CN102424837B - 用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒及使用方法。本发明的用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒内包括有两对人工序列SEQ No.1和SEQ No.2。本发明的用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒使用方法是首先从检材中提取DNA，然后用试剂盒内的两条引物进行聚合酶链式反应得到产物，将反应产物用琼脂糖凝胶电泳回收后进行本科切反应，然后再在玉脂糖中进行电泳，获得PCR-RFLP指纹图谱，根据PCR-RFLP指纹图谱中是否存在特定条带区分鉴别出检材属于何种带绦虫。
Description
技术领域
本发明涉及一种寄生虫分类检测试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法，确切讲本发明是一种用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒及这种试剂盒的使用方法。
背景技术
猪带绦虫(Taenia solium)、牛带绦虫(Taenia saginata)和亚洲带绦虫(Taeniaasiatica)是3种重要的人兽共患寄生虫病病原，且其成虫均寄生于人小肠内。三种成虫，尤其亚洲带绦虫与牛带绦虫的成虫特征几乎完全一致，依靠形态特征很难加以鉴别，况且很多情况下仅能得到成熟节片，所以导致主要依赖头节形态的显微镜观察显得无能为力。而幼虫形态、中间宿主种类和人体感染途径等却存在明显差别。人体感染猪带绦虫主要因生食含有囊尾蚴的猪肉引起，感染牛带绦虫主要因生食含有囊尾蚴的牛肉引起，人体感染亚洲带绦虫主要因生食含有囊尾蚴的猪肝或野猪等野生动物的内脏引起。绦虫病严重影响人们的身体健康和畜牧业经济的发展，因此加强人体带绦虫病流行区带绦虫的虫种鉴定及流行病学调查，明确各地区带绦虫的优势虫种，指导有关部门制定正确的预防、控制和净化措施，以及对临床患者进行科学有效的治疗均具有重要意义。
现有技术可以利用DNA探针进行三种虫种的鉴定，但成本相对较高。Yamasaki等利用多重PCR扩增线粒体cox1基因，对3种带绦虫进行鉴别，参见：“DNA differential diagnosis of taeniasis and cysticercosis by multiplex PCR.J Clin Microbiol”2004；42：548-553.MULTIPLEX PCR DIAGNOSIS FOR TAENIASIS AND CYSTICERCOSIS，SOUTHEASTASIAN J TROP MED PUBLIC HEALTHVol 35(Suppl 1)2004：275-279，“Molecular Identification of TaeniaTapeworms by Cox1 Gene in Koh Kong，Cambodia”，Korean J Parasitol Vol.49，No.2：195-197，June 2011。但这一技术中在PCR反应体系里需同时加入3对引物，并且对模板纯度和浓度要求较高，同时还需要摸索不同引物之间的比例，另外采用该方法对各DNA样品进行扩增时不容易获得扩增产物。有学者用细胞色素C氧化酶1(mt COXI)基因片段PCR产物进行PCR反应后鉴别两虫种，或三种虫种，但PCR扩增产物需要测序，时间长，参见：“用cox1基因片段的PCR鉴别亚洲带绦虫和牛带绦虫”贵阳医学院学报2009，34(3)：239-261，“云南6地域带绦虫mtCOXI片段序列测定分析”中国人兽共患病学报(2009)25)12)：1199-1201。另外，现有技术中也有利用PCR产物限制性片段多态性技术，参见：“云贵两省三地带绦虫的分子鉴定-核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析”，中国寄生虫病防治杂志2005，18(5)：330-332JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，Jan.2000，38：133-137，“Differentiating Taenia solium and Taenia saginata Infections by SimpleHematoxylin-Eosin Staining and PCR-Restriction Enzyme Analysis”，用多个酶切对绦虫进行鉴定，但这种方法增加了成本和鉴定的时间。
发明内容
本发明提供一种能同时区分鉴别出检材属于猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫这三带绦虫的具体种类的试剂盒，以及具体的鉴别方法。
本发明的用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒内包括有两对人工序列，即序列表中记载的SEQ No.1和SEQ No.2。为方便具体使用，本发明的试剂盒内还可以放置提取DNA用试剂、PCR扩增用试剂与缓冲液、酶切酶等、
本发明的用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒使用方法，其特征在于从检材中提取DNA，然后用试剂盒内的两条引物进行聚合酶链式反应得到产物，将反应产物用琼脂糖凝胶电泳回收后进行酶切反应，然后再在琼脂糖中进行电泳，获得PCR-RFLP指纹图谱，根据PCR-RFLP指纹图谱中是否存在特定条带区分鉴别出检材属于何种带绦虫。
本发明的具体操作如下：
首先进行DNA基因组的提取：
取20mg左右的绦虫虫体，移入冰水浴冷的研钵中，快速用力研磨成匀浆。加入350ul的Buffer PBS(购自AXYGEN公司)和0.9ul RNase A后温和的研磨30s，收集研磨好的组织匀浆350ul中加入150ul的Buffer C-L和20ul的蛋白酶K，漩涡振荡1min混匀，置56℃水浴30min-60min。然后加入350ul的Buffer P-D，漩涡振荡30s混匀，12000×g离心10min。收集上清入DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；加入500ul的Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液；加入700ul的Buffer W2洗涤，12000×g离心1min，弃滤液，重复洗涤一次；将DNA制备管于12000×g离心1min，加入40ul的Eluent，12000×g离心1min，即为DNA提取液。
进行PCR扩增：
以DNA基因组为模板，采用：
上游引物为5’-TTGTGAAGTTACTGCTAATAATTTCGTGT-3’，
下游引物为5，-ACGTCAAACCATTCAAACAAGCC-3’，进行聚合酶链式反应，具体参数为：PCR扩增为50ul反应体系，包含2×Premix LA Taq溶液缓冲液25ul(购自TaKaRa公司)、浓度为40μmol/L的上游引物2ul、浓度为40μmol/L的下游引物2ul、上述DNA提取液2ul、ddH2O 19ul；扩增反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min30s，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min，得到PCR产物；琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。
进行酶切反应：
将上述PCR产物6ul、10×H Buffer溶液1ul、去离子水2ul、Nde I酶1ul于PCR管中，37℃水浴酶切反应3h，然后进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP指纹图谱。
谱带鉴别：
上述PCR-RFLP谱带中若最大条带为1396bp，则为猪带绦虫，若存在586bp和662bp两条带，则为牛带绦虫，若只存在586bp的条带，则为亚洲带绦虫。
本发明的试剂盒成本低廉，检测操作简便，可以精确区分出三种带绦虫的种类可为疫区有关部门制定正确的预防措施以及后续研究工作提供了保障。
附图说明
图1为使用本发明的试剂盒对检材进行检测的琼脂糖凝胶电泳图，图中：1为猪带绦虫酶切电泳条带；2为.牛带绦虫酶切电泳条带；3.为DL5000Marker；4.亚洲带绦虫酶切电泳条带；其中由于846bp和807bp相差不大，故两条带重叠。
具体实施方式
DNA基因组的提取：
分别取液氮保存罐中存储的牛带绦虫、猪带绦虫、亚洲带绦虫虫体各20mg左右的，移入冰水浴冷的研钵中，倒入液氮快速用力研磨成匀浆。按照AXYGEN公司动植物组织基因组提取试剂盒步骤操作，具体步骤为：加入350ul的BufferPBS(购自AXYGEN公司)和0.9ul RNase A后温和的研磨30s，收集研磨好的组织匀浆350ul中加入150ul的Buffer C-L和20ul的蛋白酶K，漩涡振荡1min混匀，置56℃水浴30min-60min。加入350ul的Buffer P-D，漩涡振荡30s混匀，12000×g离心10min。收集上清入DNA制备管中，12000×g离心1min，弃滤液；加入500ul的Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液；加入700ul的Buffer W2洗涤，12000×g离心1min，弃滤液，重复洗涤一次；将DNA制备管于12000×g离心1min，加入40ul的Eluent，12000×g离心1min，即为DNA提取液。
PCR扩增：
PCR反应体系为50ul，包含2×Premix LA Taq溶液缓冲液25ul(购自TaKaRa公司)、浓度为40μmol/L的上游引物2ul、浓度为40μmol/L的下游引物2ul(上海生工生物工程公司合成)、上述DNA提取液2ul、ddH2O 19ul；扩增反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸2min30s，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min，4℃保存，得到PCR产物；琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。
酶切反应：
将上述PCR产物6ul、10×H Buffer溶液1ul、去离子水2ul、Nde I酶1ul(购自TaKaRa公司)置于PCR管中，37℃水浴，酶切反应5h，然后进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR-RFLP带谱；琼脂糖凝胶电泳条件：10ul酶解液加入1ul的6×上样缓冲液混匀，上样于2.0％的琼脂糖凝胶中(含5ul/100ml EB)，于110V稳压下电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳时间为30min，电泳结束后紫外灯下观察、拍照。
带谱鉴别：
如表1、图1所示，上述PCR-RFLP谱带中若最大条带为1396bp，则为猪带绦虫；若存在586bp和662bp两条带，则为牛带绦虫；若只存在586bp的条带，则为亚洲带绦虫。
表1.三种带科绦虫限制性内切酶Nde I酶切带谱对比表(bp)
Claims (1)
1.用于鉴别区分人带绦虫病种类的试剂盒，其特征在于试剂盒内包括有一对人工序列SEQ No.1和SEQ No.2。
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