CN105131101B - 一种人类核糖体蛋白rps6亚基抗癌肽段及其应用 - Google Patents

一种人类核糖体蛋白rps6亚基抗癌肽段及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用，该人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的氨基酸序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84。本发明公开了所述的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在制备抗癌药物中的应用。人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对正常细胞的生长几乎无影响，而对癌细胞生长显示了生长抑制效应，其中对食管癌Eca‑109细胞有显著的生长抑制作用，其生长抑制率高达69.55％；人食管癌细胞Eca‑109裸鼠异种移植瘤模型显示其抑瘤率为59.09％。人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段具有极佳的抗癌效果和抗癌应用前景。

Description

一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用
技术领域
本发明涉及肽段及其应用，具体涉及一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
核糖体是催化蛋白质合成的细胞器。哺乳动物的核糖体是由4种RNA和大约80个不同的蛋白质组成，其中核糖体蛋白的命名与蛋白在核糖体的大小亚基有关，大亚基核糖体蛋白命名为L1至L44，小亚基核糖体蛋白命名为S1至S31。RPS6蛋白亚基是40s核糖体蛋白的组成部分，由RPS6基因编码。该蛋白亚基属于核糖体蛋白S6E家系，它存在于细胞质中，RPS6蛋白亚基在核糖体中是蛋白激酶的主要底物，它的五个C-末端丝氨酸残基通过不同的蛋白激酶被磷酸化。近年来，人类核糖体蛋白RPS6亚基的cDNA和结构基因已被克隆，测序和分析。该结构基因长度约3.982kb，包含6个外显子和5个内含子，编码249个氨基酸残基的蛋白亚基。人类核糖体蛋白RPS6亚基分子量为28.68KD，PI为10.85。
发明人在研究人类核糖体蛋白RPS6亚基的相关功能效应时，通过对核糖体蛋白RPS6亚基的cDNA进行了克隆，原核表达和RPS6基因重组蛋白的纯化，并以获得的RPS6基因重组蛋白为研究材料，以细胞为反应器进行研究。研究中发现RPS6基因重组蛋白对食管癌Eca-109细胞有较显著的生长抑制作用。为探索RPS6基因重组蛋白的的抗癌机理和机制，同时为研发抗癌蛋白药物累积系统而扎实的科学基础数据，发明人把RPS6基因重组蛋白切割成若干个小的多肽，逐个筛选多肽对人类不同类型癌细胞生长的效应，发现RPS6基因重组蛋白中的一个肽段(肽段的序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84.我们称为RPS6亚基抗癌肽段)对人类不同类型的癌细胞生长具有不同的效应。因为RPS6亚基抗癌肽段属于小分子多肽，于是对RPS6亚基抗癌肽段进行了人工合成，用此多肽分别作用于不同类型的癌细胞和正常细胞，发现RPS6亚基抗癌肽段对正常细胞的生长几乎无影响，仅有微弱的生长抑制作用，而对不同类型的癌细胞生长显示了不同的生长抑制效应，其中对食管癌Eca-109细胞有显著的生长抑制作用。
迄今为止，人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对食管癌Eca-109细胞强烈的生长抑制作用在国内外尚无任何报道。因此，本发明的技术方案为首次揭示人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的抗癌功效和应用。
发明内容
本发明的目的在于设计一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用，通过构建的细胞模型和动物模型，对人工合成的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的抗癌活性效应进行了评价，细胞模型评价结果显示：人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对正常细胞的生长几乎无影响(仅有微弱的生长抑制作用)，而对不同类型的癌细胞生长显示了不同的生长抑制效应，其中对食管癌Eca-109细胞有显著的生长抑制作用，其生长抑制率高达69.55％；人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤模型评价结果显示：RPS6亚基抗癌肽段对食管癌Eca-109的抑瘤率为59.09％。而相同条件下，阳性对照环磷酰胺组(20mg/kg)的抑瘤率为55.49％。因此，本发明揭示的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段具有极佳的抗癌效果和抗癌应用前景。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段，所述人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的氨基酸序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84。该肽段为单链，不具有化学键的修饰。
本发明还公开了人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在制备抗癌药物中的应用。
本发明尤其公开了人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在制备抗人类食管癌药物中的应用。
本发明人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用的优点和有益效果在于：
首先，人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段属于小分子多肽，容易制备，其制备工艺和成本较低，易于制得；
其次，本发明的发明人首次发现人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对正常细胞的生长几乎无影响，对不同类型的癌细胞生长显示了不同的效应，其中对食管癌Eca-109细胞有显著的生长抑制作用，其生长抑制率高达69.55％；对Eca-109食管癌瘤的抑瘤率为59.09％。而相同条件下，阳性对照环磷酰胺组(20mg/kg)的抑瘤率为55.49％。说明人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对细胞的影响有明显的靶向效应，具有极佳的抗癌效果；
再次，人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段人对食管癌Eca-109细胞和Eca-109食管癌瘤有显著的生长抑制作用这一发现为抗癌蛋白药物的研发提供了科学依据和方向，也为研究抗癌机理提供了有价值的资源，为研究新型的抗癌药物和手段提供的新的方向。
附图说明
图1是本发明人类核糖体蛋白RPS6抗癌肽段的细胞学活性效应数据图。
图2是本发明实施例2中多肽420对人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用数据图。
图3是本发明实施例2中获取的肿瘤实物图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
如图1所示：细胞模型的构建与抗癌效果的验证
1.细胞模型
1.1材料与方法
1.1.1材料
1.1.1.1细胞株：人正常肝细胞Chang Liver(张氏肝细胞)，人食管癌Eca-109细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞，上述细胞株均为已经商品化的生物材料。
1.1.1.2试剂：RPMI1640粉末(购于Gibco公司，美国)，胎牛血清(购于四季青生物制品公司，中国)，双抗(青霉素，链霉素，购于Gibco公司)。
1.1.1.3人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段由上海强耀生物科技有限公司合成。人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段(多肽)的氨基酸序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84。纯度为92.91％。(人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的合成号为：cz-420；在实验研究中标记为多肽420)。
1.1.2方法
1.1.2.1细胞培养
将人正常肝细胞Chang Liver，人食管癌Eca-109细胞，人乳腺癌Bcap-37细胞株分别用含有10％的灭活的胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、pH7.4的RPMI-1640完全培养液于37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
1.1.2.2 MTT法检测细胞活性
取对数生长期的人正常肝细胞Chang Liver，人食管癌Eca-109细胞和人乳腺癌Bcap-37细胞用胰蛋白酶消化后将细胞数调整到l×105个/mL，接种于96孔板，每孔细胞液量为200μL，放入CO2培养箱内，于37℃、5％CO2及饱和湿度的条件下孵育至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，然后加人类核糖体蛋白RPS6亚基的抗癌肽段，使其终浓度分别为0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1.5，3.0和6.0μg/ml；设6个重复孔，空白组为不含细胞的RPMI1640培养液，放入CO2培养箱内培养24、36和48h后取出96孔板，加入MTT(5mg/mL)溶液10μL，继续培养4h后，然后加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)振荡10min，待蓝紫色结晶完全溶解后，用酶标仪在在490nm的波长下测定各孔的吸光度(OD)值，计算不同浓度下人人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段(本实施例采用直接加入培养生长良好的癌细胞中观察结果，临床中，蛋白质或者多肽类的生物药物多采用注射剂的剂型，肌注或者静脉滴注)作用各类型细胞的抑制率(％)。细胞生长抑制率公式为：细胞生长抑制率＝(1—A实验组/A对照组)×100％。
在以上实验的基础上选择了人类核糖体蛋白RPS6抗癌肽段对生长抑制效果最好的人乳腺癌Bcap-37细胞株，人食管癌Eca-109细胞和人正常肝细胞Chang Liver进行对比实验，培养时间为36h，获取统计数据，具体方法与步骤同上。
1.2结果
本实施例采用MTT法检测结果显示：不同浓度人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在36h下对人正常肝细胞Chang Liver的生长抑制几乎无影响(仅有微弱的生长抑制作用或微弱的生长促进作用)，而对人食管癌Eca-109细胞生长具有显著的抑制作用。从图1可以看出，人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对人食管癌Eca-109细胞的生长抑制率具有剂量的依赖性。发现在0.8μg/ml浓度下对人食管癌Eca-109细胞生长抑制有最佳的效果，达到69.55％。从图1中可以得出，人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对人乳腺癌Bcap-37细胞的生长也具有较明显的抑制作用，在1.5μg/ml浓度下对人乳腺癌Bcap-37细胞生长抑制有最佳的效果，达到40.35％。由此可以得出，本发明的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段对人食管癌Eca-109细胞和人乳腺癌Bcap-37细胞均具有明显的抑制作用。
实施例2
人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤模型
实施例目的：
按照《抗肿瘤药物药效学指导原则》和《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》的要求，测试人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段(合成号为cz-420，实验编号为多肽420)在1ug/kg的浓度下对人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植肿瘤生长有无抑制作用及作用强度。
2.1材料与方法
2.1.1受试样品：
多肽420由上海强耀生物科技有限公司合成。RPS6亚基抗癌肽段(多肽)的氨基酸序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84。纯度为92.91％。(RPS6亚基抗癌肽段的合成号为：cz-420；在实验研究中标记为多肽420，文中出现的多肽420即为人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段)。
2.1.2配制方法：1mg多肽420溶于1ml的生理盐水中，然后倍比稀释，得到所需浓度的多肽溶液。
2.1.3对照药物：
注射用环磷酰胺，厂家：江苏恒瑞医药股份有限公司。批号：10071021；
配制方法：每次给药前用生理盐水稀释至浓度为2mg/ml的溶液。
2.1.4组别及给药方案：
模型对照组：尾静脉注射生理盐水，0.1ml/10g，每天1次，持续10次；
环磷酰胺组：腹腔注射2mg/ml环磷酰胺溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。
多肽420组：尾静脉注射0.1ug/ml的多肽420溶液，0.1ml/10g，每天1次，持续10次。
2.1.5受试动物：
来源、种系、品系：BALB/c裸小鼠，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
实验动物生产许可证：SCXK(沪)2007-0005；合格证编号：2007000546410；实验动物使用许可证：SYXK(军)2007-030；日龄：4-5w；性别：雄性；动物数：每组6只，共18只。
2.1.6模型的制备
收集培养的Eca-109细胞悬液，浓度为1X107个/ml，以每只0.1ml接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。
2.1.7分组与给药
裸鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，接种8天后，肿瘤生长至50-100mm3时将动物随机分组，每组6只。同时，各组裸鼠开始给药，给药方案见组别与给药方案，使用测量瘤径的方法，动态观察受试样品的抗肿瘤效应。给药10天后继续观察6天随即处死裸鼠，手术剥取瘤块称重。
抗肿瘤活性的评价指标：肿瘤生长抑制率(％)，计算公式如下：
2.1.8统计处理
均值用X±SD表示，组间分析用t检验进行统计学处理，应用SPSS(StaffsticalPackage for the Social Science)17.0对结果进行统计分析。
2.2实施例结果与结论：
本实施例建立了人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤模型，利用该模型评价了多肽420在1ug/kg浓度时的抗肿瘤活性。实验结果为：多肽420的抑瘤率为59.09％。而相同条件下，阳性对照环磷酰胺组(20mg/kg)的抑瘤率为55.49％。结论为：多肽药物420在1ug/kg的浓度下有显著的抗肿瘤活性，抑瘤率>40％，且和模型组比有显著性差异。本实施例的实验结果如表1所示；本实施例中多肽420对人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用如图2所示；本实施例中取得的肿瘤实物如图3所示。
由本实施例的实验数据可以得出，本发明人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段即多肽药物420对人食管癌细胞Eca-109具有显著的抑制作用。
表1多肽420对人食管癌细胞Eca-109裸鼠异种移植瘤生长的抑制作用(X±SD，n＝6)
＊P＜0.05，＊＊P＜0.01
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 侯万儒
<120> 一种人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 核糖体蛋白(RPS6)
<400> 1
Ile Ser Gly Gly Asn Asp Lys Gln Gly Phe Pro Met
1 5 10

Claims (3)

1.人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段，其特征在于，所述人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段的氨基酸序列为：ISGGNDKQGFPM；分子量为1250.41；PI为5.84。
2.权利要求1所述的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在制备抗人类食管癌药物中的应用。
3.权利要求1所述的人类核糖体蛋白RPS6亚基抗癌肽段在制备抗人乳腺癌药物中的应用。
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