CN101712933A

CN101712933A - 一种弯孢属菌株及其用于防除杂草的用途

Info

Publication number: CN101712933A
Application number: CN 201010001011
Authority: CN
Inventors: 邓晖; 牛永春
Original assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Resources and Regional Planning of CAAS
Priority date: 2010-01-18
Filing date: 2010-01-18
Publication date: 2010-05-26
Anticipated expiration: 2030-01-18
Also published as: CN101712933B

Abstract

本发明涉及一种弯孢属的新菌株PPF-002，名称为近缘弯孢(Curvularia affinis Boedijn)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2010年1月13日，保藏号：CGMCCNo.3569，该菌株对狗尾草的致病性强，并且有较强的专一性。菌株PPF-002与农药领域常用的载体组成除草组合物可用于防除禾本科杂草狗尾草和马唐，可与其他适合的微生物及其产品如生物肥料、对其他杂草防除效果较好的菌株等配合使用。

Description

一种弯孢属菌株及其用于防除杂草的用途

技术领域

本发明涉及一种近缘弯孢(Curvularia affinis Boedijn)的菌株PPF-002，含有该菌株的组合物及其防治狗尾草或马唐的用途。

背景技术

杂草主要是通过与农作物争夺水、肥、光、生长空间以及他感作用等抑制农作物的生长发育导致减产，据统计，每年因杂草危害造成的农作物减产9.7％，全世界达2亿吨，中国因草害年损失农产品可达到近400万吨。随着人们生活水平的日益提高，各地区不断地改善环境，尤其城市的绿化面积越来越大，草坪地也越来越多。草坪事业的发展以及草坪建植质量是人民生活水平的高低和国家文明建设程度的象征之一。杂草是草坪养护管理中的重点和难点，尤其禾本科杂草与北方地区广泛采用的冷季型草坪草具有形态、生理生态的相似性，并且其发生不整齐，繁殖蔓延迅速，抗逆性和抗药性强，防除非常困难，严重影响了草坪的美观及功能。北京地区种植的草坪有草地早熟禾、高羊茅等，由于化学防治技术的薄弱及草坪管理不善，杂草引起的草坪退化甚为严重，新建草坪若不治理杂草，3-5年便被杂草替代，来不及拔除就只能更换草坪，造成了严重的浪费。在北京草坪禾本科杂草的调查中，狗尾草和马唐分别被列为严重杂草和比较严重的杂草。

狗尾草危害35个国家的29种作物，大多数为谷类、蔬菜和豆类作物。据报道，狗尾草被认为是谷子的原始祖先，约公元前6000年谷子被中国的耕作者从狗尾草中选育出来。自从第一种作物在中国和欧洲种植，狗尾草就已经成为作物田中的杂草。

马唐被作物世界18大恶性杂草之一，对于热带和温带环境适应能力都比较强，在非常多国家的很多种作物田中都能够发现，生长繁殖快而又难于防除，在世界各地危害严重，曾被报道危害56个国家的33种作物。

化学除草剂从应用至今已有60多年的历史，曾挽回了约50％的粮食产量损失，在提高作物产量方面起到过不可低估的作用，同时也带来了一系列的生态环境问题，尤其是多种杂草对化学除草剂产生了抗药性，使得研制与开发化学除草剂的成本大大增加，因此研究人员不断寻找新的途径来防除杂草。目前，生物除草剂多是利用真菌，故将利用真菌研制的生物除草剂称之为真菌除草剂，它是一类施用技术和方法类似化学除草剂并用以防治特定杂草的活真菌产品。因而研究除草效果好且具有潜在应用价值的真菌资源是真菌除草剂研究方面重要的前期基础性工作。

发明内容

为获得对禾本科杂草有效的微生物，发明人从全国各地采集了大量的寄生于禾本科杂草上的真菌标本，通过筛选，发现一种属于弯孢属的新菌株PPF-002，具有很好的防治禾本科杂草狗尾草和马唐的效果。

因此，本发明的目的是提供一种弯孢属的菌株PPF-002。

本发明的新菌株PPF-002已经于2010年1月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC No.3569。该菌株为近缘弯孢(Curvularia affinisBoedijn)，隶属于旋孢腔菌属(Cochliobolus Drechsler)[无性阶段：弯孢属(Curvularia Boedijn)]，格孢腔菌科(Pleosporaceae Nitschke)，格孢腔菌目(Pleosporales Luttrell ex Barr)，格孢腔菌亚纲(Pleosporomycetidae)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，子囊菌门(Ascomycota)，真菌界(Fungi)。

本发明的新菌株PPF-002是通过下述途径获得的，发明人对北京地区的农田、草坪、荒地环境狗尾草和马唐的发病情况进行调查并采集发病的植物叶片和茎秆，记录植株发病症状及有关信息，回实验室后进行镜检。

1病原真菌的分离

分离用培养基的制备：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)，121℃湿热灭菌30分钟，在灭菌的平板中加入3滴25％乳酸后，倒入适量PDA培养基，轻摇混匀后静置。

从野外采集有典型叶斑症状的叶片用于病原菌的分离。将供试样品病健交界处切取5mm×5mm的组织块，置4％次氯酸钠溶液小烧杯中3至5分钟，无菌水漂洗3次，移至分离用PDA培养基上培养，每平板置4个组织块，每份样品接种两皿；每份样品分离前更换漂洗用的三个小烧杯中无菌水。在培养箱中25℃条件下培养3～5天，纯化长出的病原真菌，将菌株接种至PDA斜面上于4℃冰箱中保藏。

2病原真菌的鉴定

2.1菌株的形态学鉴定

对分离出来的菌株镜检，观察产孢情况，对未产孢的菌株转到燕麦培养基(Oatmeal Agar)、水琼脂培养基(Tube Water Agar)、玉米粉培养基(CMA)上促使其产孢。将菌株接种在适宜的培养基上，26℃恒温培养3天，记录菌落形态，取直径2cm的菌饼放在铺有两层湿润滤纸的培养皿中，4天后挑取少量菌丝制片，观察记录孢子形态及产孢结构，测量孢子(30个)和孢子梗宽度等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定。

菌株PPF-002的形态特征与Sivanesan对近缘弯孢Curvularia affinisBoedijn的描述(Sivanesan A.，Graminicolous species of Bipolaris，Curvularia，Drechslera，Exserohilum and their teleomorphs.Mycological Papers，1987，158：1～261.)基本一致，鉴定结果为C.affinis。描述如下：在PDA培养基上菌落灰黑，表面灰白色，絮状，菌落背面黑色，易产孢。菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗单生或稀疏丛生，直立或弯曲，曲膝状延伸，黄褐色，基部细胞膨大，顶端细胞色浅，多数分生孢子梗宽4.5～7.5μm。分生孢子多数直，有的弯曲，浅褐至黄褐色，两端细胞较小色浅，顶端细胞近无色，中间细胞大色深，宽纺锤形或椭圆形，多数具4个隔膜，少数3个隔膜，大小19.5～35×7～12.5μm，平均24.5×10.5μm；脐部略突出。

2.2菌株的DNA提取、PCR扩增及扩增产物的序列分析：在PDA平板上铺玻璃纸，然后把供试菌株(PPF-002)接种到玻璃纸上，待菌落接近长满平板时从玻璃纸上收获菌丝体，用SDS法提取基因组DNA(Lee SB & Taylor JW，1990.Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores.In：Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ，White TJ ed.PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications.Academic Press，San Diego，282～287.)，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。

以上述基因组DNA为模板，用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)对供试菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。反应液体积50μL，包括：10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，500mmol/L KCl，0.8％Nonidet P-40)5μL，25mmol/L MgCl25μL，引物ITS4(10μmol/L)和ITS5(10μmol/L)各1μL，10mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，基因组DNA 1μL，双蒸灭菌水34.6μL。PCR反应程序：95℃预变性2min后，95℃变性1min，53℃复性1min，72℃延伸2min，进行34个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物在1.4％琼脂糖凝胶中电泳分离后，于溴化乙锭溶液(0.5μg/mL)中染色15min，通过ALPHA凝胶成像系统显示记录电泳结果。

PCR扩增产物经检测后送到上海英骏生物技术有限公司测序，测序引物为ITS5。对PCR产物进行序列测定，获得的rDNA ITS序列经在NCBI上进行Blast比对，供试菌株与Genbank中Curvularia affinis(登录号：AF071335)同源性最高，为100％。序列比较结果与形态学鉴定结果相符。将菌株PPF-002的序列在GenBank上进行了登录(登录号为GU073105)。

本发明还提供一种除草组合物，包含本发明的近缘弯孢新菌株PPF-002和农药学上可接受的载体。所述的菌株PPF-002可以以被培养的活细胞、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式用于除草组合物中，所述的活细胞可以是分生孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选使用该菌株的分生孢子。

含有菌株PPF-002和载体的本发明除草组合物可被加工成多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂等，优选加工成适于喷洒施用的剂型。上述剂型所使用的载体是农药学上可接受的载体，优选农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体，可以是固体的或液体的形式。固体载体的实例包括矿物，如粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液体载体的实例包括各种有机溶剂，如癸烷和十二烷；植物油；矿物油和水。

根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、粘合剂、稳定剂等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂和/或PH调节剂等。

本发明除草组合物中的菌株PPF-002的分生孢子数量随制剂的形式和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为1×10⁵～1×10⁸个孢子/克，优选5×10⁵～1×10⁶个孢子/克，而对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为2.0×10⁴～1.0×10⁷个孢子/mL，优选1.0×10⁵～1.0×10⁶个孢子/mL。

本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。

本发明的除草组合物可以与其它适合的微生物及其产品如生物肥料、对其他杂草防除效果较好的菌株等配合使用，以增加菌株的用途，减少对环境的污染。

本发明的菌株PPF-002或除草组合物可用于防除禾本科杂草中的狗尾草或马唐。

本发明的菌株PPF-002或除草组合物可用于农田和园林中，优选用于双子叶作物、果园以及园林环境中防除狗尾草或马唐。

本发明对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。

生物学试验

1试验方法

1.1多个菌株对狗尾草和马唐致病性的筛选试验

将狗尾草和马唐的种子播于直径10cm的营养钵中，于光照培养架(光强15000lux，光照/黑暗交替12h/12h)培养至3-4片叶时，间苗至每盆约10株。将供试菌株移至玉米粉琼脂培养基(CMA)平板培养，每菌10板，培养15-30天使其产生足量的孢子。无菌操作台上用刮铲刮取表面菌丝和孢子，无菌水冲洗平板表面，双层无菌纱布过滤，加入0.1％吐温-80，接种前用血球计数板镜检孢子悬浮液的孢子浓度，稀释至1×10⁵个/ml用来接种植株，对照用无菌水加入0.1％吐温-80用来喷洒植株。用微型喷雾器喷洒至培养好并间过苗的植株上，喷至液体沿叶片流下，每株菌接种狗尾草和马唐各6盆，每2盆为1处理，重复3次。接种后置于密闭容器中保湿24h，然后置于光照培养架上(同培养时光照条件)，接种后两周内观察发病情况。

病害调查采用Horsfall & Barratt(1945)的方法进行(Chandramohan S &Charudattan R，2001.Control of seven grasses with a mixture of three fungalpathogens with restricted host ranges.Biological control 22，246～255.)，病害按照病斑占整个叶片的面积分为12级，1级＝0％，2级＝0-3％，3级＝3-6％，4级＝6-12％，5级＝12-25％，6级＝25-50％，7级＝50-75％，8级＝75-88％，9级＝88-94％，10级＝94-97％，11级＝97-100％，12级＝100％，调查每株植株的每片叶片，记录级数。每处理级数的平均数，转换成相应病害级数的平均百分率，进行反正弦转换后进行多重比较分析，数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析。

1.2测定近缘弯孢寄主范围的试验

通过人工接种方法，测定PPF-002菌株对常见禾本科杂草、主要禾本科及非禾本科作物苗期的致病性，以了解其寄主范围。

将供试植物(名单见表2)种子播种于直径10cm的塑料花盆中，每种植物播种6盆，在温度为20～30℃的温室中培育。当供试植物达到2～4片真叶时进行接种，根据供试植物的植株大小每盆保留5～10株。

将接产孢充分的PPF-002菌株菌落用刮铲轻轻刮下，用含有0.05％吐温-80的灭菌水配制悬浮液，经两层纱布过滤，稀释至血球计数板测得浓度为1.0×10⁵个孢子/ml。

采用孢子悬浮液喷雾法接种，用微型喷雾器将混匀的孢子悬浮液均匀喷洒到供试植株上。每种植物接种3盆，另3盆喷含0.05％吐温-80的无菌水做对照。接种后的植株置于密闭容器内室温下保湿培养24h，然后移到人工气候箱中培养，每天光照/黑暗交替12h，光照度16500Lx，温度32℃/25℃(光照/黑暗)、相对湿度80％。接种1周后按下述标准记载发病情况：NS，无症状；LS，有零星病斑；MS，病斑较大、较多；SS，病斑遍布植物叶片，病斑融合，植株死亡。

2测定结果

2.1多个菌株接种狗尾草和马唐后致病性的筛选结果

从2007至2008年在北京地区采集的狗尾草和马唐病害样品中共分离出69株真菌。选择其中有代表性属种的11株菌进行了狗尾草和马唐的致病性测定，其中包括细极链格孢(Alternaria tenuissima)2株，多节平脐蠕孢(Bipolarisnodulosa)1株，穗状平脐蠕孢(B.spicifera)1株，近缘弯孢(Curvularia affinis)1株，香茅弯孢(C.cymbopogonis)1株，间型弯孢(C.intermedia)4株和镰刀菌(Fusarium sp.)1株。(见表1)

供试11个菌株中，有9株菌包括2株细极链格孢，1株多节平脐蠕孢，1株穗状平脐蠕孢，1株近缘弯孢，1株香茅弯孢，2株间型弯孢和1株镰刀菌对狗尾草和马唐的致病效果与对照比均不显著。另2株间型弯孢马唐控制效果与对照比差异显著(P＝0.01)，但对狗尾草致病效果不显著(见表1)。但供试菌株中，PPF-002(近缘弯孢Curvularia affinis)对狗尾草的致病性明显，严重度为78.2％，对马唐的致病性与对照比也是差异极显著(P＝0.01)，植株死亡率为30-55％。

表1.供试菌株及其对马唐和狗尾草接种后的病害严重度

注：¹同列数据后相同字母表示基于方差的多重比较分析差异不显著(P＝0.01)。

2.2测定近缘弯孢寄主范围的试验结果

对10科22种植物进行了菌株PPF-002的接种试验，狗尾草接种后3天开始发病，叶片上产生黄色至黄褐色小斑点，逐步扩大成黑褐色不规则形病斑，接种后14天后30-55％的植株枯萎死亡。该菌株除对狗尾草有很强的致病性，对马唐也有一定的致病效果。但对禾本科其它杂草如稗草、牛筋草无致病性。对禾本科作物小麦、水稻、玉米、高梁和谷子接种后，未出现致病症状，与对照相比差异不显著。供试的双子叶植物包括作物、蔬菜等，如菊科的向日葵，十字花科的甘蓝，葫芦科的黄瓜，豆科的大豆，百合科的洋葱，锦葵科的棉花，胡麻科的芝麻，茄科的番茄，伞形科的胡萝卜等均无致病性。对于常见草坪草，如禾本科的高羊茅、黑麦草和早熟禾，豆科的白三叶等也进行了接种试验，均未出现致病症状(见表2)。通过接种10科22种植物测定致病效果，表明菌株PPF-002寄主范围相对较窄，对于狗尾草的致病性具有较强的专一性。

表2菌株PPF-002对不同植物的致病性

注：NS，无症状；LS，有零星病斑；MS，病斑较大、较多；SS，病斑遍布植物叶片，病斑融合，植株死亡。

Claims

1.一种弯孢属菌株PPF-002，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2010年1月13日；保藏号：CGMCC No.3569。

2.根据权利要求1所述的菌株PPF-002，在PDA培养基上菌落灰黑，表面灰白色，絮状，菌落背面黑色，易产孢。菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗单生或稀疏丛生，直立或弯曲，曲膝状延伸，黄褐色，基部细胞膨大，顶端细胞色浅，多数分生孢子梗宽4.5～7.5μm。分生孢子多数直，有的弯曲，浅褐至黄褐色，两端细胞较小色浅，顶端细胞近无色，中间细胞大色深，宽纺锤形或椭圆形，多数具4个隔膜，少数3个隔膜，大小19.5～35×7～12.5μm，平均24.5×10.5μm；脐部略突出。

3.一种除草组合物，包含权利要求1所述的菌株PPF-002和农药学上可接受的载体。

4.权利要求1的菌株PPF-002用于防除狗尾草或马唐的用途。

5.权利要求3的除草组合物用于防除作物田、荒地、园林和草坪环境中的狗尾草或马唐的用途。

6.根据权利要求5的用途，其中所述的作物优选双子叶植物。