CN101191144A - 一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法 - Google Patents

Abstract

一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，采用DNA分子标记物分类法，其特征在于：以待鉴定红豆杉基因组DNA为模板，用引物分别扩增DNA标记序列，DNA标记序列包括五种叶绿体分子标记和两种细胞核分子标记；所述的叶绿体分子标记，包括psbA－trnH^GUG，trnL^UAA－trnL^UAA－trnF^GAA，trnS^GCU－trnQ^UUG，trnS^UGA－trnG^GCC，trnS^GCU－trnG^UUC－trnG^UUC；所述的细胞核分子标记，包括ITS，18S rRNA；将扩增后的DNA标记序列测序，与已知的相关序列比对，以鉴定真伪和/或相似物种。

Description

一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法

技术领域

本发明涉及21种植物DNA序列，具体涉及八种红豆杉的DNA分子标记序列。

背景技术

紫杉烷是一类二萜化合物，来源其中的紫杉醇是过去10多年内最有效的抗癌药之一。紫杉醇等紫杉烷化合物广泛存在于红豆杉属植物的茎、叶和树皮中，目前已从其中已分离得到300余种紫杉烷二萜类化合物(J.Nat.Prod.1999，62，1448-1472)。作为获取紫杉醇药物的唯一来源，红豆杉生长缓慢，天然资源有限，人工发现和培育红豆杉资源是有效地协调和利用资源的重要保障。

不同种类的红豆杉植物代谢物谱变化很大，鉴别和分类红豆杉植物在制药领域有重要应用价值。现有的分类方法包括1，形态学鉴定(肉眼的和显微镜下的)和

2，细胞遗传学鉴定(染色体计数，核型分析等)。

3，化学分类法

4，DNA分子标记物分类法，已在GenBank，DDBJ和EMBL等核酸序列数据库中可查到的有

A.Dennis Collins等以聚合酶链反应(PCR)扩增叶绿体trnL-F序列，用XbaI和VspI酶切以鉴别欧洲红豆杉，东北红豆杉和加拿大红豆杉(AmJ Botany 2003，90，175-182)，

B.Li J等用PCR扩增12种红豆杉(不包括云南红豆杉)的ITS序列并测序(Harvard Papers in Bota.2001，6，267-274)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，该方法通过从八种红豆杉基因组中分离出的与各有用成分含量和红豆杉特性相关的DNA分子遗传学标记，用于红豆杉品种鉴定，选育和真伪鉴别，鉴定结果非常准确。

具体地，本发明提供了一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，采用DNA分子标记物分类法，其特征在于：

——以待鉴定红豆杉基因组DNA为模板，用引物分别扩增DNA标记序列，DNA标记序列包括五种叶绿体分子标记和两种细胞核分子标记；所述的叶绿体分子标记，包括psbA-trnH^GUG，trnL^UAA-trnL^UAA-trnF^GAA，trnS^GCU-trnQ^UUG，trnS^UGA-trnG^GCC，trnS^GCU-trnG^UUC-trnG^UUC；所述的细胞核分子标记，包括ITS，18S rRNA；

——将扩增后的DNA标记序列测序，与下述相关序列比对，以鉴定真伪和/或相似物种；

与南方红豆杉(Taxus mairei)特性及紫杉烷含量相关的南方红豆杉特异DNA分子标记序列有：

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与云南红豆杉特性及紫杉烷含量相关的云南红豆杉特异DNA分子标记序列有：

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18S rRNA

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ITS

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与中华红豆杉特性及紫杉烷含量相关的中华红豆杉特异DNA分子标记序列有：

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与东北红豆杉(Taxus cuspidata)特性及紫杉烷含量相关的东北红豆杉特异DNA分子标记序列有：

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trnS^GCU-trnQ^UUG

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18S rRNA

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与曼地亚红豆杉(Taxus media)特性及紫杉烷含量相关的曼地亚红豆杉特异DNA分子标记序列有：

psbA-trnH^GUG

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trnS^UGA-trnG^GCC

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trnS^GCU-trnQ^UUG

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ccgattatctcatgatttcg ttcgccaata aggggatatg gcgaaatcgg taga

与欧洲红豆杉(Taxus baccata)特性及紫杉烷含量相关的欧洲红豆杉特异DNA分子标记序列有：

psbA-trnH^GUG

ttatgcatgaacgtaatgctcacaacttccctctggatctagctgctgttgaagctaattctatagacggctaattaatc

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gatttcgttcgccaataaggggatatggcgaaatcggtaga

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增叶绿体分子标记trnL^UAA-trnL^UAA-trnF的引物可以是B49317：CGAAATCGGTAGACGCTACG和Trn-f：ATTTGAACTGGTGACACGAG。(文献1 Taberlet P，Gielly L，Pautou G，Bouvet J.Universal primers foramplification of three non-coding regions of chloroplast DNA.Plant Mol Biol.1991；17：1105-9.)

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增叶绿体分子标记psbA-trnH^GUG的引物可以是psbA3′f：GTTATGCATGAACGTAATGCTC和TrnHf：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。(文献2 Kress WJ，Wurdack KJ，ZimmerEA，Weigt LA，Janzen DH.Use of DNA barcodes to identivy flowering plants.Proc Natl Acad Sci U S A.2005；102：8369-74.)

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增叶绿体分子标记trnS^GCU-trnQ^UUG的引物可以是TrnS：TTACCGAGGGTTCGAATCCCTC和TabB：TCTACCGATTTCGCCATATC。(文献3 Shaw J，Lickey EB，Beck JT，Farmer SB，Liu W，Miller J，Siripun KC，Winder CT，Schilling EE，Small RL.The tortoise and the hare II：relative utilityof 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis.Am JBotany.2005；92：142-66).

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增叶绿体分子标记trnS^UGA-trnG^GCC或trnS^GCU-trnG^UUC-trnG^UUC的引物是trnS^GCU：AGATAGGGATTCGAACCCTCGGT和3’trnG^UUC：GTAGCGGGAATCGAACCCGCATC。(文献3 Shaw J，Lickey EB，Beck JT，Farmer SB，Liu W，Miller J，Siripun KC，Winder CT，Schilling EE，Small RL.The tortoise and the hare II：relative utility of 21 noncoding chloroplast DNAsequences for phylogenetic analysis.Am J Botany.2005；92：142-66).

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增细胞核分子标记18S rRNA 的引物是F：TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC和R：CAACATCGGCGACGGAAACCA。

本发明鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法中，用于扩增细胞核分子标记ITS的引物是ITS5a：CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

本发明还特别提供了两种引物用于PCR扩增分子标记，它们分别是：

一种用于扩增细胞核分子标记18S rRNA的引物，F：TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC。

一种用于扩增细胞核分子标记18S rRNA的引物，R：CAACATCGGCGACGGAAACCA。

本发明通过对与紫杉烷含量相关的特异DNA分子标记进行扩增和测序，与基因数据库的同源序列比对，用于红豆杉种属鉴定，真伪鉴别，品种选育，法医学分析与资源保护等，为可持续开发红豆杉资源，良好农业规范和良好操作规范提供高通量的可靠技术。

具体实施方式：

从红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，扩增条件如下：psbA-trnH，18S rRNA和ITS，94℃5分钟，40次循环：94℃30秒，52℃50秒，72℃1分48秒，最后72℃7分钟；trnSGGA-trnTUGU-trnLUAA，trnL^UAA内含子和trnS^UGA-trnG^GCC，94℃5分钟，40次循环：94℃30秒，50℃1分钟，72℃2分钟，最后72℃7分钟。PCR反应液经优化后的成分为：模板DNAl微升(约50ng)，10×PCR缓冲液5微升，2.5mM dNTP4微升，10μM正向和反向引物各3微升，Takara ExTaq 0.4微升，10mg/ml牛血清白蛋白0.5微升，25mMMgCl₂ 2微升，灭菌蒸馏水31.1微升，总体积50微升。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭染色，凝胶成像系统照相。

实施例1～8：DNA序列标记用于红豆杉真伪鉴别与物种鉴定

实施例1：从东北红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF和ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为东北红豆杉。其余四个标记测序结果进一步证实(表1)。

实施例2：从云南红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为云南红豆杉。其余五个标记测序结果进一步证实。

实施例3：从中华红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF，18S rRNA和ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为中华红豆杉。其余三个标记测序结果进一步证实。

实施例4：从南方红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF，18S rRNA和ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为南方红豆杉。其余三个标记测序结果进一步证实。

实施例5：从曼地亚红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。18S rRNA和ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为曼地亚红豆杉。其余三个标记测序结果进一步证实。

实施例6：从欧洲红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF和ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为欧洲红豆杉。其余四个标记测序结果进一步证实。

实施例7：从Hunnewell红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。ITS序列结果与NCBI GenBank中已知序列相同，证实样品为Hunnewell红豆杉。其余五个标记测序结果进一步证实。

实施例8：从加拿大红豆杉新鲜叶片，茎，种子和/或烘干叶片中提取基因组DNA。用Takara PCR仪扩增各分子标记，PCR产物纯化后转入克隆载体pMD19T，测序。trnL^UAA-trnL^UAA-trnF和ITS序列结果与NCBIGenBank中已知序列相同，证实样品为加拿大红豆杉。其余四个标记测序结果进一步证实。

表1.新发现红豆杉分子标记的GenBank登录号及红豆杉枝叶来源

用上述方法对表1中的东北红豆杉，云南红豆杉AF001，中华红豆杉，南方红豆杉LS001，曼地亚红豆杉DICP001进行测序鉴定证实其身份。各分子标记有无及大小见表2。

表2.七类分子标记在红豆杉及相关物种中的分布及大小(bp)

NA，PCR阴性

实施例11～13：伪品和未知样品的鉴定

实施例11

一份来自湖北房县的“香榧”样品，经trnL^UAA intron分子标记测序，与GenBank中已知序列比对，发现其与已知序列仅84％相同。psbA-trnH^GUG测序结果与GenBank中已知序列比对，与三尖杉仅有三碱基差异。其它四种分子标记测序结果证实该样品为三尖杉。

实施例12

一份来自湖北神农架的“小叶”红豆杉样品，经trnS^UGA-trnG^GCC分子标记测序，与曼地亚红豆杉相应序列比对，发现二者相同。其它五种分子标记测序结果证实该样品为曼地亚红豆杉。

实施例13

2一份来自加拿大滑铁卢大学的红豆杉样品，经六个分子标记测序，与已知红豆杉相应序列比对，发现其为hunnewell红豆杉。

Claims (9)

1.一种鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，采用DNA分子标记物分类法，其特征在于：

——以待鉴定红豆杉基因组DNA为模板，用引物分别扩增DNA标记序列，DNA标记序列包括五种叶绿体分子标记和两种细胞核分子标记；所述的叶绿体分子标记，包括psbA-trnH^GUG，trnL^UAA-trnL^UAA-trnF^GAA，trnS^GCU-trnQ^UUG，trnS^UGA-trnG^GCC，trnS^GCU-trnG^UUC-trnG^UUC；所述的细胞核分子标记，包括ITS，18SrRNA；

——将扩增后的DNA标记序列测序，与下述已知的相关序列比对，以鉴定真伪和/或相似物种；

与南方红豆杉(Taxus mairei)特性及紫杉烷含量相关的南方红豆杉特异DNA分子标记序列有：

1 psbA-trnH^GUG

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3 trnS^GCU-trnQ^UUG

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与云南红豆杉特性及紫杉烷含量相关的云南红豆杉特异DNA分子标记序列有：

4 trnS^GCU-trnQ^UUG

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5 psbA-trnH^GUG

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6 trnS^UGA-trnG^GCC

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7 18SrRNA

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8 ITS

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与中华红豆杉特性及紫杉烷含量相关的中华红豆杉特异DNA分子标记序列有：

9 trnS^GCU-trnQ^UUG

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10 psbA-trnH^GUG

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11 trnS^UGA-trnG^GCC

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与东北红豆杉(Taxus cuspidata)特性及紫杉烷含量相关的东北红豆杉特异DNA分子标记序列有：

12 psbA-trnH^GUG

gtttatgcaa tgaacgtaat gctcacaact tccctctgga tctagctgct gttgaagctaattctataga cggctaatta

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13 trnS^UGA-trnG^GCC

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cgttctaaat tactcttcgattcctctagc ccggccagta tctggccagg ctatgatctt ccctatatca

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14 trnS^GCU-trnQ^UUG

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15 18SrRNA

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与曼地亚红豆杉(Taxus media)特性及紫杉烷含量相关的曼地亚红豆杉特异DNA分子标记序列有：

16 psbA-trnH^GUG

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17 trnS^UGA-trnG^GCC

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18 trnS^GCU-trnQ^UUG

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与欧洲红豆杉(Taxus baccata)特性及紫杉烷含量相关的欧洲红豆杉特异DNA分子标记序列有：

19 psbA-trnH^GUG

ttatgcatgaacgtaatgctcacaacttccctctggatctagctgctgttgaagctaattctatagacggctaattaatcaatccga

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20 trnS^UGA-trnG^GCC

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21 trnS^GCU-trnQ^UUG

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2.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增叶绿体分子标记trnL^UAA-trnL^UAA-trnF的引物是B49317：CGAAATCGGTAGACGCTACG和Trn-f：ATTTGAACTGGTGACACGAG。

3.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增叶绿体分子标记psbA-trnH^GUG的引物是psbA3′f：GTTATGCATGAACGTAATGCTC和TrnHf：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。

4.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增叶绿体分子标记trnS^GCU-trnQ^UUG的引物是TrnS：TTACCGAGGGTTCGAATCCCTC和TabB：TCTACCGATTTCGCCATATC。

5.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增叶绿体分子标记trnS^UGA-trnG^GCC或trnS^GCU-trnG^UUC-trnG^UUC的引物是trnS^GCU：AGATAGGGATTCGAACCCTCGGT和3’trnG^UUC：GTAGCGGGAATCGAACCCGCATC。

6.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增细胞核分子标记18S rRNA的引物是F：TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC和R：CAACATCGGCGACGGAAACCA。

7.按照权利要求1所述鉴定和区分与紫杉烷含量相关的有用红豆杉的方法，其特征在于：用于扩增细胞核分子标记ITS的引物是ITS5a：CCTTATCATTTAGAGGAAGGAG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC。

8.一种用于扩增细胞核分子标记18SrRNA的引物，22F：TCAAAGATTAAGCCATGCATGTC。

9.一种用于扩增细胞核分子标记18SrRNA的引物，23R：CAACATCGGCGACGGAAACCA。