CN115011714B

CN115011714B - 检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法

Info

Publication number: CN115011714B
Application number: CN202210355840.4A
Authority: CN
Inventors: 刘亚宝; 储倩; 姜茜
Original assignee: Sichuan Zhongzhihe Biotechnology Co ltd
Current assignee: Sichuan Zhongzhihe Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-04-06
Filing date: 2022-04-06
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2042-04-06
Also published as: CN115011714A

Abstract

本发明实施例提供一种检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法，它包括：用于检测包括曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物对：序列如SEQ ID NO.1所示的正向引物1和SEQ ID NO.2所示的反向引物1；用于检测包括念珠属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物对：序列如SEQ IDNO.4所示的正向引物2A；序列如SEQ ID NO.5所示的正向引物2B和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物2。可同时检测包含念珠属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌、镰刀菌属真菌、新型隐球菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌、耶氏肺孢子菌等真菌，涵盖范围较现有技术更广。

Description

检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法。

背景技术

真菌感染(fungal infection)是指对人类有致病性的真菌感染情况。根据侵犯人体部位的不同，临床上将致病真菌分为浅部真菌和深部真菌。真菌深部感染可侵犯人体皮肤、黏膜、深部组织和内脏，甚至引起全身播散性感染。

近年来，随着高效广谱抗生素、免疫抑制剂和抗恶性肿瘤药物的广泛应用，器官移植、导管技术以及外科其他介入性治疗的深入开展，特别是AIDS的出现，条件致病性真菌引起的系统性真菌病日益增多，新的致病菌不断出现，对免疫力低下的患者尤其是ICU患者的病情带来严重负担。

真菌感染的临床表现主要包括念珠菌病、曲霉病、隐球菌病、接合菌病和马内菲青霉病等。根据国内近期的研究表明，重症监护病房患者的真菌感染发病率为8％-15％，器官移植患者的真菌感染发病率为20％-40％，血液系统肿瘤患者的真菌感染发病率为31％。

真菌感染的实验室检查是包括直接镜检法和培养法、病理学方法、血清学方法和分子生物学方法等检查方法。

直接镜检法和培养法：直接镜检法和培养检查法是形态学检查的基本方法，直接镜检是真菌学检查最经典的方法,具有快速、简便的特点。但阳性率较低，漏诊率高达45％，且阴性结果不能排除诊断，与培养检查结合才能确诊。培养检查法可进一步提高病原体检出的阳性率，同时确定致病菌的种类，缺点是培养时间长。

组织病理学检查：组织病理学检查对于确定致病菌在组织内寄生并了解宿主的反应十分重要，而且一旦在组织切片中发现真菌菌丝和/或孢子，即为诊断的有力证据。传统的真菌诊断弊端是检测敏感性低，无法早期检测出感染。

分子生物学检测：分子生物学方法具备操作简单、特异性强、灵敏度高和时间短的优点，可成为临床上真菌病原体快速检测的方法之一。目前该方法学已成为热点，是真菌感染早期检测的趋势。

目前已有多个专利与真菌分子检测相关：专利CN201010547116.9采用PCR-探针法检测真菌的ITS1序列；专利CN201010227571.0采用PCR-电泳法检测真菌的ITS1和ITS4序列；专利CN202010472532.0采用PCR-探针法检测曲霉属真菌、新生隐球菌属真菌、毛霉属真菌、耶氏肺孢子菌四种真菌的5.8S rRNA序列；专利CN201811594889.5采用PCR-溶解曲线法检测念珠菌、曲霉菌、隐球菌、毛霉菌、耶氏肺孢子菌五种真菌的5.8S rRNA序列；专利CN202011552286.6采用PCR荧光染料法检测检测念珠菌、曲霉菌、毛霉菌等的5.8S rRNA序列；专利CN201910997645.X采用PCR-电泳法检测真菌的28S rRNA序列；专利CN201810899103.4采用PCR-电泳法检测检测念珠菌、曲霉菌两种真菌的5.8S rRNA序列；专利CN201610292208.4采用PCR荧光染料法检测检测念珠菌的18S rRNA序列；专利CN202010553180.1采用PCR-探针法检测念珠菌、曲霉菌、隐球菌三种真菌的5.8S rRNA序列；专利CN201410820825.8采用PCR-探针法检测念珠菌、曲霉菌、隐球菌三种真菌的5.8SrRNA序列；专利CN201811233741.9采用PCR-探针法检测念珠菌、曲霉菌两种真菌的28SrRNA序列。上述真菌检测专利的缺点是检测真菌的种类涵盖范围较小。

发明内容

为解决现有技术检测真菌的种类涵盖范围较小的技术问题，本发明实施例提供一种检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法。

本发明实施例通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明实施例提供一种检测真菌的引物组，它包括：

用于检测包括曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物对：序列如SEQID NO.1所示的正向引物1和SEQ ID NO.2所示的反向引物1；

用于检测包括念珠属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物对：序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物2A；序列如SEQ IDNO.5所示的正向引物2B和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物2。

进一步地，它还包括：

用于检测耶氏肺孢子菌的引物对：序列如SEQ ID NO.8所示的正向引物3和SEQ IDNO.9所示的反向引物3。

第二方面，本发明实施例提供一种与所述引物组配合使用的探针组，它包括：

用于检测包括曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.3所示的探针1；

用于检测包括念珠属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.7所示的探针2。

第三方面，本发明实施例提供一种与所述引物组配合使用的探针组，它包括：

用于检测包括念珠属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.7所示的探针2；

用于检测耶氏肺孢子菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.10所示的探针3。

第四方面，本发明实施例提供一种检测真菌的试剂盒，其特征在于，包括所述引物组和所述探针组。

进一步地，它还包括：用于内参基因检测的引物对和引物探针。

进一步地，所述内参基因为ACTIN基因；用于内参基因检测的引物对为：序列如SEQID NO.11所示的ACTIN基因正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的ACTIN基因反向引物；用于内参基因检测的引物探针为：序列如SEQ ID NO.13所示的探针。

进一步地，所述引物探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；

所述荧光报告基团包括：5-FAM、6-FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5或Quasar670；所述荧光淬灭基团包括：TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB。

第五方面，本发明实施例提供所述引物组和/或所述探针组在检测真菌的试剂盒中的用途。

第六方面，本发明实施例提供一种真菌检测方法，包括：

提取样本基因组DNA作为DNA模板，其中，所述样本为痰液；

使用所述试剂盒，在实时荧光定量PCR仪上对得到的DNA模板进行扩增，同时实时荧光信号采集和分析；

根据荧光信号采集和分析结果判断样本真菌感染情况，实现对真菌的分型/不分型检测。

本发明实施例与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明实施例的一种检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法，通过检测包括曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物对以及检测包括念珠属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物对以及对应的探针组和包括该引物对的试剂盒，可同时检测包含念珠属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌、镰刀菌属真菌、隐球菌属真菌、新生隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌、耶氏肺孢子菌等不同类型的常见可导致人感染的真菌，涵盖范围较现有技术更广。

附图说明

为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为组合方式一对应的信号通道的检测结果示意图，其中，图1A为FAM通道结果示意图，图1B为NED通道结果示意图，图1C为ROX通道结果示意图，图1D为四个通道的结果示意图。

图2为组合方式二对应的信号通道的检测结果示意图。

图3为白色念珠菌最低检测限结果示意图。

图4为酿酒酵母阳性样本测序结果示意图。

图5为阿姆斯特丹曲霉阳性样本测序结果示意图。

图6为异常威克汉逊酵母阳性样本测序结果示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步地详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本发明。

在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。

在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

为解决现有技术检测真菌的种类涵盖范围较小的技术问题，第一方面，本发明实施例提供一种检测真菌的引物组，它包括：

从而，本发明实施例通过检测包括曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物对以及检测包括念珠属真菌、新生隐球菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物对以及对应的探针组和包括该引物对的试剂盒，可同时检测包含念珠属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌、镰刀菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌、耶氏肺孢子菌等不同类型的常见可导致人感染的真菌，涵盖范围较现有技术更广。

进一步地，它还包括：

用于检测包括念珠属真菌、新生隐球菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.7所示的探针2。

用于检测包括念珠属真菌、新生隐球菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物探针：序列如SEQ ID NO.7所示的探针2；

第六方面，本发明实施例提供一种真菌检测方法，包括：

提取样本基因组DNA作为DNA模板，其中，所述样本为痰液；

实施例

发明人通过对真菌的26S rRNA序列分析并设计出可针对多种真菌检测的引物探针组合，可采用多重荧光PCR-探针法在一个反应体系中同时检测包含念珠属真菌、青霉属真菌、曲霉属真菌、镰刀菌属真菌、新生隐球菌属、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌、耶氏肺孢子菌等不同类型的常见可导致人感染的真菌，涵盖范围较广。

本发明实施例的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法可以适用于肺部感染、血液感染等多种真菌病原体感染的场景中使用。具体序列参考如下表1。

表1泛真菌检测的引物和寡核苷酸探针序列

本发明实施例中的引物探针可用于真菌感染核酸检测。与真菌培养法相比较，本发明试剂的敏感性大于99％，特异性大于93.18％，满足临床检测的需求。本发明检测结果采用PCR+Sanger测序法进行验证，正确率100％。

本发明中的探针可用不同荧光标记，也可采用相同的荧光标记。当使用不同荧光标记时，检测结果可以对真菌进行一定程度的分型；当使用相同荧光标记时，检测结果不分型。荧光报告基团包括但不限于5-FAM、6-FAM、HEX、TET、VIC、JOE、Cy3、Cy3.5、NED、TAMRA、ROX、Texas Red、Cy5、Cy5.5或Quasar670等，荧光淬灭基团包括但不限于TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或MGB等。

以下结合附图说明本发明的具体实施。

实施例一：本实施例提供多种不同引物/探针组合的真菌核酸检测试剂

1.引物/探针组合方式一(分型)参考下表2。

表2

通道	荧光基团	淬灭基团	序列
				1	FAM	BHQ1	SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3
2	NED	MGB	SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7
				3	ROX	MGB	SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10
4	CY5	BHQ2	SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13

2、引物/探针组合方式二，参考下表3。

表3

PCR反应液包含：PCR反应缓冲液，0.1mmol/L～0.5mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸，0.1mmol/L～0.5mmol/L dUTP，靶标基因的上游引物以及下游引物0.2μmol/L～0.6μmol/L，靶标基因的探针0.1μmol/L～0.4μmol/L，内标基因的上游引物以及下游引物0.1μmol/L～0.3μmol/L用于扩增，内标的探针0.05μmol/L～0.2μmol/L，1U/μl～5U/μl Taq DNA聚合酶，1U/μl～5U/μl UNG酶。

组合一和组合二可检测出链格孢、曲霉属、镰刀菌属、青霉属、梭状藻属、念珠菌、隐球菌、新生隐球菌、酵母属、马拉色氏霉菌、毛霉菌、地霉、肺孢子菌等真菌种类。

实施例二：本实施例提供一种检测真菌感染检测试剂的使用方法

1.样本采集

1.1适用样本：痰液样本。

1.2样本采集方法：患者的深肺痰液收集到一次性痰杯中，盖紧杯盖。

1.3采集的标本应及时送检，24小时内检测的应4℃保存。

1.4样本运输应采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

2.样本前处理

2.1痰液液化

取500ul痰液，加入Qiagen DNA Mini Kit推荐液化剂500ul混合，涡旋混匀后液化30min(期间涡旋3-4次)后取400uL上清到1.5ml EP管中，涡旋震荡5min。

2.2痰液样本的核酸提取

可使用商业化痰液核酸DNA提取试剂盒(如Qiagen DNA Mini Kit等)，提取过程应按照商业试剂盒的说明书进行操作，纯化后的核酸可用于后续PCR扩增。

本实施例采用Qiagen DNA Mini Kit，具体操作步骤如下：

2.2.1向已装有痰液处理液400ul的1.5ml EP管中加入180μL buffer ATL和20ul蛋白酶K，涡旋震荡10s后孵育10min。

2.2.2前述EP管中加入200ul buffer AL。混合均匀涡旋振荡15s。

2.2.370℃孵育10min。加入200uL酒精(96％-100％)涡旋振荡15s。短暂离心后，将上清移至QIAamp微型柱中，并将微型柱置于2mL收集管中,盖上盖子。

2.2.4将上述收集管6000xg离心1min。将旧的收集管与滤液一起丢弃。

2.2.5将QIAamp微型柱置于新的2mL收集管中。向QIAamp微型柱中加500μL缓冲液AW1。盖上盖子，6000xg离心1min。将旧的收集管与滤液一起丢弃。

2.2.6将QIAamp微型柱置于新的2mL收集管中。向QIAamp微型柱中加500μL缓冲液AW2。盖上盖子，20000xg离心3min。

2.2.7将QIAamp微型柱放入一个新的2毫升收集管，并将旧的收集管与滤液一起丢弃,以6000xg离心1分钟。

2.2.8将QIAamp微型柱置于干净的1.5mL EP管中。丢弃含有滤液的旧收集管。小心打开盖子并添加200μL缓冲液AE。盖上盖子，然后室温静置1分钟。

2.2.9以8000rpm离心1分钟。丢弃QIAamp微型柱，保留含有洗脱液的EP管，后续可用于PCR扩增。

3.试剂加样

3.1将多种不同引物/探针组合的真菌核酸检测试剂加入到PCR管中。取15μL组合一的PCR试剂加入到PCR中；

3.2上述两种引物/探针组合方式的检测试剂选择一种即可进行后续检测。取5μL处理后样本(或质控品)的核酸(2.2)加入到PCR扩增体系中。盖上PCR管盖子，待上机。

3.3加样方式举例，加样表格如下表4。

表4

注:NC-阴性质控；PC-阳性质控

4.PCR扩增程序设置及运行：

在荧光定量PCR仪器如ABI7500,Bio-Rad CFX96,Roche Light Cycler480,SLAN-96S上进行PCR扩增。

打开仪器，放入待检测的PCR管。

设置扩增程序。选择相应的荧光通道FAM通道(Reporter:FAM，Quencher:None)、NED通道(Reporter:NED，Quencher:None)、ROX通道(Reporter:ROX，Quencher:None)、CY5通道(Reporter:CY5，Quencher:None)。进行样本编辑。

4.4运行扩增程序。

4.5具体扩增程序如下表5所示。

表5

5.结果分析

5.1反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本Ct值和结果。扩增曲线与阈值线的交点，称为Ct值(cycle threshold)；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。

5.2对于测定Ct值≤40的样本，报告为阳性(POS)；对于测定无Ct值或Ct值>40的样本，报告为阴性(NEG)。若内标Ct值>38或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复试验。

6.结果判读

6.1引物/探针组合方式一(分型)的真菌检测试剂结果判读，参考如下表6。

表6

6.2引物/探针组合方式二的真菌检测试剂结果判读，参考如下表7。

表7

实施例三：本实施例提供一种真菌菌株的检测方法

1.在国家微生物保藏中心和四川省抗菌素研究所获得的真菌培养物和细菌培养物，培养物用对应培养基稀释到1X10⁶拷贝/ml浓度。

2.按照实施例二中所述的检测方法，对上述不同浓度的真菌培养物和细菌培养物采用引物探针组合方式一和方式二进行检测，结果统计如下表8(“+”表示有扩增信号，“-”表示无扩增信号，编号1-30为真菌，编号31-36为细菌)。

表8

其中，组合方式一涉及四种荧光信号，以烟曲霉，白色念珠菌，耶氏肺孢子菌为例，其对应的信号通道分别为FAM，NED和ROX，检测结果如图1所示，图1A为FAM通道结果，图1B为NED通道结果，图1C为ROX通道结果，图1D为四个通道的结果。因检测的是微生物培养产物，故内参基因无扩增信号。

组合方式二涉及两种荧光信号，以白色念珠菌为例，其对应的信号通道为FAM，检测结果如图2所示。因检测的是微生物培养产物，故内参基因无扩增信号。

将真菌培养物稀释成不同的浓度梯度进行检测，确定本方法最低检测限为500拷贝/ml，同样以白色念珠菌为例，最低检测限结果如图3所示。

3.按实施例二中所述的两种检测方法，结果显示真菌检出率均为100％，细菌无法检出。根据组合方式一检测结果分析，各真菌菌种在对应的信号通道有扩增信号，在其他信号通道则没有扩增信号，且各信号通道间互不影响。

4.综上所述，本发明实施例可以进行多种属的真菌检测。采用组合方式一可以在一定程度上区分不同的真菌类型，实现真菌的分型检测。采用组合方式二为真菌不分型检测。

实施例四：本实施例提供一种肺部感染患者的真菌核酸检测的实例

1.在四川省人民医院ICU收集肺部感染患者的痰液共计56例，同时与培养法进行比较。

2.真菌核酸检测按照实施例二中所描述的方法进行检测。检测结果如下：本次收集的痰液样本共计56例，其中培养法真菌阳性样本为12例，真菌核酸检测15例，3例差异结果样本采用血清学和Sanger测序法进行验证，以下为3例样本的测序结果。

酿酒酵母阳性样本1例，测序结果(图4)显示序列为：

TTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGT；

阿姆斯特丹曲霉阳性样本1例，测序结果(图5)显示序列为：

CGTGTCTATCTGTACCCTGTTGCTTCGGCGTGGCCACGGCCCGCCGGAGACTAACATTTGAACGCTGTCTGAAGTTTGCAGTCTGAGTTTTTAGTTAAACA；

异常威克汉逊酵母阳性样本1例，测序结果(图6)显示序列为：

GATAAACCTTACACACATTGTCTAGTTTTTTTGAACTTTGCTTTGGGTGGTGAGCCTGGCTTACTGCCCAAAGGTCTAAACACATTTTTTTAATGTTAAAA。

临床样本检测结果统计如下表9所示。

表9

综上所述，本发明方法与真菌培养法比较，敏感性及特异性更强，检出率更高，同时操作简单，耗时短，该方法可满足真菌感染在临床辅助诊断的要求。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省亚中基因科技有限责任公司

<120> 检测真菌的引物组、探针组、试剂盒、用途及检测方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtcgagtwgt ttgggaatgc 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcttcccttt caacaatttc ac 22

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catctttcga tcactctact tgtgcgctat cgg 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagttgtttg ggaatgcagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgttacttgg gagtgtagcg 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccctttca acaatttcac gt 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcactgtact tgttcgctat cggtct 26

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gactagagat cgggcga 17

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggctccac tcctgg 16

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

catcttatga gaaatcaaag tcttcgggtt cc 32

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgagcgcggc tacagct 17

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccttaatgt cacgcacgat tt 22

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

accaccacgg ccgagcgg 18

Claims

1.一种多重荧光PCR检测真菌的引物和探针试剂盒，其特征在于，它包括：

用于检测曲霉属真菌、青霉属真菌和/或镰刀菌属真菌的引物对和探针：序列如SEQ IDNO.1所示的正向引物1和SEQ ID NO.2所示的反向引物1；探针的序列如SEQ ID NO.3所示的探针1；

用于检测念珠属真菌、新生隐球菌属真菌、隐球菌属真菌、酵母属真菌、毛霉属真菌和/或地霉属真菌的引物对和探针：序列如SEQ ID NO.4所示的正向引物2A；序列如SEQ IDNO.5所示的正向引物2B和序列如SEQ ID NO.6所示的反向引物2；探针的序列如SEQ IDNO.7所示的探针2；

用于检测耶氏肺孢子菌的引物对和探针：序列如SEQ ID NO.8所示的正向引物3和SEQID NO.9所示的反向引物3；探针的序列如SEQ ID NO.10所示的探针3。

2.如权利要求1所述的一种多重荧光PCR检测真菌的引物和探针试剂盒，其特征在于，还包括：用于内参基因检测的引物对和探针。

3.如权利要求2所述的一种多重荧光PCR检测真菌的引物和探针试剂盒，其特征在于，所述内参基因为ACTIN基因；用于内参基因检测的引物对为：序列如SEQ ID NO.11所示的ACTIN基因正向引物和序列如SEQ ID NO.12所示的ACTIN基因反向引物；用于内参基因检测的探针为：序列如SEQ ID NO.13所示的探针。

4.如权利要求2所述的一种多重荧光PCR检测真菌的引物和探针试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团；