CN104762370B - 鉴定区分中国红豆杉属种和品种的核苷酸序列和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鉴定区分中国红豆杉属种和品种的核苷酸序列，该序列该序列来源于须弥红豆杉原变种的核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔(ITS1)区序列，可用于对照鉴别中国红豆杉属种和品种；通过从DNA水平上分析中国红豆杉属植物种质资源的遗传特征，为区分红豆杉属下的种和品种提供了有效的分子标记，为红豆杉种和品种的鉴定区分和筛选优良种质奠定了良好的基础。同时，本发明提供了一种利用上述核苷酸序列鉴定红豆杉属植物种的方法，该方法操作简单易行，可达到方便快速、客观准确区分红豆杉属植物的不同种和品种的目的。
Description
技术领域
本发明属于药用观赏植物种质资源的鉴定技术领域，特别涉及一种鉴定区分中国红豆杉属种和品种的核苷酸序列和方法。
背景技术
红豆杉属植物为常绿小乔木或灌木，雌雄异株，为典型的阴性树种，基本无纯林存在。由于其耐荫性较好，如套种在其他用材林下，既可改善林相景观效果、又可提高林地综合经济效益。由于种群竞争力弱、天然更新缓慢和地理分布局限等客观因素，红豆杉属植物早在80年代就被列入国家二级保护植物，90年代以来，随着抗癌新药紫杉醇的开发利用，红豆杉原料供需矛盾日益突出，人类掠夺式的生产经营活动，加剧了其濒危程度。1999年我国将红豆杉属的全部植物种列入国家一级保护植物。
根据最新的中国植物志英文版，中国红豆杉属下共有5个种，分别为密叶红豆杉(Taxus fuana)、须弥红豆杉(Taxus wallichiana var.wallichiana)、红豆杉(Taxuswallichiana var.chinensis)、南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)、以及东北红豆杉(Taxus cuspidata)。国内外的研究已表明，红豆杉是获得紫杉醇的最佳药源植物来源之一，同时具有重要药用价值和优良园林观赏价值。由于栽培历史悠久，红豆杉的种间或种内杂交常有发生，再加之从形态分类学的角度很难区分不同的红豆杉种枝叶，品种与紫杉醇含量都难以保证，这已成为中国红豆杉属植物产业发展的瓶颈。有研究证实不同种的红豆杉在形态特征、生物量及紫杉醇含量等方面都有较大差异。目前在红豆杉遗传分化和遗传多样性研究方面，除了采用形态解剖学、细胞学和植物化学等方法外，在分子水平上系统地对中国红豆杉属下的种和品种的遗传背景、亲缘关系的研究报道较少。
随着现代分子生物学的研究深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态DNA(RAPD)、ISSR标记、AFLP技术等得到了广泛应用。这些方法各具优势但也存在很多的不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的揭示亲缘物种间的演化关系，但受试验条件限制较大且不稳定；ISSR标记具有快速、简便及多态性高等优点，但其引物通用性较差，操作要求高花费大。
ITS序列是中度重复序列，广泛分布于基因组并且是同步进化的，它的碱基序列同源性的程度决定了生物之间的亲缘关系的远近，并以此作为分类依据来划分物种。本发明结合以上分子标记的方法和技术优点，依据分子标记技术的原理，设计出一对特异引物进行PCR反应，目的是提出一种特异性鉴定红豆杉种的分子鉴别方法，为中国红豆杉属的种和品种的鉴别提供依据，并希望得到广泛的实际应用与推广。
发明内容
本发明的主要目的是针对目前存在的红豆杉种和品种问题，提供一种鉴定中国红豆杉属植物的引物，从DNA水平上分析红豆杉种质资源的遗传特性，为区分中国红豆杉属植物的种和品种提供有效的分子标记，为中国红豆杉属植物的种和品种的真伪鉴定和质量优劣鉴定、及筛选优良种质等奠定基础。
为了实现本发明目的，本发明设计一种红豆杉属植物的PCR检测特异引物对，其中包括正向引物序列TITS1：5’-GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，反向引物序列TITS2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
本发明还提供了一种利用上述核苷酸序列鉴定区分中国红豆杉属植物的种和品种的方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
鉴定中国红豆杉属植物的种和品种的核苷酸序列，该序列来源于须弥红豆杉原变种的rDNA的ITS序列(GenBank中序列编号为EF660577.1)，具体如SEQ ID NO.1所述。
利用上述核苷酸序列鉴定区分中国红豆杉属植物的种和品种的方法，收集测试样品的茎、叶(花)芽、或叶片，按照下述主要步骤进行鉴定工作：
(1)总DNA的提取及纯化
取待检植物的叶片、叶(花)芽或茎，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒提取总DNA。
(2)PCR反应
以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板进行PCR反应。所用引物分别为，正向引物序列TITS1：5’-GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，反向引物序列TITS2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系为：10×PCR buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物TITS1/TITS2各1μL，DNA模板1μL，5U/μL Taq酶0.2μL，加灭菌双蒸水至终体积为20μL；PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；再72℃延伸10min。
(3)PCR产物检测与纯化
将步骤(2)获得的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；并用QIAGEN试剂盒或其他方法纯化，按试剂盒操作指南进行。
(4)DNA序列测定
将步骤(3)纯化后的产物直接进行测序，得到待检样品的ITS1区碱基序列。
(5)DNA序列数据分析及种类的鉴别
将步骤(4)获得的碱基序列通过MEGA(Molecular Evolutionary GeneticsAnalysis)5.05分子进化遗传分析软件中的CLUSTAL W对序列进行排列并人工校正，采用邻接法构建NJ系统树进行聚类分析，其中个分支的置信度用自展检验法检验，共进行2000次循环，评价各分支系统学意义与可靠性。最终根据序列比对和聚类分析的结果鉴别区分中国红豆杉属植物的种和品种。
为了使测定结果尽可能准确可靠，每一个样品从提取总DNA、PCR扩增、产物纯化，到测序、分析等重复进行多次。
附图说明
图1为利用本发明设计的特异性引物进行的PCR检测，鉴定中国红豆杉属植物的种和品种的电泳结果。
图1中：M为DNA MARKer DL2000，1-8分别为曼地亚红豆杉(Taxus x media)、欧洲红豆杉(Taxus baccata)、密叶红豆杉(Taxus fuana)、须弥红豆杉(Taxus wallichianavar.wallichiana)、红豆杉(Taxus wallichiana var.chinensis)、南方红豆杉(Taxuswallichiana var.mairei)、假种皮黄色的南方红豆杉假种皮黄色(Taxus wallichianavar.mairei yellow)、以及东北红豆杉(Taxus cuspidata)。
图2为不同材料ITS序列聚类分析结果图。
以红豆杉科穗花杉(Amentotaxus argotaenia)为外类群(GenBank系列号为AF259285.1)进行分析。从图中可以清楚的区分不同的红豆杉种：曼地亚红豆杉是欧洲红豆杉和东北红豆杉的自然杂交种，可以看出这三者亲缘关系较近；须弥红豆杉种下的须弥红豆杉原变种、南方红豆杉、红豆杉聚为一类；自然变异为黄色假种皮的南方红豆杉与其原变种的亲缘关系最近。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例
实施例
本实施例测定了来自不同种源地的8份红豆杉属种质资源的rDNA ITS1序列，分别为：中国红豆杉属下的5个种(及1个自然突变品系)，包括密叶红豆杉(Taxus fuana)、须弥红豆杉(Taxus wallichiana var.wallichiana)、红豆杉(Taxus wallichianavar.chinensis)、南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei)、假种皮黄色的南方红豆杉(Taxus wallichiana var.mairei yellow)、东北红豆杉(Taxus cuspidata)，以及国外的2个种，曼地亚红豆杉(Taxus x media)和欧洲红豆杉(Taxus baccata)。以红豆杉科穗花杉(Amentotaxus argotaenia)为外类群(GenBank系列号为AF259285.1)。采用的方法包括如下具体步骤：
(1)总DNA提取
取待检植物的叶片、叶(花)芽或茎，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒提取总DNA。
具体方法按如下步骤操作：①取2-3g组织剪碎放入研钵加液氮研磨成粉末；②加入20μL蛋白酶K，涡旋混合均匀，56℃孵育直至溶解；③加入200μL buffer AL并涡旋使充分混匀，70℃孵育10min，然后加入200μL乙醇(96％-100％)，再次涡旋混合；④移出步骤3中的混合物(包括沉淀物)至DNeasy Mini spin column，该柱子放在一2mL收集管中，6000×g(8000rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液；⑤将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中，加入500μL buffer AW1，6000×g(8000rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液；⑥将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中，加入500μL buffer AW2，20,000×g(14,000rpm)离心3min，使Dneasy膜干燥，收取管子，弃去滤液；⑦向DNeasy Mini spincolumn膜移入2mL的微量离心管中，直接加入200μL buffer AE，清洗DNeasy Mini spincolumn膜，室温孵育1min，然后6000×g(8000rpm)离心1min。
(2)PCR反应
将提取得到的总DNA样品为模板进行PCR反应。所用引物分别为，正向引物序列TITS1：5’-GG AAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，反向引物序列TITS2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反应体系为：10×PCR buffer(含Mg2+)2μL，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物TITS1/TITS2各1μL，DNA模板1μL，5U/μL Taq酶0.2μL，加灭菌双蒸水至终体积为20μL；PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；再72℃延伸10min。
(3)PCR产物检测与纯化
将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测；按以下具体步骤进行纯化：①往含有PCR产物的EP管中加入1/10体积的3M NaAc，到管底；②每管加入2.5倍体积的100％无水乙醇，混匀；③2000-3000g离心30min，去除乙醇；④每管加入100μL 70％乙醇，1650g 4℃离心15min，去除乙醇；⑤重复70％乙醇洗涤1次；⑥让残余的乙醇挥发干，加入原体积一半的去离子水溶解DNA。
(4)DNA序列测定
将纯化后的PCR产物直接进行测序，得到待检样品的ITS1区碱基序列。
(5)DNA序列数据分析及种类的鉴别
将获得的碱基序列通过MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)5.05分子进化遗传分析软件中的CLUSTAL W对序列进行排列并人工校正，采用邻接法构建NJ系统树进行聚类分析，其中个分支的置信度用自展检验法检验，共进行2000次循环，评价各分支系统学意义与可靠性。最终根据序列比对和聚类分析的结果鉴别区分中国红豆杉属植物的种和品种。
为了使测定结果尽可能准确可靠，每一个样品从提取总DNA、PCR扩增、产物纯化，到测序、分析等重复进行多次。
Claims (2)
1.鉴定中国红豆杉属下种和品种的核苷酸序列，该序列来源于须弥红豆杉原变种的核糖体DNA的内转录间隔ITS1区序列，具体序列如下：
GTCGTTTTAAAAGTGAACCGTGCAGGGGAGTGGGCGTGTTCGGCACGTCCGGTGCGTCTCCTCCCCGTCCGCCGCTCTTGCGGGAGTTTGGACTGAAGTTCCGGATGCTTTTCCCTTTGCAATGCCTCCGGGGTCCCCTCCGCTGGCTTTCTCTCGGGTGGGCGTTCCGGTCTTCTCAAGTTGTTCTCCTGCGGTTCGGGTTATTACAAGGGCGAGTGCCAATGTCGTCTACAGTGTGGCTATGCGAGGGGCTCGTTTTCGGCTGCAGTGGGTGCACCAGCGACTCTGTTCGTCTGGCAGTCCTGCTCCTTTGCGGTCGAAGGGTCCCAGCAATTTCCACCTGCTAGGCGGTTCCTTGCAAACGCCCGTGGCTGCTTTGCAGACCGTTGAACATTTGCCGGTCTGCAAAGCAGCTGCAACCCCCCGAAGTGTCGCCGGGCAGGTAATGCCGTACAGATTATTTCGAGCCTTTGGACGGGTGCACCTGCGTACGTCGCCGGGCGGGACGACCGTCCACTGGTTCCGTTCTCATCTGTTCGGTCTCCGGCCTTTCGACACTCCGGGGCGGGGACACCCTTTCTCCGATTTTCCCCCACGGGGCATCGCCTCTGGTTGCAGGGGGGCGTCGAGTGGAGGTGCGTGTCATAACACTCAACGCATCGGTGCGGATTGCACCAAGGATCTGATAAATAGCTGTGCGGGCTGCGCGCCATGCGCGCGTCGGACT。
2.一种如权利要求1所述的核苷酸序列用于鉴定区分中国红豆杉属下种和品种的方法，其特征在于：收集新鲜的植物样品，按照下述具体步骤进行品种鉴定工作：
(1)总DNA的提取
取待检植物新鲜的叶片、叶芽、花芽或茎，用无菌水处理后，在液氮中研成粉末，用QIAGEN试剂盒、CTAB法或其他方法提取总DNA；
(2)PCR反应
以步骤(1)提取得到的DNA样品为模板进行PCR反应，所用引物分别为，正向引物序列TITS1：5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’，反向引物序列TITS2：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；PCR反应体系为：10×PCRbuffer2μL，所述10×PCRbuffer含Mg2+，2.5mM dNTPs 2μL，10μM引物TITS1/TITS2各1μL，DNA模板1μL，5U/μL Taq酶0.2μL，加灭菌双蒸水至终体积为20μL；PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火40s，72℃延伸1min，共30个循环；再72℃延伸10min；
(3)PCR产物检测与纯化
将步骤(2)获得的产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测；并用QIAGEN试剂盒或其他方法纯化，按试剂盒操作指南进行；
(4)DNA序列测定
将步骤(3)纯化后的产物直接进行测序，得到待检样品的ITS1区碱基序列；
(5)DNA序列数据分析及种类的鉴别
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