CN107164487A - 一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。(1)本发明所述引物对能够以含量极少、片段极短的红豆杉样品DNA为模板，快速、准确鉴定红豆杉的品种；(2)本发明采用连续两轮PCR的方法保证鉴定成功率为100％。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种采用分子生物学手段鉴定中药的方法，具体为一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用。
背景技术
红豆杉，民间一般称为“紫杉”，含有多种药用成分。关于红豆杉属植物的药用功能最早记载于《本草纲目》，可用于治疗霍乱、伤寒等症。《本草推陈》也对其药用功能有过相关记载：“紫杉可入药，利尿、通经、治肾病，用皮易呕吐，本部及叶不吐”。民间和传统中医药对于红豆杉属植物的利用也有着悠久的历史记载，用以消积、润燥、利尿、通经、消炎，并可治疗多种肠道寄生虫病。最新药理学研究发现，红豆杉属植物具有抑菌敛毒、消炎排毒的作用，对上呼吸道炎症具有治疗作用，对糖尿病、肾脏病、高血压和高血脂症具有显著疗效。
不同种的红豆杉属植物中紫杉醇含量不同，其药效也就不同。如中国红豆杉、云南红豆杉、西藏红豆杉、东北红豆杉、南方红豆杉以及曼地亚红豆杉树木各部位的平均含量均不同。因此，红豆杉药材的鉴别对于植物资源保护及中药材安全合理利用都具有重要的意义。
虽然通过植物形态学可以方便的对红豆杉进行鉴定，但是，目前市场上的红豆杉药材大多为饮片或粉末，一经加工成饮片或粉末后，很难利用常规中药鉴定手段鉴别这些药材来源于哪种红豆杉属植物。
随着现代分子生物学的研究深入和发展，一些分子标记技术如限制性片段长度多态性、随机扩增多肽DNA、ISSR标记、AFLP技术等得到了广泛应用。这些方法各具优势但也存在很多不足。RFLP技术稳定、重复性强，但探针制备繁琐；RAPD方法可以很好的揭示亲缘物种间的演化关系，但受实验条件限制较大且不稳定；ISSR标记具有快速、简便及多态性高等优点，但其引物通用性较差，造作要求高花费大。
一方面，由于中药在制备过程中其DNA严重破坏，且大量损失，因此成品中所含DNA含量极少，片段极短，如何富集这些仅有的少量DNA片段是必须面临的一个挑战；另一方面，红豆杉药材中最主要的成分是各种蛋白，这些蛋白的存在必然对DNA提取和纯化工作造成严重干扰，因此影响到后续的鉴定效果。
发明内容
本发明的目的是：为了克服现有技术的缺陷，获得一种能够富集市售中药红豆杉样品中含量较少、片段极短的DNA，进而快速、准确鉴定其品种的方法，本发明提供了一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用。
技术方案：一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。
优选的，所述引物对P1、P2的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.5。
表1引物对及发卡结构序列
| 名称 | 序列(5，-3，) | SEQ ID NO. |
| P1-F | ATGCGATACTTGGTGTGAAT | 1 |
| P1-R | GACGCTTCTCCAGACTACAAT | 2 |
| P2-F | AAGTAAAAGTCGTAACAAGG | 3 |
| P2-R | TCCTCCGCTTATTGATATGC | 4 |
| 发卡结构 | CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG | 7 |
所述引物对在制备鉴定中药红豆杉试剂盒中的应用。
优选的，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
优选的，所述试剂盒鉴定中药红豆杉的步骤包括：
(1)提取市售红豆杉药材样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)收集第二轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步的，所述红豆杉样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
进一步的，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
有益效果：(1)本发明所述引物对能够以含量极少、片段极短的红豆杉样品DNA为模板，快速、准确鉴定红豆杉的品种；(2)本发明采用连续两轮PCR的方法保证鉴定成功率为100％。
附图说明
图1是实施例1～3PCR鉴定结果电泳图；
其中M为分子量为2000的Maker；1为实施例1PCR产物鉴定结果；2为实施例2PCR产物鉴定结果；3为实施例3PCR产物鉴定结果。
具体实施方式
实施例1
一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。
所述引物对P1、P2的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.5。
所述引物对在制备鉴定中药红豆杉试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药红豆杉的步骤包括：
(1)提取市售红豆杉药材样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)收集第二轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述红豆杉样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例2
一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。
所述引物对P1、P2的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.5。
所述引物对在制备鉴定中药红豆杉试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药红豆杉的步骤包括：
(1)提取市售红豆杉药材样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释80倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)收集第二轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述红豆杉样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
实施例3
一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，所述引物对及其序列为：P1，SEQ ID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。
所述引物对P1、P2的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.5。
所述引物对在制备鉴定中药红豆杉试剂盒中的应用。
所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
所述试剂盒鉴定中药红豆杉的步骤包括：
(1)提取市售红豆杉药材样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)收集第二轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
所述红豆杉样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
如图1所示，将实施例1～3的扩增产物进行电泳检测，条带清晰可见，产物单一。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州市李良济健康产业有限公司
<120> 一种用于鉴定中药红豆杉的引物对及其应用
<130>
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgcgatact tggtgtgaat 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gacgcttctc cagactacaa t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagtaaaagt cgtaacaagg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgcccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggggg 40
Claims (7)
1.一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，其特征在于，所述引物对及其序列为：P1，SEQID NO.1～2；P2，SEQ ID NO.3～4。
2.根据权利要求1所述的一种用于鉴定中药红豆杉的引物对，其特征在于，所述引物对P1、P2的上游引物的5，端加上特异性的GC发卡结构，所述发卡结构的长度为40bp，序列为SEQ ID NO.5。
3.权利要求1或2所述引物对在制备鉴定中药红豆杉试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的组分包括：引物对、dNTP、DNA聚合酶、LC Green、反应缓冲液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒鉴定中药红豆杉的步骤包括：
(1)提取市售红豆杉药材样品的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以P1为特异性引物，进行第一轮PCR扩增；
(3)取步骤(2)的扩增产物，稀释50～100倍后作为第二轮PCR的模板，以P2作为特异性引物，进行第二轮PCR扩增；
(4)收集第二轮PCR扩增的产物，并采用琼脂糖凝胶电泳检测。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述红豆杉样品的基因组DNA的提取方法是试剂盒法或改良CTAB法。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，55s，35个循环；72℃，7min。
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