CN109762754A - 贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法，所述贝莱斯芽孢杆菌为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。通过本发明提供的所述贝莱斯芽孢杆菌，能有效抑制TMV和PVY，进而达到防治TMV和PVY的作用。

Description

贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，尤其涉及一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法。
背景技术
我国烟区辽阔，自然条件迥异，烟草本身可塑性强，容易受环境影响而变异，经过人们长期的栽培和选择，形成了各具特色的众多品种，加之不断地从国外引进新品种，形成了类型俱全、数量丰富的烟草资源。虫害和病害是影响烟草农艺性状和经济性状的威胁因子，如烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)和马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)，TMV和PVY是目前为止在烟草生产上分布最广且发生普遍的两大类病害。烟草感染TMV和PVY后，叶绿素被破坏，光合作用减弱，叶片生长受抑制，防治较为困难，减产幅度为20％-80％，全球每年因这两种病害造成的损失可达1亿多美元。传统的化学防治方法对抗TMV和PVY的效果不佳，并且连年使用化学药剂，对环境造成巨大污染。
因此，有必要提供一种生物防治TMV和PVY病菌的方法。
申请内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及抑制制剂的制备方法，以解决现有TMV和PVY采用化学药剂防治，致使污染环境的技术问题。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：提供一种贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌的16s rDNA如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种如前述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒上的应用。
优选地，制成含有所述贝莱斯芽孢杆菌的生物制剂、生物土壤或生物肥料，以防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒。
本发明还提供了一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制烟草花叶病毒，该制备方法包括：：
步骤一，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
本发明还提供了一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制马铃薯Y病毒，该制备方法包括：：
步骤一，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供的所述贝莱斯芽孢杆菌能有效抑制TMV和PVY的生长，并在一定时间段内，持续具有显著的抑制作用，可用于TMV和PVY引起的烟草花叶病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的抑制菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图；
图2为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在心叶烟上抑制TMV的抑制实验图；
图3为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在苋色藜上抑制PVY的抑制实验图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
为描述方便，以下将本发明提供的抑制菌株命名为BV1。本领域技术人员可以理解的是，以下实施例中的所述BV1与所述抑制菌株为同一菌株。
本发明采用以下方法进行抑制菌株的筛选方法，包括以下步骤：
分离纯化：称取多年施用于烟草田间的饼肥5g于50ml离心管中，加入15ml无菌水中，用震荡器充分震荡，2000rpm离心2min，取菌悬液10μl，加入无菌水，依次稀释成浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别涂布于LB(Luria-Bertani)固体培养基和PDA固体培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，倒置放置于30℃下培养，待其长出微生物，对平板上长出的单菌落进行划线分离纯化，得到待选菌株，加甘油，于-80℃保存；
抑制筛选：取TMV或PVY感病干叶片0.1g研磨成匀浆，本领域技术人员可以理解的是，也可以采用病毒冻干粉或者其他可活化的材料作为TMV和PVY的病毒源。按1:200(W/V)加入PBS缓冲液配制成20倍病毒接种液。选取健康、长势一致4～6叶期心叶烟进行TMV的摩擦接种，选取健康、长势一致6～8叶期苋色藜进行PVY的摩擦接种，左半叶接种LB培养基与病毒等体积混合液为对照组，右半叶接种无菌发酵液与病毒液等体积混合为处理组，混合时间均为10min，接种5min后用水喷洒叶面。每株接种3-5个叶片，重复3次，每天喷水2-3次。TMV接种3d后统计枯斑个数，PVY接种7天后统计枯斑数，计算抑制率。本领域技术人员可以理解的是，上述方法中采用的参数，可根据实际情况进行适当调整。
抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100％。
通过上述方法筛选出同时具有抑制TMV和PVY能力的菌株，命名为BV1
本发明采用以下方法对BV1进行鉴定。
请参阅图1，图1为本发明提供的抑制菌株在LB固体培养基培养后的菌落形态图。具体为将BV1接种于LB固体培养基上，进行划线培养，倒置于30℃条件下，培养14～16小时。由图1可看出，BV1的菌落大小中等，呈白色，不透明，边缘不整齐，扁平，表面干燥形成褶皱。请参阅图2，图2为本发明提供的抑制菌株的芽孢形态图，在400倍放大下，观察到反光的芽孢。对BV1进行生理生化鉴定，具体BV1的生理生化特性如表1所示。
表1菌株BV1的生理生化鉴定结果表
项目 结果
革兰氏染色 阳性
蔗糖 阴性
甲基红实验 阴性
可溶性淀粉 阳性
H<sub>2</sub>S 阳性
淀粉水解实验 阳性
麦芽糖 阳性
对BV1进行分子实验鉴定。
挑取一个单菌落，放入预先装有10μL无菌水的PCR管中，枪头吸打混匀，作为PCR扩增所用的菌液模板。参照以下扩增体系进行PCR扩增。
其中2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)购至北京全式金生物技术有限公司，其中预含有DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液、电泳缓冲液等PCR扩增所需的常用试剂，本领域技术人员可根据需要直接选择其他PCR扩增试剂盒，或是根据需要自行采用独立的DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液进行PCR扩增。本实施例中，上下游引物采用27F和1492R，上下游引物的具体序列为：
27F：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；
1492R：5′-CAAACTTGGTCATTAGAGGA-3′。
扩增条件为：
98℃预变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸90s，重复30个循环；72℃10min。
经过PCR扩增得到的扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，在1500bp附近有明显的条带。对扩增产物进行双向测序，测序得到的基因序列。将测序得到的基因序列与NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的核苷酸序列进行比对，结果显示，BV1与菌株Bacillus velezensis LBUM288相似性高达100％。
结合BV1的形态结构特征及生理生化特性，确定BV1具体为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis BV1)。所述贝莱斯芽孢杆菌为抗TMV和PVY病菌的抑制菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已于2018年01月02日在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
关于BV1的获得方法，具体可以参考一种贝莱斯芽孢杆菌、应用及其发酵液的制备方法(专利号：201810464247.7)的发明专利文件，
对BV1抗烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的抑制作用进行测定。
挑取本发明菌株BV1以4％接种重量接种到25ml LB培养基中，32℃，180r/min培养64h，所得发酵液于10500r/min离心15min除去菌体，采用0.45um的细菌过滤器滤得无菌发酵液。
取TMV或PVY感病干叶片0.1g研磨成匀浆，按1:200(W/V)加入PBS缓冲液配制成20倍病毒接种液。选取健康、长势一致4-6叶期心叶烟进行TMV的摩擦接种，左半叶接种LB培养基与TMV病毒接种液的等体积混合液为对照组，右半叶接种无菌发酵液与TMV病毒接种液的等体积混合为处理组，混合时间为10min，接种5min后用水喷洒叶面。
选取健康、长势一致6-8叶期苋色藜进行PVY的摩擦接种，左半叶接种LB培养基与PVY病毒接种叶的等体积混合液为对照组，右半叶接种无菌发酵液与PVY病毒接种叶的等体积混合为处理组，混合时间均为10min，接种5min后用水喷洒叶面。
每株心叶烟或苋色藜接种3-5个叶片，重复3次，每天喷水2-3次。心叶烟接种3d后统计枯斑个数，苋色藜接种7天后统计枯斑数，计算抑制率，结果见下表2，并结合参见图2和图3，其中，图2为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在心叶烟上抑制TMV的抑制实验图；图3为本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌在苋色藜上抑制PVY的抑制实验图。
抑制率＝(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数×100％。
表2本发明菌株BV1发酵液对TMV和PVY的抑制作用
由上表2、图2和图3可知，混合有BV1无菌发酵液的混合液，枯斑数有效减少，从而可论证BV1无菌发酵液对TMV和PVY有明显的钝化作用活抑制侵染作用，体外钝化10min的TMV的抑制率为95.83％，PVY的抑制率为99.20％。
本发明还提供了一种如前述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒上的应用。
具体地，可制成含有该抑制菌株的生物制剂、生物土壤或生物肥料等。例如：将BV1发酵液直接包装制成生物制剂，或结合其他植物所需养分制成生物肥料。
本发明还提供了一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制烟草花叶病毒，该制备方法包括：：
步骤S10，挑取如前述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤S20，将所述步骤S10中的种子液接种于LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为1g/L。
本发明还提供了一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制马铃薯Y病毒，该制备方法包括：：
步骤S11，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤S21，将所述步骤S1中的种子液接种于装有LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
其中，所述LB液体培养基包括胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠，所述胰蛋白胨的浓度为10g/L，所述酵母提取物的浓度为5g/L，所述氯化钠的浓度为1g/L。
设置对照实验A1和A2，具体为采用抑制烟草花叶病毒制剂的制备方法制备对照制剂，不同之处在于，对照实验A1为在步骤S20中，采用在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养45h；对照实验A2为在步骤S20中，采用在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养80h。采用上述抑制作用验证方法，计算抑制率，结果见下表2。
设置对照实验B1和B2，具体为采用抑制马铃薯Y病毒制剂的制备方法制备对照制剂，不同之处在于，对照实验B1为在步骤S21中，采用在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养45h；对照实验B2为在步骤S21中，采用在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养80h。采用上述抑制作用验证方法，计算抑制率，结果见下表3。
表3本发明不同制备方法制备的制剂对TMV和PVY的抑制作用
从表3可观察到，对照实验A1和对照实验A2发酵时间不同，从而导致发酵液的浓度不同，即制备的制剂中有效物质的浓度不同，影响了对TMV的抑制作用；对照实验B1和对照实验B2发酵时间不同，从而导致发酵液的浓度不同，即制备的制剂中有效物质的浓度不同，影响了对PVY的抑制作用。

Claims (5)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌为抑制烟草花叶病毒和马铃薯Y病毒的菌株，所述贝莱斯芽孢杆菌已在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NO：M2018004。
2.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒上的应用。
3.如权利要求3所述贝莱斯芽孢杆菌在防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒上的应用，其特征在于，制成含有所述贝莱斯芽孢杆菌的生物制剂、生物土壤或生物肥料，以防治烟草花叶病毒和/或马铃薯Y病毒。
4.一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制烟草花叶病毒，该制备方法包括：：
步骤一，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
5.一种抑制制剂的制备方法，其特征在于，所述抑制制剂用于抑制马铃薯Y病毒，该制备方法包括：：
步骤一，挑取如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的单菌落于15～30ml LB液体培养基，在温度为29～31℃下，160～200r/min振荡培养，直至OD600在0.6～0.8，制备得到种子液；
步骤二，将所述步骤一中的种子液接种于装有LB液体培养基中进行发酵，所述种子液在所述LB液体培养基的浓度为4～5％，在温度为29～31℃下，160～200r/min恒温培养50h～75h，制备得到所述抑制制剂。
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