CN112899170A - 一种短密木霉及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种短密木霉，命名为短密木霉Trichodermabrevicompactum DS‑GSC‑3，保藏编号为CCTCC NO:M2020903，还提供了应用，用于防治茶树轮斑病和提高茶叶的品质。本发明的短密木霉用于防治茶轮斑病，减少了在茶树病害防治中使用化学农药造成的农药残留，用于处理茶叶，能够改善茶叶的品质，提高茶叶的内含物的含量，在茶叶制备中起到了良好的改善茶叶品质的作用。

Description

一种短密木霉及其应用
技术领域
本发明属于短密木霉技术领域，具体涉及一种短密木霉及其应用。
背景技术
茶树轮斑病是茶园常见叶部病害之一，全国各产茶省均有发生。被害叶片大量脱落，并引起枯梢，致使树势衰弱，产量下降，而目前防治的方法多采用喷洒化学农药的方法，进入发病期及时喷洒800倍液的500克/ 升甲基硫菌灵悬浮剂，间隔7～14天防治1次，连续防治2或3次，但喷施化学农药的方法极易在茶树叶片中产生农药残留，对茶叶的后期加工和饮用造成不良影响。另外，茶叶采摘后加工后面临品质损失，如何改善并提高茶叶的品质是茶叶加工后面临的重要问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种短密木霉及其应用，该短密木霉用于防治茶轮斑病，减少了在茶树病害防治中使用化学农药造成的农药残留，用于处理茶叶，能够改善茶叶的品质，提高茶叶的内含物的含量，在茶叶制备中起到了良好的改善茶叶品质的作用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种短密木霉，所述短密木霉命名为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3，保藏编号为CCTCC NO:M2020903，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2020年12月14日；所述短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的ITS序列如SEQ IDNO:1 所示，EF-1α(转录延伸因子基因)序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还提供了上述的短密木霉的应用，所述短密木霉用于防治茶树轮斑病。
本发明还提供了上述的短密木霉的应用，所述短密木霉用于提高茶叶的品质。
优选地，所述短密木霉用于提高茶叶的内含物的含量，所述内含物包括游离氨基酸、茶多酚以及儿茶素。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3能够用于防治茶轮斑病，减少了在茶树病害防治中使用化学农药造成的农药残留，并且本发明的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3用于处理茶叶，能够改善茶叶的品质，提高茶叶的内含物的含量，在茶叶制备中起到了良好的改善茶叶品质的作用。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3与茶轮斑病菌的对峙培养结果图。
图2为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3与茶轮斑病菌的抑制作用图。
图3为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的菌落特征图。
图4为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的分生孢子梗和分生孢子的形态特征图。
图5为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的与相关种构建的最大似然树图。
具体实施方式
实施例1
本实施例为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的分离、鉴定和保藏：
(一)短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的分离：
1、茶树根际木霉菌分离与筛选：
采用梯度稀释法对采自贵州(都匀市、兴义市、安龙县、独山县、湄潭县)的健康茶树根际土样进行木霉菌株的分离。
称取5g风干土样倒入装有45mL无菌水的锥形瓶中，于摇床28℃、 150r/min振荡培养30min，使之充分混匀后即可得到浓度为10-1的样品悬液。在超净工作台中将其逐一稀释成10-2、10-3和10-4的浓度，静置后用移液枪分别取后两个样品悬液100μL滴于虎红酸钠培养基平板上，无菌涂布棒涂匀后封口，于28℃培养箱中倒置培养，待有菌落形成后将木霉转至新鲜PDA培养基上纯化，得到纯化的菌株后采用硫酸纸袋低温保存(–20℃)；所述PDA培养基由以下用量的原料组成：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉18g和蒸馏水1000mL；所述虎红酸钠培养基由以下用量的原料组成：土豆200g、葡萄糖20g、琼脂粉18g、虎红钠盐0.02g、氯霉素0.3g和蒸馏水1000mL；
通过梯度稀释法从茶树根际土壤中共分离出木霉菌39株。
2、平板对峙初筛：
采用两点对峙法筛选拮抗木霉菌株。在距离PDA平板中心2.5cm处的直径上分别接种培养7d的木霉菌和茶轮斑病菌菌饼(直径为6mm), 每组3个重复，以单接茶轮斑病菌为对照，于25℃下培养7d。7d后测量并计算茶轮斑病菌的生长速度，同时统计木霉菌对茶轮斑病菌的覆盖率。
通过平皿对峙培养筛选出7株对茶轮斑病病菌具有明显拮抗作用的菌株，7株对茶轮斑病病菌具有明显拮抗作用的菌株接种后，茶轮斑病菌的生长速度为0.67m/d～0.75cm/d，木霉菌对茶轮斑病菌的覆盖率为Ⅰ级～Ⅲ级，具体分级标准为：
Ⅰ级：木霉菌菌落与病原菌菌落不接触，菌丝不能覆盖病原菌菌落；
Ⅱ级：木霉菌菌丝覆盖病原菌菌落的1/2以下，病原菌菌落健康，颜色无变化；
Ⅲ级：木霉菌菌丝覆盖病原菌菌落的1/2以上，并在病原菌菌落上大量产孢，病原菌菌落萎缩，颜色变暗。
3、抑菌圈复筛：
无菌条件下取8个直径为6mm的木霉菌菌饼接于120mL的PDB培养基中，于摇床28℃、180r/min条件下振荡培养7d，静置2d，经灭菌过滤纸初步过滤后，7830r/min下常温离心10min，取上清液通过0.22μm滤膜。按10％的比例将木霉菌发酵液加入到PDA培养基中，混匀倒平板，取茶轮斑病菌饼接种于平板中央。25℃培养7天，十字交叉法测量茶轮斑病菌菌落半径，计算其抑菌效果；所述PDB液体培养基由以下用量的原料制成：土豆200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL。
通过抑菌圈复筛筛选出对茶树轮斑病具有拮抗作用的木霉菌株短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3，测量茶轮斑病菌菌落半径，计算其抑菌效果为70.53％。
图1为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3与茶轮斑病菌的对峙培养结果图，图中A为平板正面对照(只有茶轮斑病菌菌落)，B 为平板背面对照，C为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3对茶轮斑病菌的生长抑制的平板正面，D为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3对茶轮斑病菌的生长抑制的平板背面，如图所示短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3对茶轮斑病菌具有明显的生长抑制作用。
图2为短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液对茶轮斑病菌的抑制作用图，图中A为不含短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液的培养基培养7d茶轮斑病菌的菌落正面形态，B为不含短密木霉Trichoderma brevicompactumDS-GSC-3发酵液的培养基培养7d 茶轮斑病菌的菌落背面形态，C为含短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液的培养基培养7d茶轮斑病菌的菌落正面形态，D为含短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液的培养基培养7d茶轮斑病菌的菌落背面形态，如图所示，添加短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液后，茶轮斑病菌的生长受到显著的抑制作用。
(二)短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的种类鉴定：
1、形态学观察：
挑取培养7d的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3菌落制成水玻片，于显微镜下观察木霉菌的分生孢子梗、分生孢子等形态特征。
在PDA培养基上培养3天时，菌落长至整个培养皿的2/3左右，菌落呈白色，气生菌丝较少，无分生孢子产生(图3中B)；培养至7天，产生大量黄绿色分生孢子，聚集于菌落外圈，形成同心轮纹，无色素和特殊气味产生(图3中A)。在PDA培养基上可产生半球状分生孢子簇，散生，黄绿色或灰绿色，均一地成棉絮状。菌丝无色透明，具隔膜，直径约为3.35～4.84μm；分生孢子梗松散对生于节上，在梗的顶部，瓶梗2-4 个呈直角生出，安瓿形(图4中A)；分生孢子黄绿色，亚球形至卵圆形，光滑，直径约为2.03～3.31μm，没有厚基孢子(图4中B)。
2、分子鉴定：
收集短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的菌丝及分生孢子，采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。采用真菌引物ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R分别扩增该菌株的ITS序列和EF-1α序列。扩增产物送于上海生工公司进行测序。测序结果经GenBank 中的BLAST比对分析后下载相似性较高序列，采用BioEdit进行比对和校正，利用MAGA6.0软件将ITS和EF-1α基因序列连接起来，比对拼接后的序列采用RA×ML软件构建系统进化树，确定该菌与同属菌株间的亲缘关系。
所述短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的ITS序列如 SEQ ID NO:1所示；
真菌引物ITS1序列如SEQ ID NO:3所示；
真菌引物ITS4序列如SEQ ID NO:4所示；
真菌引物EF1-728F序列如SEQ ID NO:5所示；
真菌引物EF1-986R序列如SEQ ID NO:6所示。
短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的基因组DNA经 PCR扩增ITS和EF-1α基因片段，短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的ITS序列如SEQ IDNO:1所示，EF-1α序列如SEQ ID NO:2 所示，依托测序公司测序获得的碱基序列与GenBank相似真菌的ITS及 EF-1α(转录延伸因子基因)序列用于分子系统发育学分析，以菌株Hypomyces stephanomatis为外群，构建短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的两个基因的分子系统发育树；结果发现，短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3和Trichoderma brevicompactum聚为一分支，且具有强烈的支持强度(92％)(图5)，结合短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3形态学特征，将该菌株鉴定为短密木霉Trichoderma brevicompactum。
(三)短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的保藏：
短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2020903，保藏日期为2020年12月14日。
实施例2
本实施例为实施例1的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的应用，用于防治茶树轮斑病(Neopestalotiopsis ellipsospora)。
试验茶园为贵州省茶叶研究所的茶叶基地(东经106°39′24″，北纬26°30′10″，海拔1134m)，供试品种为福鼎大白茶，在茶树轮斑病 (Neopestalotiopsis ellipsospora)发病初期进行第一次施药，在第一次施药后10天进行第二次施药，共施药2次。
试验设3个处理组:
处理A组为每次施药每株茶树植株根际接种50mL的浓度为1×106个孢子/mL的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液；
处理B组为在茶树植株上喷施清水作为空白对照；所述清水的每次的喷施量等于处理A组中的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液的每次的总接种量；
每个处理组分别设置3个重复的小区，每小区约50株茶树，每小区的面积约为30m2。
在自然发病情况下，于茶树轮斑病发病高峰期对叶片发病情况进行分级，根据发病分级指数计算病情指数及防治效果，每个小区随机调查10 株(每株随机选取10片叶片进行调查)，参照《农药田间药效试验准则》制定分级标准，对发病情况进行分级，分级标准如下：
0级，叶片无病斑；
1级，叶片病斑占整个叶片面积的5％以下；
3级，叶片病斑占整个叶片面积的6％～10％；
5级，叶片病斑占整个叶片面积的11％～25％；
7级，叶片病斑占整个叶片面积的26％～50％；
9级，叶片病斑占整个叶片面积的50％以上。
叶片发病率(％)＝100％×发病叶片数/总调查叶片数；
病情指数＝100×Σ(各级病叶数×病害级别数)/(调查总叶数×9)；
防治效果(％)＝100×(对照区病情指数-处理区病情指数)/对照区病情指数。
结果如表1，使用短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液灌根于茶树，可有效防治茶树轮斑病，防治效果能达到71.57％。
表1各处理对茶树轮斑病的防治效果
Figure RE-GDA0003051363550000071
Figure RE-GDA0003051363550000081
注：表中字母表示p<0.05水平下的差异显著性，-表示未调查。
实施例3
本实施例为实施例1的短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的应用，用于提高茶叶的品质，用于提高茶叶内含物的含量；所述内含物包括游离氨基酸、茶多酚和儿茶素。
试验于贵州省茶叶研究所茶园实施，每处理设3个重复，小区面积约 30m2，随机区组排列，将短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3 发酵液经4层纱布过滤后，静电喷雾器喷雾，设喷清水为对照，施药后30d 后，取试验区内的茶树芽下二三叶，先用微波炉进行杀青处理，中火，90sec；再置于80℃烘箱中进行烘干处理，干样内含物依托贵州省茶叶研究所进行检测，结果如表1所示，短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3 发酵液处理后的三个重复试验的茶叶平均值相对于三个重复对照的平均值做比较，游离氨基酸增加了0.14％，茶多酚增加了9.09％，儿茶素增加了1.97％。
表1短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液对茶树叶片内含物的影响
Figure RE-GDA0003051363550000082
说明喷施短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3发酵液后能提高茶叶的品质，短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3在提高茶叶品质方面有广阔的应用前景。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。
序列表
<110> 贵州省生物技术研究所（贵州省生物技术重点实验室、贵州省马铃薯研究所、贵州省食品加工研究所）
<120> 一种短密木霉及其应用
<130> 2020.12.15
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 586
<212> DNA
<213> 短密木霉ITS(Trichoderma brevicompactum ITS)
<400> 1
tggcatcgaa ctaactccaa accccaatgt gaacgttacc aaactgttgc ctcggcggga 60
tttctgcccc gggcgcgtcg cagccccgga ccaaggcgcc cgccggagga ccaatttaca 120
aactcttttg tatatcccat cgcggattct ttacattctg agctttctcg gcgctcctag 180
cgagcgtttc gaaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc tggcatcgat 240
gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat 300
ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg agcgtcattt 360
caaccctcga acccctccgg ggggtcggcg ttggggatcg gcacttacct gccggccccg 420
aaatacagtg gcggtctcgc cgcagcctct cctgcgcagt agtttgcaca ctcgcaccgg 480
gagcgcggcg cgtccacggc cgtaaaacaa cccaaacttc tgaaatgttg acctcggatc 540
aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tcaaaagccg gaggaa 586
<210> 2
<211> 655
<212> DNA
<213> 短密木霉EF-1α(Trichoderma brevicompactum EF-1α)
<400> 2
gtggcgggat tttctctcta ttttgacctt cactccatgc aattgtgccc gacaattctc 60
agttatctga ggatttcgtg tcaatttttt tttcatggtc accccgcttt cgcggcctac 120
ccctcctttg gcacagacct gcaaattttt ttttgctgcc ttactaggtt ttagtggggg 180
tacttcttgg agcaaacccc cactactacc ggtgacgctc tgttacctgt tgatactcgt 240
catcacccaa tgcatctcat cacatctcaa tcgtcgctac tatccttttc atctcttcag 300
ttgtactgac catttccccc tcaacaggaa gccgccgaac tcggcaaggg ttccttcaag 360
tatgcgtggg ttcttgacaa gctcaaggcc gagcgtgagc gtggtatcac catcgacatt 420
gccctctgga agttcgagac tcccaagtac tatgtcaccg tcattggtat gtttgatatt 480
cgccattttt ctagtacatt cgcttcgaat actaatgcca atctcacgca gacgctcccg 540
gccaccgtga tttcatcaag aacatgatca ctggtacttc ccaggctgac tgcgctatcc 600
tcattatcgc tgccggtact ggtgagttcg aggctggtat ctcaaaggga tggca 655
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 真菌引物ITS1(Fungal Primer ITS1)
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 真菌引物ITS4(Fungal Primer ITS4)
<400> 4
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 真菌引物EF1-728F(Fungal Primer EF1-728F)
<400> 5
catcgagaag ttcgagaagg 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 真菌引物EF1-986R(Fungal Primer EF1-986R)
<400> 6
gccatccttg gagataccag c 21

Claims (4)

1.一种短密木霉，其特征在于，所述短密木霉命名为短密木霉Trichodermabrevicompactum DS-GSC-3，保藏编号为CCTCC NO:M2020903，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年12月14日；所述短密木霉Trichoderma brevicompactum DS-GSC-3的ITS序列如SEQ ID NO:1所示，EF-1α序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种如权利要求1所述的短密木霉的应用，其特征在于，所述短密木霉用于防治茶树轮斑病。
3.一种如权利要求1所述的短密木霉的应用，其特征在于，所述短密木霉用于提高茶叶的品质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述短密木霉用于提高茶叶的内含物的含量，所述内含物包括游离氨基酸、茶多酚以及儿茶素。
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