CN101586083B - 一种狗尾草平脐蠕孢菌株及其用于防除杂草的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种狗尾草平脐蠕孢菌的新菌株NY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2009年4月1日，保藏号：CGMCC No.2989，该菌株NY1与农药领域常用的载体组成除草组合物可用于防除禾本科杂草，如狗尾草、虎尾草、马唐、牛筋草、稗草等，优选用于防除狗尾草、马唐、虎尾草。本发明的菌株NY1及其除草组合物可用于非谷子、高粱种植区的农田和园林中禾本科杂草的防除，优选用于阔叶作物中。
Description
技术领域
本发明涉及一种狗尾草平脐蠕孢(Bipolaris setariae(Sawada)Shoemaker)的菌株NY1、含有该菌株的组合物及其防治禾本科杂草的用途。
背景技术
狗尾草(Setaria viridis(L.)Beauv.)俗称毛毛狗、谷莠子、莠草，为起源于欧洲的一年生杂草，在温带地区危害严重，是谷子、麦类、玉米、棉花、豆类、马铃薯等作物田的主要杂草，也是果园、蔬菜田的常见杂草，更是草坪中的顽固性杂草。狗尾草发生极为普遍，除北非、东非和澳大利亚东部一些地区外，大多数欧亚和中东国家均有分布，是我国农田的常见杂草。狗尾草繁殖能力强、生长速度快、生长期长、适应性强，耐旱耐贫瘠，在酸性或碱性土壤上均可生长。农田的狗尾草常与农作物竞争水份和养份，影响作物生长和产量，发生严重时可形成优势种群密布田间，造成作物严重减产。国外曾报道狗尾草导致了小麦减产44％、玉米减产28％、大豆减产29％，也可造成甜菜、葡萄和其他作物的产量损失。牛筋草和稗草被列为世界18大恶性杂草名单中，生长繁殖快而又难于防除，在世界各地危害严重。
目前，杂草的防除主要依赖人工或化学方法，人工除草费工费时，而化学除草造成环境污染问题并导致杂草种群抗性的产生，寻求非化学防除杂草的方法已变得愈加迫切。生物除草剂的研究和开发日益受到重视，利用微生物控制杂草危害正在成为一条有效的新途径。
发明内容
为获得既环保又对禾本科杂草有效的微生物，发明人从全国各地采集了大量的寄生于禾本科杂草上的真菌标本，通过筛选，发现一种属于平脐蠕孢属狗尾草平脐蠕孢的新菌株NY1，具有很好的防治禾本科杂草的效果。
因此，本发明的目的是提供一种狗尾草平脐蠕孢的新菌株NY1。
本发明的新菌株NY1(Bipolaris setariae)已经于2009年4月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2989。该菌株为狗尾草平脐蠕孢，隶属于旋孢腔菌属(Cochliobolus Drechsler)[无性阶段：平脐蠕孢属(Bipolaris Shoemarker)]，格孢腔菌科(Pleosporaceae Nitschke)，格孢腔菌目(Pleosporales Luttrell exBarr)，格孢腔菌亚纲(Pleosporomycetidae)，座囊菌纲(Dothideomycetes)，子囊菌门(Ascomycota)，真菌界(Fungi)。
本发明的新菌株NY1是通过下述途径获得的，发明人对北京、河北、青海、河南等地的农田、草坪、荒地的狗尾草发病情况进行调查并采集发病的狗尾草叶片和茎秆，记录植株发病症状及有关信息，回实验室后进行镜检。
1 病原真菌的分离：从发病部位的病健交界处切取组织块2～5mm2，用0.1％升汞溶液进行表面消毒3min，无菌水换洗3次，移入PDA培养基或CMA(玉米粉琼脂)培养基平板上，26℃恒温箱中培养。待菌落长出后，从组织块菌落边缘挑取少量菌丝，再次移入PDA平板上培养。经过移植纯化，菌落形态和孢子形态均一致的菌株分别移入PDA斜面培养、保存备用。
2 病原真菌的鉴定
2.1菌株的形态学鉴定：将菌株接种在PDA培养基上，26℃恒温培养3天，记录菌落形态，取直径2cm的菌饼放在铺有两层湿润滤纸的培养皿中，4天后制做玻片，观察记录孢子形态及产孢结构，测量孢子(30个)和孢子梗宽度等，进行详细描述，查阅专著文献进行鉴定。
经过鉴定，获得狗尾草平脐蠕孢菌株19株，包括来自狗尾草的菌株16株和来自其它禾本科杂草的菌株3株，各菌株对狗尾草的致病性存在差异，来自狗尾草的菌株比来自其它寄主植物的菌株对狗尾草致病性强，其中菌株NY1致病性最强，接种5天后狗尾草植株叶片即全部呈枯死状，接种后7天整个植株枯萎死亡。
菌株NY1的形态特征与Sivanesan对狗尾草平脐蠕孢Bipolaris setariae(Sawada)Shoemaker的描述(Sivanesan A.，Graminicolous species of Bipolaris，Curvularia，Drechslera，Exserohilum and their teleomorphs.Mycological Papers，1987，158：1～261.)基本一致，鉴定结果为B.setariae。描述如下：在PDA培养基上26℃下生长6天后，菌落直径达64～68mm，灰白色，絮状，菌落背面灰褐色。在PDA培养基上不易产孢，在CMA培养基上易产孢。菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗多单生，直立或稍弯曲，曲膝状延伸，黄褐色，宽7～10μm。分生孢子稍弯曲，很少直，浅褐至黄褐色，顶端细胞色浅，拟纺锤形或梭形，具5～10个隔膜，大小47～88×10～15μm；脐部略突出，平截。
2.2菌株的DNA提取、PCR扩增及扩增产物的序列分析：在PDA平板上铺玻璃纸，然后把供试菌株(NY1)接种到玻璃纸上，待菌落接近长满平板时从玻璃纸上收获菌丝体，用SDS法提取基因组DNA(Lee SB&Taylor JW，Isolation of DNA from fungal mycelia and single spores.In：Innis MA，Gelfand DH，Sninsky JJ，White TJ ed.PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications.Academic Press，San Diego，1990，282～287.)，采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测其纯度和浓度。
以上述基因组DNA为模板，用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)对供试菌株rDNA的ITS区域进行PCR扩增。反应液体积50μL，包括：10×PCR缓冲液(100mmol/LTris-HCl(pH 8.8)，500mmol/L KCl，0.8％Nonidet P-40)5μL，25mmol/L MgCl25μL，引物ITS4(10μmol/L)和ITS5(10μmol/L)各1μL，10mmol/L dNTP 2μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.4μL，基因组DNA 1μL，双蒸灭菌水34.6μL。PCR反应程序：95℃预变性2min后，95℃变性1min，53℃复性1min，72℃延伸2min，进行34个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR产物在1.4％琼脂糖凝胶中电泳分离后，于溴化乙锭溶液(0.5μg/mL)中染色15min，通过ALPHA凝胶成像系统显示记录电泳结果。
PCR扩增产物经检测后送到上海英骏生物技术有限公司测序，测序引物为ITS5。对PCR产物进行序列测定，获得的rDNA ITS序列经在NCBI上进行Blast比对，供试菌株与Genbank中Bipolaris setariae(登录号：EF452444)同源性最高，为100％。序列比较结果与形态学鉴定结果相符。将菌株NY1的序列在GenBank上进行了登录(登录号为FJ606786)。
本发明还提供一种除草组合物，包含本发明的狗尾草平脐蠕孢新菌株NY1和农药学上可接受的载体。所述的菌株NY1可以以被培养的活细胞、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式用于除草组合物中，所述的活细胞可以是分生孢子、菌丝或含有分生孢子和菌丝的菌丝体的形式，优选使用该菌株的分生孢子。
含有菌株NY1和载体的本发明除草组合物可被加工成多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂、水分散粒剂等，优选加工成适于喷洒施用的剂型。上述剂型所使用的载体是农药学上可接受的载体，优选农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体，可以是固体的或液体的形式。固体载体的实例包括矿物，如粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土；植物材料，如玉米粉、豆粉或淀粉；高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二醇。液体载体的实例包括各种有机溶剂，如癸烷和十二烷；植物油；矿物油和水。
根据需要，本发明的除草组合物可使用表面活性剂、粘合剂、稳定剂等助剂，表面活性剂如吐温20、吐温80等，稳定剂可使用抗氧化剂和/或PH调节剂等。
本发明除草组合物中的菌株NY1的分生孢子数量随制剂的形式和施用的方法而变化。固体制剂中，分生孢子的数量为1×105～1×108个孢子/克，优选1×106～1×107个孢子/克，而对于液体制剂，稀释后的喷洒液中分生孢子的含量通常为2.0×104～5.0×106个孢子/mL，优选8.0×104～1.0×106个孢子/mL。
本发明的除草组合物可以与其它适合的化学除草剂配合使用，从而降低化学除草剂的用量，减少对环境的污染。
本发明的菌株NY1或除草组合物可用于防除禾本科杂草，如狗尾草、虎尾草、马唐、牛筋草、稗草等，优选用于防除狗尾草、马唐、虎尾草、稗草。
本发明的菌株NY1或除草组合物可用于非谷子、高梁种植区的农田和园林中，优选用于双子叶植物、果园以及园林环境中防除禾本科杂草。
本发明的除草剂对环境友好，可抑制杂草的耐药和抗药性发展，有利于绿色食品和有机农业的推广，并且成本低、无污染、对农作物安全。
生物学试验
1试验方法
通过人工接种方法，测定NY1菌株对常见禾本科杂草、主要禾本科及非禾本科作物苗期的致病性，以了解其寄主范围。
将供试植物(名单见表1)种子播种于直径10cm的塑料花盆中，每种植物播种6盆，在温度为20～30℃的温室中培育。当供试植物达到2～4片真叶时进行接种，根据供试植物的植株大小每盆保留5～10株。
将NY1菌株接种于玉米粉琼脂培养基(CMA)平板26℃恒温箱中培养。1周后，将菌落用刮铲轻轻刮下，用含有0.05％吐温-80的灭菌水配制悬浮液，经两层纱布过滤，稀释至血球计数板测得浓度为1.2×105个孢子/mL。
采用孢子悬浮液喷雾法接种，用微型喷雾器将混匀的孢子悬浮液均匀喷洒到供试植株上。每种植物接种3盆，另3盆喷含0.05％吐温-80的无菌水做对照。接种后的植株置于密闭容器内室温下保湿培养24h，然后移到人工气候箱中培养，每天光照/黑暗交替12h，光照度16500Lx，温度32℃/25℃(光照/黑暗)、相对湿度80％。接种1周后按下述标准记载发病情况：NS，无症状；LS，有零星病斑；MS，病斑较大、较多；SS，病斑遍布植物叶片，病斑融合，植株死亡。
2测定结果
对10个科24种植物进行了菌株NY1的接种试验，狗尾草接种后3天开始发病，叶片上产生黄色至黄褐色小斑点，叶鞘上也可发生，逐步扩大成椭圆形或纺锤形病斑，大小3～5×2～3mm，边缘黑褐色，中部灰褐色，病斑可进一步扩大融合，形成连片、不太规则的大病斑，5天后狗尾草植株叶片即全部呈枯死状，接种后7天整个植株枯萎死亡。该菌株除对狗尾草有很强的致病性外，对禾本科其它常见杂草马唐、虎尾草也有很强的致病性，接种后一周被接种植株即全部枯死，该菌株对稗草也有一定的致病性；对禾本科作物玉米和小麦有轻微的致病性，只在叶鞘上产生少量较小病斑，病斑扩展缓慢或不进一步扩展；对高梁有中等致病性，而对与狗尾草亲缘关系较近的谷子致病性较强。供试的双子叶植物，如藜科的菠菜，菊科的向日葵、莴苣，十字花科的甘蓝、白菜、萝卜，葫芦科的西瓜、黄瓜，豆科的花生、大豆，百合科的洋葱，锦葵科的棉花，茄科的辣椒、番茄，伞形科的香菜、胡萝卜等均无致病性(表1)。
表1狗尾草平脐蠕孢菌株对不同植物的致病性
| 供试植物 | 感病程度 |
| 禾本科Gramineae | |
| 狗尾草Setaria viridis(L.)Beauv. | SS |
| 马唐Digitaria sanguinalis(Linn.)Scop. | SS |
| 虎尾草Chloris virgata Swartz | SS |
| 稗草Echinochloa crusgalli(Linn.)Beauv. | MS |
| 牛筋草Eleusine indica(Linn.)Gaertn. | LS |
| 小麦Triticum aestivum Linn. | LS |
| 玉米Zea mays Linn. | LS |
| 高梁Sorghum bicolor(Linn.)Moench | MS |
| 谷子Setaria italica(Linn.)Beauv. | SS |
| 藜科Chenopodiaceae | |
| 菠菜Spinacia oleracea L. | NS |
| 菊科Compositae | |
| 向日葵Helianthus annuus L. | NS |
| 莴苣Lactuca sativa L. | NS |
| 十字花科Cruciferae | |
| 甘蓝Brassica oleracea L. | NS |
| 白菜Brassica pekinensis Rubr. | NS |
| 萝卜Raphanus sativus L. | NS |
| 葫芦科Cucurbitaceae | |
| 西瓜Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai | NS |
| 黄瓜Cucumis sativus L. | NS |
| 豆科Fabaceae | |
| 花生Arachis hypogaea L. | NS |
| 大豆Glycine max(L.)Merr. | NS |
| 百合科Liliaceae | |
| 洋葱Allium cepa L. | NS |
| 黄瓜Cucumis sativus L. | NS |
| 锦葵科Malvaceae | |
| 棉Gossypium hirsutum L. | NS |
| 茄科Solanaceae | |
| 番茄Lycopersicon esculentum Mill. | NS |
| 伞形科Umbelliferae | |
| 香菜Coriandrum sativum L. | NS |
| 胡萝卜Daucus carota var.sativa DC. | NS |
注：NS，无症状；LS，有零星病斑；MS，病斑较大、较多；SS，病斑遍布植物叶片，病斑融合，植株死亡。
Claims (7)
1.一种狗尾草平脐蠕孢菌的菌株NY1，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏日期：2009年4月1日；保藏号：CGMCC No.2989。
2.根据权利要求1所述的菌株NY1，其在PDA培养基上26℃下生长6天后，菌落直径达64-68mm，灰白色，絮状，菌落背面灰褐色；在PDA培养基上不易产孢，在CMA玉米粉琼脂培养基上易产孢；菌丝黄褐色，有分枝，多隔膜；分生孢子梗多单生，直立或稍弯曲，曲膝状延伸，黄褐色，宽7-10μm，分生孢子稍弯曲，很少直，浅褐至黄褐色，顶端细胞色浅，拟纺锤状或梭状，具5-10个隔膜，大小47-88×10-15μm；脐部略突出，平截。
3.一种除草组合物，包含权利要求1所述的菌株NY1和农药学上可接受的载体。
4.权利要求1的菌株NY1用于防除禾本科杂草的用途。
5.根据权利要求4的用途，所述的禾本科杂草为狗尾草、马唐或虎尾草。
6.权利要求3的除草组合物用于防除非谷子、高梁种植区的农田和园林作物中的禾本科杂草的用途。
7.根据权利要求6的用途，其中所述的作物为阔叶作物。
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