CN105462858A - 一株短密木霉及其在黄瓜枯萎病防治中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株短密木霉及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。本发明的短密木霉，其菌株号为BF06，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC？No.11845。短密木霉BF06对引起黄瓜枯萎病的尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusarium？oxysporum？f.sp.cucumerinum)具有显著的拮抗作用，使用该菌株分生孢子悬浮液与普通栽培土混合作生防基质，可有效防治黄瓜枯萎病，对黄瓜枯萎病的防治效果为90.4％。本发明为保护地黄瓜无公害生产提供了优良菌种资源，对于黄瓜枯萎病，特别是黄瓜苗期枯萎病的防治具有实用价值。

Description

一株短密木霉及其在黄瓜枯萎病防治中的应用
技术领域
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一株短密木霉及其在黄瓜枯萎病防治中的应用。
背景技术
黄瓜枯萎病又名“萎蔫病”、“蔓割病”、“死秧病”，是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)引起的一种系统性病害，病原菌随种子、土壤、肥料、灌溉水、昆虫、农具等传播，由土壤传染；从根或根颈部，通过根部伤口和根毛顶部细胞间隙侵入；在维管束内寄生繁殖，并向上扩展，堵塞导管，产生毒素使细胞致死(导管型枯萎病)，是黄瓜生产上较难防治的病害之一，常造成较大损失。
病原菌以菌丝体、菌核和厚垣孢子在土壤、病残体和种子上越冬，成为第二年的初侵染源，在土壤中可存活5～6年或更长的时间。土壤中病原菌数量的多少是当年发病程度的决定因素之一，重茬次数越多病害越重。枯萎病的防治目前仍以化学农药防治为主，但一般的化学杀菌剂防效期短，防治效果不理想，并且污染环境，破坏生态平衡。因此迫切需要研究和开发利用有益微生物资源对病害进行生物防治。
木霉属(Trichodermasp.)按照传统分类系统，属于无性型真菌(anamorphicfungi)丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丝孢科(Hyphomycetaceae)，在全世界范围均有分布，主要存在于森林、坡沟、农田、草地等潮湿的生境中，土壤、枯枝落叶腐木等植物残体以及其他真菌的子实体都是其生长基物，其物种多样性丰富。木霉菌是一类重要的自然生物资源，具有较高的经济价值。该属部分种类对植物病原真菌具有较强的杀伤能力，因而作为生物防治制剂广泛使用，目前比较广泛地应用于农业、工业、环境保护等相关领域。
在农业领域，国际上已有50余种木霉生防制剂或菌肥产品注册登记，并进行商业化生产，利用哈茨木霉TrichodermaharzianumRifai和绿木霉T.virensArx生产的商业制剂TRICHODEXXTM和Soil‐GardTM被广泛用于各种植物真菌病害的防治，在农业生产中发挥着重要作用。授权公告号为CN103374536B的发明专利申请公开了枯草芽孢杆菌在黄瓜枯萎病防治中的应用，其对黄瓜苗期枯萎病防效可达58.66％。目前研究的生防制剂对黄瓜枯萎病的防效有待提高，需要寻找发现防效更好的生防制剂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何防治黄瓜枯萎病。
为解决以上技术问题，本发明提供了一株短密木霉。
本发明所提供的短密木霉，其菌株号为BF06，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.11845，下文简称短密木霉BF06。
短密木霉BF06可以分生孢子、菌丝或含有分生孢子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种病原菌抑制剂和一种植物病害抑制剂。
本发明所提供的病原菌抑制剂，它的活性成分是短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物。
上述病原菌抑制剂中，所述病原菌抑制剂对尖孢镰刀菌黄瓜专化型具有抑制作用。
本发明所提供的植物病害抑制剂，它的活性成分是短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物。
上述植物病害抑制剂中，所述植物病害可为黄瓜枯萎病。
上述植物病害抑制剂中，所述黄瓜枯萎病可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。
上述植物病害抑制剂中，所述黄瓜枯萎病可为黄瓜苗期发生的枯萎病。
培养上述短密木霉BF06的方法、制备所述病原菌抑制剂的方法、制备所述植物病害抑制剂的方法均属于本发明的保护范围。
本发明所提供的培养短密木霉BF06的方法，包括将短密木霉BF06在用于培养霉菌的培养基中培养的步骤。
本发明所提供的制备所述病原菌抑制剂的方法或制备所述植物病害抑制剂的方法，包括将短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物作为活性成分，得到所述病原菌抑制剂或所述植物病害抑制剂的步骤。
短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物的下述任一种用途也属于本发明的保护范围：
1)短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物在抑制病原菌中的应用；
2)短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物在抑制植物病害中的应用；
4)短密木霉BF06和/或短密木霉BF06的代谢物在制备植物病害抑制剂中的应用。
上述用途中，所述病原菌可为尖孢镰刀菌黄瓜专化型，所述植物病害可为黄瓜枯萎病。所述黄瓜枯萎病可由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。所述黄瓜枯萎病可为黄瓜苗期发生的枯萎病。
上文中，所述病原菌抑制剂和所述植物病害抑制剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。所述载体可为固体载体或液体载体；所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇和/或聚二醇；所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷和/或十二烷。
所述病原菌抑制剂和所述植物病害抑制剂中，上述短密木霉BF06可以分生孢子、菌丝或含有分生孢子和/或菌丝的菌丝体的形式存在。
所述病原菌抑制剂和所述植物病害抑制剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述病原菌抑制剂和所述植物病害抑制剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
实验证明，短密木霉BF06对引起黄瓜枯萎病的尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)具有显著的拮抗作用，使用该菌株分生孢子悬浮液与普通栽培土混合作生防基质，可有效防治黄瓜枯萎病，对黄瓜枯萎病的防治效果为90.4％。本发明为保护地黄瓜无公害生产提供了优良菌种资源，对于黄瓜枯萎病，特别是黄瓜苗期枯萎病的防治具有实用价值。
保藏说明
菌种名称：短密木霉(Trichodermabrevicompactum)
菌株编号：BF06
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年12月09日
保藏中心登记入册编号：CGMCCNo.11845
附图说明
图1为短密木霉BF06与尖孢镰刀菌黄瓜专化型对峙培养实验结果，其中，1号为对照；2、3、4号皿左边的菌蝶为短密木霉BF06，右边的菌蝶为尖孢镰刀菌黄瓜专化型。
图2为短密木霉BF06防治黄瓜枯萎病实验结果，其中，1、2、3号分别为病原菌接种处理对照的整体、局部和根部；4、5、6号分别为多菌灵处理的整体、局部和根部；7、8、9号分别为短密木霉BF06处理的整体、局部和根部；10、11、12号分别为空白对照处理的整体、局部和根部。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、短密木霉BF06的分离和鉴定
1.1菌株分离
短密木霉BF06是从北京市海淀区凤凰岭森林土壤中分离得到。具体分离筛选方法如下：取10g土样加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100转/min摇床上振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，再依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取以上土壤悬液0.1ml在PDA培养基平板上均匀涂布，超净工作台内吹至略干；每浓度3个重复，置25－28℃恒温箱中培养，出现菌落后挑取单菌落进行稀释划线分离获得纯培养菌株。以尖孢镰刀菌黄瓜专化型为靶标菌，利用平板对峙培养对纯培养菌株法进行抑菌活性检测，筛选出具有明显抑菌活性的菌株短密木霉(Trichodermabrevicompactum)BF06CGMCCNo.11845。
1.2菌株鉴定
1.2.1形态学鉴定
将保存在PDA斜面的短密木霉BF06菌株，在PDA平板上，26℃、自然光条件下活化培养3d，挑取菌落边缘转到新的PDA平板上。培养2d，孢子尚未产生时，挑取菌丝丛制片，观察分生孢子梗的形态。培养3-5d，菌落上可以看到明显的绿色或深绿色孢子时，挑取分生孢子制片，观察分生孢子的形态。
短密木霉BF06菌株的形态学特征：在PDA培养基上26℃、自然光条件下培养120h后，菌落具有宽的不规则形状产孢簇，呈棉絮状，气生菌丝上大量分生孢子形成明显的同心轮纹。分生孢子梗产生于孢子簇，开始时具有长的不育区段，或者沿梗散生分枝，在尖端具有几个瓶梗，一般在分生孢子梗的基部或者孢子簇内的梗上可育分枝之间的间距较短，分枝长度短于宽度。分生孢子梗分枝成对称分布，分枝较短，二次分枝较少见。分生孢子梗的顶端着生2-4个瓶梗呈直角生出，安瓿形，瓶梗中部轻微膨大。分枝基部产生的瓶梗以及孢子簇内产生的瓶梗短，中间明显膨大，在支持细胞上形成头状结构。分生孢子绿色，分生孢子亚球形至卵圆形，光滑，2.02-2.93×2.34-3.18μm。形态学特征符合短密木霉菌特征。
1.2.2分子生物学鉴定
提取短密木霉BF06的基因组DNA，利用引物ITS1(5ˊ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ˊ)和ITS4(5ˊ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ˊ)进行PCR扩增短密木霉BF06的ITSrDNA，利用引物RPB2_210up(5ˊ-TGGGGWGAYCARAARAAGG-3ˊ)和RPB2_1450low(5ˊ-CATRATGACSGAATCTTCCTGGT-3ˊ)进行PCR扩增短密木霉BF06的RNA聚合酶II的RPB2亚基基因，利用引物tef85f(5ˊ-AGGACAAGACTCACATCAACG-3ˊ)和tef954r(5ˊ-AGTACCAGTGATCATGTTCTTG-3ˊ)进行PCR扩增短密木霉BF06的翻译延长因子(TEF-1α)基因。ITSrDNA的PCR温度程序为94℃预变性4min；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。RNA聚合酶II的RPB2亚基基因的PCR温度程序为95℃预变性5min；95℃变性1min，50℃退火90s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。TEF-1α基因的PCR温度程序为95℃预变性5min；95℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s，共30个循环；72℃延伸10min。
反应停止后，取5μL扩增产物使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，并使用凝胶成像系统拍照、分析。PCR产物进行测序。PCR扩增得到的短密木霉BF06的ITSrDNA序列如序列表中序列1所示，该序列与短密木霉Trichodermabrevicompactum的相应序列(KC884785.1)和苇状木霉Trichodermaarundinaceum的相应序列(EU330925.1)的同源性均为100％，因此只根据ITSrDNA基因无法对短密木霉BF06鉴定到种。PCR扩增得到的短密木霉BF06的RNA聚合酶II的RPB2亚基基因序列如序列表中序列2所示，该序列与短密木霉Trichodermabrevicompactum的相应序列(AB558920.1)的同源性为99％，与已经发表的其他短密木霉的相似性都在95％以上。PCR扩增得到的短密木霉BF06的TEF-1α基因序列如序列表中序列3所示，该序列与短密木霉Trichodermabrevicompactum的相应序列(EU338294.1)的同源性为100％，与已经发表的其他短密木霉的相似性都在97％以上。
根据上述形态学鉴定结果和分子生物学鉴定结果，将短密木霉BF06鉴定为短密木霉(Trichodermabrevicompactum)。短密木霉BF06已于2015年12月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11845。
实施例2、短密木霉BF06防治黄瓜枯萎病
1、短密木霉BF06抑制尖孢镰刀菌黄瓜专化型
将短密木霉BF06和尖孢镰刀菌黄瓜专化型(沈文渊，瓜类枯萎病菌四种专化型的生物学特性及瓜类枯萎病生物防治研究，硕士论文，2012)转接在PDA培养基上活化，26℃培养48h后，用直径0.6mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，将短密木霉BF06菌饼接种到培养皿一端(距培养皿边缘3cm)，尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌饼接种到培养皿另一端(距培养皿边缘3cm)，实验设3次重复，同时以只接尖孢镰刀菌黄瓜专化型的处理作对照，培养7天后观察是否具有拮抗作用，并拍照记录。结果如图1所示，表明短密木霉BF06完全覆盖尖孢镰刀菌黄瓜专化型的菌丝，说明该短密木霉菌株是一个具有较好生防潜力的微生物资源。
2、短密木霉BF06防治黄瓜枯萎病的盆栽实验
2.1生防基质的制备
将短密木霉BF06分生孢子悬浮液和栽培土混合作为生防基质。具体步骤为：
(1)菌株活化：将保存在PDA斜面的短密木霉BF06，在PDA平板上活化培养3d后，挑取菌落边缘转到新的PDA平板上，于26℃培养5天。
(2)分生孢子悬浮液的制备：在超净工作台中，将适量无菌水加入培养短密木霉BF06的PDA平板中，使用灭菌的毛刷刷下大量短密木霉BF06孢子，利用血球计数板配成浓度为107-108cfu·mL-1的孢子悬浮液。
(3)栽培土处理：1000g栽培土与短密木霉BF06孢子悬浮液混匀得到生防基质，生防基质中短密木霉BF06的含量为107cfu/g，分装于30个栽培钵中；
2.2盆栽实验
带菌种芽的制备：使用胚根浸种法制备带菌种芽，将芽长0.5cm的中农6号黄瓜的种子浸泡在事先制备好的100mL浓度为1×106cfu·mL-1的尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌悬液中3h，得带菌种芽。
实验设4个处理，分别为空白对照、多菌灵处理、短密木霉BF06处理、病原菌接种处理对照。
病原菌接种处理对照：将带菌种芽播种在装有栽培土(与2.1的生防基质中的栽培土相同)的栽培钵中，每个栽培钵播种1个带菌种芽。
多菌灵处理：将带菌种芽播种在装有多菌灵栽培土的栽培钵中，每个栽培钵播种1个带菌种芽。多菌灵栽培土是将25％多菌灵可湿性粉剂2克与栽培土(与2.1的生防基质中的栽培土相同)2000克混合得到多菌灵栽培土。
短密木霉BF06处理：将带菌种芽播种在装有2.1的生防基质的栽培钵中，每个栽培钵播种1个带菌种芽。
空白对照：将未经病原菌接种处理的黄瓜种芽播种在装有栽培土(与2.1的生防基质中的栽培土相同)的栽培钵中，每个栽培钵播种1个带菌种芽。
每个处理3次重复，每次重复30株苗。
播种后，每天观察记录发病情况，并拍照计算病情指数和防治效果。黄瓜枯萎病病害分级标准：0级(根、茎、叶生长正常，无病症)，1级(胚轴或子叶上出现轻微症状，但生长正常)，2级(胚轴或子叶明显的坏死斑，或一片子叶黄化，生长受到一定影响)，3级(坏死斑引起局部性萎蔫，或一片子叶枯萎生长僵化)，4级(整体萎蔫，倒伏枯死)。采用SPSS17.0进行差异显著分析，P≤0.05
病情指数＝Σ(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×最大级数)×100。
防治效果(％)＝(病原菌接种处理对照病情指数—处理病情指数)/病原菌接种处理对照病情指数×100％。
表1.短密木霉BF06对黄瓜枯萎病的防治效果
注：同列标注不同字母为差异显著(P<0.05)。
调查发现，播种15天后，使用短密木霉BF06分生孢子悬浮液拌土后，无病症的0级苗明显高于接种病原菌的处理，并且3级和4级病苗数大大下降，防治效果为90.4％(图2)，表明短密木霉BF06对尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起的黄瓜枯萎病具有良好的防治作用。

Claims (10)

1.短密木霉，其菌株号为BF06，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCCNo.11845。
2.病原菌抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物。
3.根据权利要求2所述的病原菌抑制剂，其特征在于：所述病原菌抑制剂对尖孢镰刀菌黄瓜专化型具有抑制作用。
4.植物病害抑制剂，它的活性成分是权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物。
5.根据权利要求4所述的植物病害抑制剂，其特征在于：所述植物病害为黄瓜枯萎病。
6.根据权利要求5所述的植物病害抑制剂，其特征在于：所述黄瓜枯萎病由尖孢镰刀菌黄瓜专化型引起。
7.培养权利要求1所述短密木霉的方法，包括将所述短密木霉在用于培养霉菌的培养基中培养的步骤。
8.制备权利要求2或3所述病原菌抑制剂，或权利要求4或5或6所述植物病害抑制剂的方法，包括将权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物作为活性成分，得到所述病原菌抑制剂或所述植物病害抑制剂的步骤。
9.权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物的下述任一种用途：
1)权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物在抑制病原菌中的应用；
2)权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物在制备病原菌抑制剂中的应用；
3)权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物在抑制植物病害中的应用；
4)权利要求1所述的短密木霉和/或权利要求1所述的短密木霉的代谢物在制备植物病害抑制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型，所述植物病害为黄瓜枯萎病。
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