CN111218414A - 一种解淀粉芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种解淀粉芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法，所述解淀粉芽孢杆菌为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的拮抗菌株，该解淀粉芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018795。通过本发明提供的所述解淀粉芽孢杆菌，能有效拮抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒，进而达到同时防治烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的作用。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种解淀粉芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法。
背景技术
我国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断地从国外引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒(Potato virusY，PVY),是目前为止在烟草生产上分布最广且发生普遍的两大类病害。我国已发现的烟草病毒病有16种，其中TMV、CMV、PVY等3种病毒是引致烟草花叶病的主要病毒。它们能在植物细胞中寄生、复制，所需的物质、能量和场所也来源于寄主。烟草感染病毒后，叶绿素被破坏，光合作用减弱，叶片生长受抑制，防治较为困难，减产幅度为20％-80％，全球每年因这两种病害造成的损失可达1亿多美元。传统的化学防治方法对抗烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒的效果不佳，并且连年使用化学药剂，不仅使黑胫病病菌的抗药性有所增强，而且对环境造成巨大污染。
因此，有必要提供一种生物防治烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒病菌的方法。
申请内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种解淀粉芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法，以解决现有烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒采用化学药剂防治，致使污染环境的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种解淀粉芽孢杆菌，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的拮抗菌株，所述解淀粉芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018795。
本发明还提供了一种如前述的解淀粉芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒的应用。
本发明还提供了一种如前述的解淀粉芽孢杆菌在防治马铃薯Y病毒的应用。
本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，所述制备方法包括：
步骤一，挑取如前述的解淀粉芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃，pH 6.5-7.5环境下下，150～220r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为4～5％，在温度为29～31℃，pH6.5-7.5环境下，150～220r/min恒温培养48h～72h，制备得到所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
优选地，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
与现有技术相比，本发明提供的所述解淀粉芽孢杆菌能同时抑制烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒，从而为防治烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒提供了新的选择；由于本发明提供解淀粉芽孢杆菌发酵液为生物制剂，对环境无化学污染。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图；
图2为本发明提供的拮抗菌株的芽孢形态图；
图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌与烟草普通花叶病毒在心叶烟上的接种实验图；
图5为本发明提供的解淀粉芽孢杆菌与烟草普通花叶病毒在苋色藜上的接种实验图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
为描述方便，以下将本发明提供的拮抗菌株命名为D3-1。本领域技术人员可以理解的是，以下实施例中的所述D3-1与所述拮抗菌株为同一菌株。
本发明提供一种拮抗烟草普通花叶病毒和马铃薯Y病毒的微生物菌株的筛选方法，具体包括以下步骤：
稀释梯度分离法：称取土样5g于50ml离心管中，加入15ml无菌水，用震荡器充分震荡，2000rpm离心2min，取菌悬液10μl，加入无菌水，依次稀释成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基和PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，倒置放置于30℃下培养，待其长出分离物，对平板上长出的单菌落进行划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于-80℃保存；
通过心叶烟半叶枯斑法和苋色藜半叶枯斑法筛选抑制菌株。筛选出一株抑制能力较强的菌株，命名为D3-1。
本发明采用以下方法对D3-1进行鉴定。
请参阅图1，图1为本发明提供的拮抗菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图。具体为将D3-1接种于LB固体培养基上，进行划线培养，倒置于30℃条件下，培养14～16小时。由图1可看出，D3-1的菌落中等大小，呈白色，不透明，边缘不整齐，扁平，表面干燥形成褶皱,菌落中心形成褶皱突尖。请参阅图2，图2为本发明提供的拮抗菌株的芽孢形态图，由图2可知，D3-1菌体呈杆状，产芽孢。对D3-1进行生理生化鉴定，具体D3-1的生理生化特性如表1所示。
表1菌株D3-1的生理生化鉴定结果表
| 项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | 阳性 |
| 甲基红实验 | 阴性 |
| 淀粉酶 | 阳性 |
| 过氧化氢酶 | 阳性 |
| H2S | 阳性 |
| V-P反应 | 阳性 |
| 柠檬酸盐利用 | 阴性 |
对D3-1进行分子实验鉴定。
挑取一个单菌落，放入预先装有10μL无菌水的PCR管中，枪头吸打混匀，作为PCR扩增所用的菌液模板。参照以下扩增体系进行PCR扩增。
其中2×EasyTaqPCR SuperMix(+dye)购至北京全式金生物技术有限公司，其中预含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液、电泳缓冲液等PCR扩增所需的常用试剂，本领域技术人员可根据需要直接选择其他PCR扩增试剂盒，或是根据需要自行采用独立的DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液进行PCR扩增。本实施例中，上下游引物采用27F和1492R，上下游引物的具体序列为：
27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
扩增条件为：
98℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，重复30个循环；72℃10min。
请参阅图3，图3为本发明提供的拮抗菌株PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。经过PCR扩增得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，在1500bp附近有明显的条带。对扩增产物进行双向测序，测序得到的基因序列，即16s rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的核苷酸序列进行比对，结果显示，D3-1与菌株Bacillus amyloliquefaciensNOA3相似性高达100％。
结合D3-1的形态结构特征及生理生化特性，确定D3-1具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。所述解淀粉芽孢杆菌为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的拮抗菌株，所述解淀粉芽孢杆菌已于2018年11月16日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018795。
对D3-1抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的拮抗能力进行测定。
挑取本发明D3-1菌株以4％接种重量接种到25ml LB培养基中，32℃，180r/min培养48h，制得发酵液，将发酵液于10500r/min离心15min除去菌体，0.45um细菌过滤器过滤得无菌发酵液。
取TMV感病干叶片0.1g研磨成匀浆，按1:200(W/V)加入PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline)配制成20倍TMV病毒接种液。选取健康、长势一致4-6叶期心叶烟进行的摩擦接种，左半叶接种无菌发酵液与TMV病毒接种液等体积混合液为处理组，右半叶接种LB液体培养基与TMV病毒接种液等体积混合液为对照组，其中混合液的混合时间均为10min，接种5min后用水喷洒叶面。每株接种3-5个叶片，重复3次，每天喷水2-3次。TMV接种3d后统计枯斑个数计算抑制率，结果见下表2，并结合参见图4。
取PVY感病干叶片0.1g研磨成匀浆，按1:200(W/V)加入PBS缓冲液配制成20倍PVY病毒接种液。选取健康、长势一致6-8叶期苋色藜进行PVY的摩擦接种,左半叶接种无菌发酵液与PVY病毒接种液等体积混合为处理组，右半叶接种LB培养基与PVY病毒接种液等体积混合液为对照组，其中混合液的混合时间均为10min，接种5min后用水喷洒叶面。每株接种3-5个叶片，重复3次，每天喷水2-3次。接种12天后统计枯斑数，计算抑制率，结果见下表2，并结合参见图5。
抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100％。
表2本发明D3-1菌株发酵液对TMV和PVY的抑制作用
由上表2可知，D3-1菌株发酵液分别与TMV和PVY作用都表现出明显的钝化作用，体外钝化10min后，对TMV的抑制率为95.02％，PVY的抑制率为99.31％。
本发明还提供了一种如前述的解淀粉芽孢杆菌在防治烟草普通花叶病毒的应用。
具体地，可制成含有该拮抗菌株的生物药剂、生物土壤或生物肥料等。
本发明还提供了一种如前述的解淀粉芽孢杆菌在防治马铃薯Y病毒的应用。
具体地，可制成含有该拮抗菌株的生物药剂、生物土壤或生物肥料等。
本发明还提供了一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法：
步骤S1，挑取如前述的解淀粉芽孢杆菌的单菌落于装有15～30ml的LB液体培养基的三角瓶中，在温度为29～31℃下，pH 6.5-7.5环境下，150～220r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
具体地，挑取如前述的解淀粉芽孢杆菌的单菌落于装有15ml的LB液体培养基的三角瓶中，在温度为32℃下，180r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤S2，将所述步骤S1中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基的中的浓度为5％，在温度为32℃下，180r/min恒温培养48h～72h，制备得到所述解淀粉芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。优选地，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为1g/L。
序列表
<110> 湖南省烟草公司湘西自治州公司
中国烟草中南农业试验站
湖南农业大学
<120> 一种解淀粉芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
ttcggcggct ggctcctaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga 180
tttgtgggat tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcactc tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga 480
cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc 540
ccccgtcaat tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat 600
gcgttagctg cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg 660
cgtggactac cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag 720
ttacagacca gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc 780
gctacacgtg gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc 840
tccccggttg agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac 900
gcccaataat tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt 960
tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt 1020
cttccctaac aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc 1080
gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc 1140
gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg 1200
tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga 1260
agccaccttt tatgtctgaa ccatgcggtt cagacaacca tccggtatta gccccggttt 1320
cccggagtta tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct 1380
aacatcaggg agcaagctcc catctgtccg ctcgacttgc agtat 1425
Claims (5)
1.一种解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的拮抗菌株，所述解淀粉芽孢杆菌已在位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018795。
2.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒的应用。
3.一种如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治马铃薯Y病毒的应用。
4.一种解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤一，挑取如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃，pH 6.5-7.5环境下，振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基的发酵罐中，所述种子液在LB液体培养基中的浓度为4～5％，在温度为29～31℃，pH 6.5-7.5环境下，恒温培养，制备得到所述解淀粉芽孢杆菌发酵液。
5.如权利要求4所述解淀粉芽孢杆菌发酵液的制备方法，其特征在于，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为9～11g/L，所述酵母提取物的浓度为4～6g/L，所述氯化钠的浓度为0.8～1.2g/L。
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