区域中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，并且在第二ROI例如第二癌性区域中，鉴定第二区域表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。
18.权利要求8的方法，其中在相同的ROI例如相同的癌性区域中，鉴定第一和第二区域表型标志物例如肿瘤标志物的水平。
19.权利要求8的方法，其进一步包括：
(b)鉴定ROI，例如对应于癌性区域的ROI。
20.权利要求8的方法，其中(a)在(b)之前执行。
21.权利要求8的方法，其中(b)在(a)之前执行。
22.权利要求8的方法，其中第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平的鉴定包括例如直接或间接获取与检测试剂与所述第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的结合相关的例如成比例的信号。
23.权利要求8的方法，其包括使所述样品与针对第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的检测试剂接触。
24.权利要求8的方法，其包括使所述样品与针对ROI标志物例如上皮标志物的检测试剂接触。
25.权利要求8的方法，其进一步包括采集所述样品的图像，并且分析所述图像。
26.权利要求25的方法，其包括由所述图像计算针对所述患者的风险得分。
27.权利要求8的方法，其包括：使所述样品与针对所述第一区域表型标志物例如肿瘤标志物的检测试剂接触，并且获取针对所述检测试剂的结合的值。
28.权利要求27的方法，其包括由所述值计算针对所述患者的风险得分。
29.权利要求8的方法，其进一步包括：
(b)使样品与针对ROI标志物的检测试剂接触。
30.权利要求29的方法，其进一步包括：
(c)限定ROI。
31.权利要求30的方法，其进一步包括：
(d)鉴定所述ROI中的区域表型标志物例如肿瘤标志物的水平。
32.权利要求31的方法，其进一步包括：
(e)分析所述水平以提供风险得分。
33.权利要求32的方法，其进一步包括重复步骤(a)-(d)。
34.权利要求8的方法，其进一步包括：
使所述样品经历样品物理分离步骤，例如解离例如胰蛋白酶化所述样品，剥离所述样品，或使所述样品与针对ROI标志物的检测试剂接触；
使所述ROI与检测试剂接触；或
检测来自所述ROI的信号。
35.一种评估来自患者的肿瘤样品例如前列腺肿瘤样品的方法，例如计算机实现的方法或自动化方法，其包括：
(a)在ROI例如癌性ROI中，鉴定第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物或者所述第一肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平例如量，例如其中所述第一肿瘤标志物选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)，
从而评估所述肿瘤样品。
36.权利要求35的方法，其中在第一ROI例如癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平，并且在第二ROI例如第二癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第二区域表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。
37.权利要求36的方法，其中通过相同的方法或标准鉴定或选择所述第一ROI例如癌性ROI和所述ROI例如第二癌性ROI。
38.权利要求35的方法，其中在相同的ROI例如相同的癌性ROI中鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一和第二区域表型标志物例如第一和第二肿瘤标志物的水平。
39.权利要求35的方法，其进一步包括：
(b)鉴定ROI，例如对应于肿瘤上皮的所述肿瘤样品的ROI。
40.权利要求39的方法，其中(a)在(b)之前执行。
41.权利要求39的方法，其中(b)在(a)之前执行。
42.权利要求35的方法，其中第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平的鉴定包括例如直接或间接获取与检测试剂与所述第一区域表型标志物例如第一肿瘤标志物的结合相关的例如成比例的信号。
43.权利要求35的方法，其中所述肿瘤标志物是编码FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9HSPA9的DNA。
44.权利要求35的方法，其中所述肿瘤标志物是编码FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的mRNA。
45.权利要求35的方法，其中所述肿瘤标志物是选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的蛋白质。
46.权利要求35的方法，其包括：使所述样品与针对肿瘤标志物集合的标志物的检测试剂接触，直接或间接获取所述样品的图像，并且分析所述图像。
47.权利要求35的方法，其包括由所述图像计算针对所述患者的风险得分。
48.权利要求35的方法，其包括：使所述样品与针对肿瘤标志物集合的所述第一标志物的检测试剂接触，直接或间接获取针对所述检测试剂的结合的值。
49.权利要求48的方法，其包括由所述值计算针对所述患者的风险得分。
50.权利要求1-49中任一项的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物或者针对所述第二肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
51.权利要求50的方法，其中所述第二肿瘤标志物是来自所述肿瘤标志物集合的蛋白质。
52.权利要求50的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物或者针对所述第三肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
53.权利要求52的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物或者针对所述第四肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
54.权利要求53的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物或者针对所述第五肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
55.权利要求54的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物或者针对所述第六肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
56.权利要求55的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物或者针对所述第七肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
57.权利要求56的方法，其进一步包括
在ROI(例如相同或不同的ROI)例如对应于肿瘤上皮的ROI中，鉴定选自所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物或者针对所述第八肿瘤标志物的DNA或mRNA的水平。
58.权利要求57的方法，其进一步包括鉴定除标志物或所述肿瘤标志物集合之外的本文公开的另外标志物的水平。
59.权利要求58的方法，其中在癌性ROI中鉴定所述另外标志物的水平。
60.权利要求58的方法，其中在良性ROI中鉴定所述另外标志物的水平。
61.权利要求1-60中任一项的方法，其进一步包括提供所述肿瘤样品。
62.权利要求1-60中任一项的方法，其进一步包括接受来自另一实体例如医院、实验室或诊所的所述肿瘤样品。
63.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品包含前列腺组织切片或薄片。
64.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品包含多个部分，例如多个前列腺组织切片或薄片。
65.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品是经固定的，例如经福尔马林固定。
66.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品包埋在基质中。
67.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品是石蜡包埋的。
68.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品是去石蜡的。
69.权利要求1-60中任一项的方法，其中所述肿瘤样品是福尔马林固定、石蜡包埋的样品或其等价物。
70.权利要求69的方法，其中肿瘤样品制备例如去石蜡是自动化的。
71.权利要求1-70中任一项的方法，其中检测试剂与所述肿瘤样品的接触是自动化的。
72.权利要求1-71中任一项的方法，其中将所述肿瘤样品置于自动化扫描仪中。
73.权利要求1-72中任一项的方法，其中将所述肿瘤样品，例如前列腺组织的部分例如切片或薄片，布置在基底例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
74.权利要求73的方法，其中：
将所述肿瘤样品的第一部分例如切片或薄片布置在第一基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
75.权利要求74的方法，其进一步包括：
将所述肿瘤样品的第二部分例如切片或薄片布置在第二基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
76.权利要求75的方法，其进一步包括：
将所述肿瘤样品的第三部分例如切片或薄片布置在第三基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
77.权利要求76的方法，其进一步包括：
将所述肿瘤样品的第四部分例如切片或薄片布置在第四基底，例如固体或刚性基底，例如玻璃或塑料基底，例如载玻片上。
78.权利要求75的方法，其中同时分析所述第一和第二部分。
79.权利要求75的方法，其中相继分析所述第一和第二部分。
80.权利要求1-79中任一项的方法，其中所述检测试剂包含肿瘤标志物抗体，例如肿瘤标志物单克隆抗体，例如针对FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的肿瘤标志物抗体。
81.权利要求80的方法，其中所述肿瘤标志物抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
82.权利要求81的方法，其中所述检测试剂包含第二抗体，其是针对所述肿瘤标志物抗体的抗体例如单克隆抗体。
83.权利要求82的方法，其中所述检测试剂包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
84.权利要求81的方法，其中所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
85.权利要求82的方法，其中所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
86.权利要求1-85中任一项的方法，其中使所述肿瘤样品与下述接触：
第一ROI标志物检测试剂，例如总上皮检测试剂，例如如本文描述的，具有第一发射特征谱，例如第一峰值发射，或其在第一通道中进行测量；
第二ROI标志物检测试剂，例如基底上皮检测试剂，例如如本文描述的，具有第二发射特征谱，例如第二峰值发射，或其在第二通道中进行测量；
区域表型标志物，例如肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第三发射特征谱，例如第三峰值发射，或其在第三通道中进行测量。
87.权利要求86的方法，其中使所述肿瘤样品进一步与下述接触：
核检测试剂，其具有第四发射特征谱，例如第四峰值发射，或其在第四通道中进行测量。
88.权利要求87的方法，其中使所述肿瘤样品进一步与下述接触：
第二区域表型标志物，例如第二肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第五发射特征谱，例如第五峰值发射，或其在第五通道中进行测量。
89.权利要求88的方法，其中使所述肿瘤样品进一步与下述接触：
第三区域表型标志物，例如第三肿瘤标志物检测试剂，例如如本文描述的，具有第六发射特征谱，例如第六峰值发射，或其在第六通道中进行测量。
90.权利要求1-89中任一项的方法，其中鉴定ROI例如癌性ROI包括鉴定具有缺乏基底细胞外层的上皮结构的区域。
91.权利要求90的方法，其中用第一ROI特异性检测试剂，例如第一总上皮特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK8抗体或抗CK18抗体例如单克隆抗体，来检测上皮结构。
92.权利要求91的方法，其中用所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮特异性检测试剂，以及第二ROI特异性检测试剂，例如第二总上皮特异性检测试剂，来检测上皮结构。
93.权利要求92的方法，其中所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮特异性检测试剂，以及所述第二ROI特异性检测试剂，例如所述第二总上皮特异性检测试剂中的一种是CK8检测试剂，例如抗CK8抗体例如单克隆抗体，并且另一种是CK18结合试剂，例如抗CK18抗体例如单克隆抗体。
94.权利要求93的方法，其中针对所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮检测试剂的结合的信号通过第一通道例如在第一波长处进行检测。
95.权利要求93的方法，其中针对所述第一ROI特异性检测试剂，例如所述第一总上皮检测试剂的结合的信号，以及针对所述第二ROI特异性检测试剂，例如所述第二总上皮检测试剂的信号，通过所述第一通道例如在第一波长处进行检测。
96.权利要求91的方法，其中所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮检测试剂，包含标志物抗体例如标志物单克隆抗体。
97.权利要求91的方法，其中所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮检测试剂，缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
98.权利要求91的方法，其中所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮结合试剂，包含第二抗体，其是针对所述标志物抗体的抗体例如单克隆抗体。
99.权利要求98的方法，其中所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂，例如所述总上皮结合试剂，包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
100.权利要求99的方法，其中所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
101.权利要求98的方法，其中所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
102.权利要求90-101中任一项的方法，其中用ROI特异性检测试剂，例如基底上皮检测试剂，例如本文描述的基底上皮检测试剂，来检测基底细胞的存在或不存在。
103.权利要求1-102中任一项的方法，其进一步包括鉴定对应于所述肿瘤样品的良性ROI的ROI，例如第二ROI。
104.权利要求103中的方法，其中鉴定良性ROI包括鉴定具有以基底细胞外层为界的上皮结构的区域。
105.权利要求104的方法，其中用针对基底上皮的ROI特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，或抗TRIM29抗体例如单克隆抗体，来检测基底细胞。
106.权利要求105的方法，其中用针对基底上皮的所述ROI特异性检测试剂，以及针对基底上皮的第二ROI特异性检测试剂，例如抗体例如单克隆抗体，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，或抗TRIM29抗体例如单克隆抗体，来检测基底细胞。
107.权利要求106的方法，其中针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂以及针对基底上皮的所述ROI特异性检测试剂中的一种是CK5检测试剂，例如抗CK5抗体例如单克隆抗体，并且另一种是TRIM29检测试剂，例如抗TRIM29抗体例如单克隆抗体。
108.权利要求107的方法，其中针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂的结合的信号通过第一通道例如在第一波长处进行检测。
109.权利要求108的方法，其中针对基底上皮的所述第一ROI特异性检测试剂的结合的信号，以及针对基底上皮的所述第二ROI特异性检测试剂的信号，通过所述第一通道例如在第一波长处进行检测。
110.权利要求105的方法，其中针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含标志物抗体例如标志物单克隆抗体。
111.权利要求105的方法，其中针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
112.权利要求105的方法，其中针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含针对所述标志物抗体的第二抗体例如单克隆抗体。
113.权利要求105的方法，其中针对基底上皮的所述第一(并且如果存在的话，任选地所述第二)ROI特异性检测试剂包含第三抗体，其是针对所述第二抗体的抗体例如单克隆抗体。
114.权利要求113的方法，其中所述第二抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
115.权利要求114的方法，其中所述第三抗体缀合至标记例如荧光部分例如荧光染料。
116.权利要求1-115中任一项的方法，其进一步包括将所述肿瘤样品的ROI鉴定为间质的。
117.权利要求1-116中任一项的方法，其中所述方法包括
(i.a)直接或间接获取针对总上皮特异性标志物例如CK8的信号；
(ii.a)直接或间接获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。
118.权利要求117的方法，其进一步包括：
(i.b)直接或间接获取针对第二总上皮特异性标志物例如CK18的信号；
(ii.b)直接或间接获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。
119.权利要求118的方法，其进一步包括：
(iii)直接或间接获取针对核标志物的信号。
120.权利要求119的方法，其进一步包括：
(iv)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的信号。
121.权利要求120的方法，其进一步包括：
(v)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物的信号。
122.权利要求120的方法，其进一步包括：
(vi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物的信号。
123.权利要求122的方法，其进一步包括：
(vii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物的信号。
124.权利要求123的方法，其进一步包括：
(viii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物的信号。
125.权利要求124的方法，其进一步包括：
(ix)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物的信号。
126.权利要求125的方法，其进一步包括：
(x)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物的信号。
127.权利要求118的方法，其中针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
128.权利要求118的方法，其中针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
129.权利要求1-116中任一项的方法，其包括：
(i.a)直接或间接获取针对总上皮特异性标志物例如CK8的信号；
(i.b)直接或间接获取针对第二总上皮特异性标志物例如CK18的信号；
(ii.a)直接或间接获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号；
(ii.b)直接或间接获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号；
(iii)直接或间接获取针对核标志物的信号；
(iv)直接或间接获取针对第一肿瘤标志物的信号；
(v)直接或间接获取针对第二肿瘤标志物的信号；或
(vi)直接或间接获取针对第三肿瘤标志物的信号。
130.权利要求129的方法，其包括(i.a)、(ii.a)、(iii)和(iv)。
131.权利要求129的方法，其包括(i.a)、(i.b)、(ii.a)、(ii.b)、(iii)和(iv)。
132.权利要求129的方法，其中包括(i.a)-(v)的全部。
133.权利要求129的方法，其中包括(i.a)-(vi)的全部。
134.权利要求1-133中任一项的方法，其进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，鉴定质量控制标志物的水平。
135.权利要求134的方法，进一步其中所述质量控制标志物选自肿瘤标志物集合，例如DERL1。
136.权利要求134或135的方法，其进一步包括使所述样品与针对所述质量控制标志物的检测试剂接触。
137.权利要求133-136中任一项的方法，其进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，例如直接或间接获取与所述检测试剂与所述第一质量控制标志物的结合相关的例如成比例的信号。
138.权利要求137的方法，其进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物的水平。
139.权利要求138的方法，其中所述第二质量控制标志物不是来自所述肿瘤标志物集合的标志物。
140.权利要求139的方法，其中所述第二质量控制标志物与肿瘤的致死率或侵袭性相关。
141.权利要求138的方法，其中所述第二质量控制标志物是本文描述的标志物，例如除来自所述肿瘤标志物集合的标志物之外的肿瘤标志物。
142.权利要求141的方法，其中所述第二质量控制标志物选自ACTN和VDAC1。
143.权利要求137-141中任一项的方法，其进一步包括例如在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物的水平。
144.权利要求143的方法，其中所述第三质量控制标志物不是来自所述肿瘤标志物集合的标志物。
145.权利要求144的方法，其中所述第三质量控制标志物是本文描述的标志物，例如除来自所述肿瘤标志物集合的标志物之外的肿瘤标志物。
146.权利要求144的方法，其中所述第三质量控制标志物选自ACTN和VDAC1。
147.权利要求1-146中任一项的方法，其进一步包括：
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平例如量；和
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平。
148.权利要求147的方法，其进一步包括在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平。
149.权利要求143的方法，其中在相同的第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一、第二和第三质量控制标志物的水平。
150.权利要求143的方法，其中在不同的第二ROI例如不同的良性ROI中，鉴定第一、第二和第三质量控制标志物的水平。
151.权利要求143的方法，其进一步包括：
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平；
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平；和
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平，
其中响应所述水平，将样品分类为例如可接受的或不可接受的。
152.权利要求151的方法，其包括检测针对所述质量控制标志物之一的水平的信号。
153.权利要求152的方法，其中针对检测到的信号的第一值指示第一质量水平，例如可接受的质量，并且针对检测到的信号的第二值指示第二质量水平，例如不可接受的质量。
154.权利要求153的方法，其中响应所述值，将样品进行加工或不进行加工，例如弃去，或改变用于分析的参数。
155.权利要求1-154中任一项的方法，其包括采集来自所述样品的多光谱图像，并且将所述多光谱图像解混至下述通道：
针对第一ROI特异性检测试剂例如上皮特异性标志物的通道；
针对第二ROI特异性检测试剂例如基底上皮特异性标志物的通道；
针对核特异性信号例如DAPI信号的通道；和
针对第一群体表型标志物例如第一肿瘤标志物的通道。
156.权利要求155的方法，其中所述方法包括：
使用第一通道来收集针对第一ROI特异性检测试剂例如总上皮标志物的信号；
使用第二通道来收集针对第二ROI特异性检测试剂例如基底上皮标志物的信号；
使用第三通道来收集针对核区域的信号；
使用第四通道来收集针对第一群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第一肿瘤标志物的信号。
157.权利要求156的方法，其进一步包括：
使用第五通道来收集针对第二群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第二肿瘤标志物的信号。
158.权利要求157的方法，其进一步包括：
使用第六通道来收集针对第三群体表型标志物，例如选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第三肿瘤标志物的信号。
159.权利要求1-158中任一项的方法，其包括采集待分析的样品的区域的图像，例如作为DAPI过滤图像。
160.权利要求1-159中任一项的方法，其包括例如通过将组织发现算法应用于从所述样品中收集的图像来定位组织。
161.权利要求1-160中任一项的方法，其包括用DAPI和FITC单色过滤器来重新采集图像。
162.权利要求1-161中任一项的方法，其进一步包括应用组织发现算法，例如以确保采集含有足够组织的预选数目的视野图像。
163.权利要求1-162中任一项的方法，其进一步包括直接或间接获取DAPI、FITC、TRITC和Cy5过滤器的连续曝光。
164.权利要求1-163中任一项的方法，其包括采集待分析的样品的区域的多光谱图像。
165.权利要求1-164中任一项的方法，其包括将所述样品的区域分段成上皮细胞、基底细胞和间质。
166.权利要求1-165中任一项的方法，其进一步包括将所述样品的区域鉴定为细胞质和核区域。
167.权利要求1-166中任一项的方法，其包括在癌性ROI的细胞质、核和/或全细胞中，例如直接或间接获取针对群体表型标志物例如肿瘤标志物的值。
168.权利要求1-167中任一项的方法，其包括在良性ROI的细胞质、核和/或全细胞中，例如直接或间接获取针对群体表型标志物例如肿瘤标志物的值。
169.权利要求1-168中任一项的方法，其中所述肿瘤样品包含多个部分，例如多个切片或薄片。
170.权利要求169的方法，其包括：
执行本文描述的步骤，例如从第一部分例如切片或薄片中收集或获取信号，或形成图像，例如鉴定第一群体表型标志物例如第一肿瘤标志物的水平；和
执行本文描述的步骤，例如从第二部分例如第二切片或薄片中收集或获取信号，或形成图像，例如鉴定第二群体表型标志物例如第二肿瘤标志物的水平。
171.权利要求170的方法，其中所述第二肿瘤标志物选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9。
172.权利要求170的方法，其进一步包括：
在所述肿瘤样品的第二部分例如第二切片或薄片中，鉴定对应于肿瘤上皮的ROI；
从对应于肿瘤上皮的所述ROI中，例如直接或间接获取针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第二肿瘤标志物的信号。
173.权利要求170的方法，其中所述方法包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(i.a)获取针对上皮特异性标志物例如CK8的信号；
(ii.a)获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。
174.权利要求173的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(i.b)获取针对第二上皮特异性标志物例如CK18的信号；
(ii.b)获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。
175.权利要求174的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(iii)获取针对核标志物的信号。
176.权利要求175的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(iv)获取针对权利要求1的第二肿瘤标志物的信号。
177.权利要求176的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(v)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的信号。
178.权利要求177的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(vi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第三肿瘤标志物的信号。
179.权利要求178的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(vii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第四肿瘤标志物的信号。
180.权利要求179的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(viii)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第五肿瘤标志物的信号。
181.权利要求180的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(ix)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第六肿瘤标志物的信号。
182.权利要求181的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(x)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第七肿瘤标志物的信号。
183.权利要求182的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第二部分例如第二切片或薄片，
(xi)直接或间接获取针对所述肿瘤标志物集合的第八肿瘤标志物的信号。
184.权利要求174的方法，其中针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
185.权利要求174的方法，其中针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
186.权利要求172的方法，其进一步包括：
在所述肿瘤样品的第三部分例如第三切片或薄片中，鉴定对应于肿瘤上皮的ROI；
从对应于肿瘤上皮的所述ROI中，例如直接或间接获取针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的第三肿瘤标志物的信号。
187.权利要求172的方法，其中所述方法包括：对于所述肿瘤样品的第三部分例如第三切片或薄片，
(i.a)获取针对上皮特异性标志物例如CK8的信号；
(ii.a)获取针对基底上皮特异性标志物例如CK5的信号。
188.权利要求187的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，
(i.b)获取针对第二上皮特异性标志物例如CK18的信号；
(ii.b)获取针对第二基底上皮特异性标志物例如TRIM29的信号。
189.权利要求188的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，
(iii)获取针对核标志物的信号。
190.权利要求189的方法，其进一步包括：对于所述肿瘤样品的所述第三部分例如第三切片或薄片，
(iv)获取针对权利要求1的第二肿瘤标志物的信号。
191.权利要求188的方法，其中针对(i.a)和(i.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
192.权利要求188的方法，其中针对(ii.a)和(ii.b)的所述信号具有相同的峰值发射，或在相同的通道中收集。
193.权利要求1-192中任一项的方法，其中将第一肿瘤样品部分例如第一切片或薄片布置在第一衬底上。
194.权利要求193的方法，其中将第二肿瘤样品部分例如第二切片或薄片布置在第二衬底上。
195.权利要求194的方法，其中将第三肿瘤样品部分例如第三切片或薄片布置在第三衬底上。
196.权利要求195的方法，其中将第四肿瘤样品部分例如第四切片或薄片布置在第四衬底上。
197.权利要求174的方法，其中
将第一肿瘤样品部分例如第一切片或薄片以及第二肿瘤样品部分例如第二切片或薄片布置在相同衬底上。
198.权利要求1-197中任一项的方法，其进一步包括将来自本文描述的方法中的任何步骤的对应于从所述样品获取的信号、值或图像的值保存或储存于数字或电子介质例如计算机数据库中。
199.权利要求1-198中任一项的方法，其包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定核区域。
200.权利要求1-199中任一项的方法，其包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定细胞质区域。
201.权利要求1-200中任一项的方法，将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定癌性ROI。
202.权利要求1-201中任一项的方法，其包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以鉴定良性ROI。
203.权利要求1-202中任一项的方法，其包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以提供针对所述肿瘤标志物在癌性ROI中的水平的值。
204.权利要求1-203中任一项的方法，其包括将从来自所述肿瘤样品的信号的捕获获得的值或图像输出到软件例如模式或对象识别软件中，以提供针对所述肿瘤标志物在良性ROI中的水平的值。
205.权利要求1-204中任一项的方法，其包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号，提供针对区域表型标志物例如肿瘤标志物在癌性ROI中的水平的值。
206.权利要求1-205中任一项的方法，其包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在良性ROI中的水平的值。
207.权利要求1-206中任一项的方法，其包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号、以及针对第三ROI标志物例如核特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在癌性ROI中的细胞质水平的值。
208.权利要求1-207中任一项的方法，其包括响应针对区域表型标志物例如肿瘤标志物的信号、针对第一ROI标志物例如总上皮特异性标志物的信号、以及针对第二ROI标志物例如基底上皮特异性标志物的信号、以及针对第三ROI标志物例如核特异性标志物的信号，提供针对肿瘤标志物在良性ROI中的核水平的值。
209.权利要求205的方法，其包括计算针对所述患者的风险得分。
210.权利要求205的方法，其包括响应所述值，计算针对所述患者的风险得分。
211.权利要求210的方法，其包括响应来自权利要求198-208的所述值中的一种或多种，计算针对所述患者的风险得分。
212.权利要求210的方法，其包括计算针对所述患者的风险得分，其中所述风险得分与针对前列腺外扩散或转移的潜力关联。
213.权利要求212的方法，其包括响应所述风险得分，预后所述患者、分类患者、选择用于所述患者的治疗过程、或给所述患者施用所选择的治疗过程。
214.权利要求211的方法，其中所述风险得分对应于”有利”病例(例如手术格里森3+3或3伴随最低限度4，局限于器官的(≤T2)肿瘤)。
215.权利要求211的方法，其中所述风险得分对应于”不利”病例(例如包膜渗透(T3a)、精囊侵入(T3b)、淋巴结转移或占优势的格里森4模式或更高)。
216.权利要求211的方法，其中所述风险得分允许区分”有利”病例(例如手术格里森3+3或3伴随最低限度4，局限于器官的(≤T2)肿瘤)和”不利”病例(例如包膜渗透(T3a)、精囊侵入(T3b)、淋巴结转移或占优势的格里森4模式或更高)。
217.权利要求211的方法，其中所述风险得分对应于或预测：
3+3的手术格里森或局限性疾病(≤T3a)(定义为”低风险”)；
手术格里森≥3+4或非局限性疾病(T3b、N或M)(定义为”中-高风险”)；
手术格里森≤3+4和局限于器官的疾病(≤T2)(定义为”有利的”)；或
手术格里森≥4+3或非局限于器官的疾病(T3a、T3b、N或M)(”不利的”)。
218.权利要求211的方法，其进一步包括响应所述风险得分，将所述患者鉴定为患有侵袭性癌症或具有增高的风险或癌症相关的致死结果。
219.权利要求211的方法，其包括选择所述患者用于辅助疗法或给所述患者施用辅助疗法。
220.一种试剂盒，其包含针对肿瘤标志物FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9中的1、2、3、4、5、6、7种或全部的检测试剂。
221.权利要求220的试剂盒，其进一步包含针对总上皮标志物和基底上皮标志物的检测试剂。
222.一种癌症样品例如前列腺肿瘤样品，在其上布置有：
针对总上皮标志物的检测试剂；
针对基底上皮标志物的检测试剂；
针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的肿瘤标志物的检测试剂。
223.权利要求222的前列腺肿瘤样品，其中所述样品包含多个部分例如薄片。
224.一种癌症样品例如前列腺肿瘤样品，在其上进一步布置有针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2或HSPA9的第二肿瘤标志物的检测试剂。
225.一种评估来自患者的前列腺肿瘤样品的计算机实现的方法，其包括：
(i)鉴定对应于肿瘤上皮的所述肿瘤样品的ROI(癌性ROI)；
(ii)在癌性ROI中，鉴定下述肿瘤标志物FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9(肿瘤标志物集合)各自的水平例如量，其中鉴定肿瘤标志物的水平包括例如直接或间接获取与针对所述肿瘤标志物的抗体的结合相关的例如成比例的信号；
(iii)提供针对肿瘤标志物各自在癌性ROI中的水平的值；和
(iv)响应所述值，评估所述肿瘤样品，包括例如通过算法地组合所述水平来对所述患者指定风险得分，
从而评估前列腺肿瘤样品。
226.权利要求225的方法，其中所述方法包括：
使用第一通道来收集针对总上皮标志物的信号；
使用第二通道来收集针对基底上皮标志物的信号；
使用第三通道来收集针对核区域的信号；
使用第四通道来收集针对选自FUS、SMAD4、DERL1、YBX1、pS6、PDSS2、CUL2和HSPA9的肿瘤标志物的信号。
227.权利要求225-226中任一项的方法，其中在第一癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一肿瘤标志物的水平，并且在第二癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第二肿瘤标志物的水平。
228.权利要求225-227中任一项的方法，其中在相同的癌性ROI中，鉴定来自所述肿瘤标志物集合的第一和第二肿瘤标志物的水平。
229.权利要求225-228中任一项的方法，其进一步包括：
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第一质量控制标志物例如DERL1的水平；
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第二质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平；和
在第二ROI例如良性ROI中，鉴定第三质量控制标志物例如ACTN和VDAC之一的水平，
其中响应所述水平，将样品分类为例如可接受的或不可接受的。
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