CN104480211B - 鉴别南方红豆杉幼苗的分子特异性标记引物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及鉴别南方红豆杉幼苗的分子特异性标记引物及方法。用于鉴别南方红豆杉<i>T.chinensis</i>及其2个相似种（曼地亚红豆杉<i>T.madia</i>及东北红豆杉<i>T.cuspidata</i>）的分子特异性标记引物的上游引物NHSF：如SEQ？ID？NO.1所示；下游引物NHSR：如SEQ？ID？NO.2所示。利用分子特异性标记引物NHSF/NHSR，通过常规PCR方法可对南方红豆杉<i>T.chinensis</i>及其2个相似种进行快速的分子鉴定，方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成，是形态特征辨别南方红豆杉<i>T.chinensis</i>及其2个相似种的有效辅助。
Description
技术领域
本发明涉及一种鉴别南方红豆杉Taxuschinensis的分子特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对南方红豆杉进行快速鉴别的方法。
背景技术
南方红豆杉Taxuschinensis是裸子植物亚门（Cymnospermai）松杉纲（Coniferopside）红豆杉目（Taxales）红豆杉科中(Taxaceae)红豆杉属(Taxus)植物，是我国特有的第四纪孑遗植物，主要分布于长江流域、南岭山脉山区及河南、陕西、秦岭、甘肃等省的山地或溪谷。南方红豆杉既有重要的观赏价值，又有重要的药用价值。其中含有的紫杉醇更是重要的治疗癌症药物。由于自然繁殖更新能力较低，加上人类过度砍伐，导致南方红豆杉数量越来越少，目前已处于濒危状态。在幼苗期间，南方红豆杉T.chinensis与曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata的茎和叶型相似度非常高，利用形态学鉴别方法很难将南方红豆杉与其它两种红豆杉区分开。因而，在过去的很多年里，将曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata错误鉴定为南方红豆杉T.chinensis的情况时有发生。
对3种红豆杉辨别的主要特征是宏观上差异并不是很显著的叶或茎的性状。但是形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，而对幼苗期间的样本，仅靠叶、茎的形状差异更是难以准确鉴定。因此，在红豆杉分类研究上，分子标记技术成为了对红豆杉标本辅助鉴别的重要手段。
真核生物的核糖体基因rRNA的内转录间隔区（InternalTranscribedSpacer,ITS）的保守性非常强。种内ITS序列相对一致，而种间差异比较明显，这一特点使得ITS序列不仅适合于属内物种间的系统发育分析，而且非常适合于植物物种的分子鉴定。对南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata的ITS区序列测序结果显示，T.chinensis、T.madia和T.cuspidata的ITS（ITS1-5.8S-ITS2）序列长度均为1100bp左右。因此，很难运用通用ITS引物（ITS4/ITS5）的PCR扩增、普通电泳对3个相似种进行准确鉴别。通过对三个相似种的ITS序列比对分析发现三者的局部序列存在碱基差异，本研究根据这一特点，设计开发了用于鉴别南方红豆杉的ITS特异性引物。本发明为南方红豆杉及其相似种的分子辅助鉴别提供了可能性，对有效的鉴别和保护南方红豆杉种质资源具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种可鉴别南方红豆杉T.chinensis与其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗的分子特异性标记引物。
本发明开发一种鉴别南方红豆杉T.chinensis与其相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗的分子特异性标记引物，其核苷酸序列如下：
上游引物NHSF：5’-CCCGAAGTGTCGCCGGGCAGCC-3’，如SEQIDNO.1所示；
下游引物NHSR：5’-TCCGCACAAATCCGTGACCTCG-3’，如SEQIDNO.2所示。
此对分子特异性引物是采用普通PCR技术，经过对南方红豆杉T.chinensis与其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗样本的核糖体ITS区序列的克隆测序，然后对测序获得的3个相似种ITS序列进行碱基差异比对，并以此设计分子特异性引物（NHSF/NHSR）。上述引物对具有极高的专一性，用此对引物对T.chinensis，T.madia和T.cuspidata进行PCR扩增，可以从T.chinensis中获得695bp大小的特异性片段。
本发明还涉及上述开发的分子特异性引物（NHSF/NHSR）在鉴别南方红豆杉T.chinensis与其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）幼苗样本中的应用。
本发明的另一个目的是提供利用上述分子特异性标记引物对南方红豆杉与其2个相似种（曼地亚红豆杉及东北红豆杉）进行快速鉴别的方法。
本发明采用上述分子特异性标记引物（NHSF/NHSR）作为特异性扩增引物，以待测红豆杉样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现695bp的DNA带谱，则待测红豆杉样本为南方红豆杉T.chinensis；若电泳结果未出现695bp的DNA带谱，则待测红样本为曼地亚红豆杉或东北红豆杉。
上述方法中扩增引物的选择、基因组DNA提取、PCR反应体系及反应条件确定，以及电泳检测，这些步骤均可按照本领域常规方法进行。
需要说明的是，本发明分子特异性标记引物和检测方法仅适用于南方红豆杉T.chinensis及其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）的鉴别，即待测标本是限定为南方红豆杉样本、曼地亚红豆杉样本及东北红豆杉样本的范围内，本领域普通技术人员根据3个相似种的形态学特征进行初步的判断，再将判断为T.chinensis、T.madia或T.cuspidata的红豆杉样本利用本发明方法进行鉴别。采用本发明方法可对南方红豆杉及其2个相似种（曼地亚红豆杉和东北红豆杉）进行快速的分子鉴别，方法简便、准确、快速，是形态学鉴别方法的有效补充。
具体的所述方法如下：
（1）取待测红豆杉幼苗期间样本叶片0.2g，加入液氮磨碎至粉末，利用植物基因组DNA提取试剂盒提取待测红豆杉的基因组DNA；
（2）以步骤（1）提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物（NHSF/NHSR）作为扩增引物，进行PCR扩增：
PCR反应体系(总体积为25μl)组成为：
| 成分组成 | 体积 |
| 10×Buffer（含Mg2+） | 2.5 μl |
| dNTPs (10mM) | 1.0 μl |
| 上游引物(10μM) | 1.0 μl |
| 下游引物(10μM) | 1.0 μl |
| Taq酶(2U/μl) | 0.4 μl |
| 模板DNA (50ng/μl) | 1.0 μl2 --> |
| ddH2O | 18.1 μl |
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环（94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸1.5min）；最后于72℃下延伸10min。
（3）用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）PCR扩增产物，然后利用凝聚成像分析仪拍照，若电泳结果出现695bp的DNA指纹带谱，则待测红豆杉样本为南方红豆杉，若电泳图上未出现695bp的DNA指纹带谱，则待测红豆杉种类为曼地亚红豆杉或东北红豆杉。
本发明的有益效果主要体现在：本发明的分子特异性标记引物（NHSF/NHSR）可对南方红豆杉T.chinensis与2个相似种T.madia及T.cuspidata进行快速的分子鉴定，方法简单、准确，灵敏度高，是形态特征辨别这3个红豆杉相似物种的有效辅助手段。
附图说明
图1是采用本发明的核酸特异性标记引物对南方红豆杉T.chinensis及其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）进行PCR扩增的电泳图；其中通道M为DNA分子量标准markerDL2000；通道1～4：曼地亚红豆杉T.madia；通道5～8：南方红豆杉T.chinensis；通道9～12：东北红豆杉T.cuspidata；通道C:阴性对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别南方红豆杉T.chinensis及其2个相似种（曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata）。
实施例1
1.待测红豆杉样本基因组DNA的提取
剪取幼苗期间的待测红豆杉样本叶片0.2g,立即加入液氮研磨至粉末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取待测红豆杉样本基因组DNA，用1﹪琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，稀释至50ng/μl，-20℃冰箱存放备用。
2.设计合成特异性PCR扩增引物
设计合成基于南方红豆杉ITSrDNA基因序列获得的南方红豆杉特异性引物，上游引物NHSF：5’-CCCGAAGTGTCGCCGGGCAGCC-3’和下游引物NHSR：5’-TCCGCACAAATCCGTGACCTCG-3’，由上海生物工程技术有限公司合成。
3.分子特异性标记引物（NHSF/NHSR）的PCR扩增
PCR扩增体系：反应体系为25μl，10×Buffer（含Mg2+）2.5μl，dNTPs(10mM)1μl,上游引物NHSF(10μM)1μl,下游引物NHSR(10μM)1μl,Taq酶(2U/μl)0.4μl，模板DNA(50ng/μl)1μl，ddH2O18.1μl。
PCR反应程序为：94℃预变性5min；35个循环（94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸1.5min）；最后于72℃下延伸10min。
4.电泳检测：取步骤（3）PCR扩增产物5μl，利用1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图如图1所示。
按照上述方法，分别对南方红豆杉T.chinensis、曼地亚红豆杉T.madia及东北红豆杉T.cuspidata样本进行检测，以无菌水为阴性对照，电泳图见图1，其中编号为5～8的T.chinensis样本扩增出分子量为695bp的特异性DNA条带，而编号为1～4的T.madia样本及编号为9～12的T.cuspidata未扩增出该条带。这表明本发明的核酸分子引物具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别南方红豆杉及其2个相似种（曼地亚红豆杉和东北红豆杉）样本。
SEQUENCELISTING
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Claims (4)
1.鉴别南方红豆杉幼苗的分子特异性标记引物，其特征在于该引物核苷酸序列如下：
上游引物NHSF：5’-CCCGAAGTGTCGCCGGGCAGCC-3’，如SEQIDNO.1所示；
下游引物NHSR：5’-TCCGCACAAATCCGTGACCTCG-3’，如SEQIDNO.2所示。
2.如权利要求1所述的分子特异性标记引物，其特征在于该分子特异性标记引物在鉴别南方红豆杉T.Chinensis、曼地亚红豆杉T.Madia、东北红豆杉T.cuspidata中的应用。
3.一种利用如权利要求1所述的分子特异性标记引物进行鉴别南方红豆杉T.chinensis及曼地亚红豆杉T.madia和东北红豆杉T.cuspidata的方法，其特征在于该方法是首先提取待测红豆杉幼苗样本基因组DNA作为模板，以分子特异性标记引物NHSF/NHSR作为扩增引物，进行PCR扩增，得到扩增产物；然后对扩增产物进行电泳检测：若电泳结果出现695bp的DNA条带，则待测红豆杉样本为南方红豆杉T.chinensis；若电泳结果未出现695bp的DNA条带，则待测红豆杉样本为曼地亚红豆杉T.madia或东北红豆杉T.cuspidata。
4.如权利要求3所述的利用如权利要求1所述分子特异性标记引物进行鉴别南方红豆杉T.chinensis及曼地亚红豆杉T.madia和东北红豆杉T.cuspidata的方法，其特征在于PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，64℃退火45s，72℃延伸1.5min，35个循环；最后于72℃下延伸10min。
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