CN110760459B - 一种萎缩芽孢杆菌e20303及其应用 - Google Patents

一种萎缩芽孢杆菌e20303及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种萎缩芽孢杆菌E20303及其应用，所述的萎缩芽孢杆菌E20303已于2019年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60695。该菌株可有效抑制马铃薯干腐病和马铃薯Y病毒病，是一种中度嗜盐菌，其从青海察尔汗盐湖湖水中分离纯化得到，为防治马铃薯干腐病和马铃薯Y病毒病提供了新的途径，可有效改善病原物因选择性抗性而不能达到防治作用，应用前景良好。

Description

一种萎缩芽孢杆菌E20303及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种萎缩芽孢杆菌E20303及其应用。
背景技术
马铃薯是一年生栽培的草本茎块作物，有众多别称，原产地美洲。在我国是除玉米、小麦和水稻之外的又一主粮，可以同时作为粮食和蔬菜食用。2003年，联合国粮农组织统计显示，全球范围内马铃薯总栽培面积约为1900万公顷，仅中国马铃薯的种植面积就高达500万公顷。尽管我国马铃薯种植面积在不断扩大，但在其栽种的目前状况和未来出路上仍然存在着不多不利因素。随着我国种植马铃薯面积的日趋增加，并在同一田地上连续栽种，使马铃薯因重茬导致病害类型增多、侵害程度加剧，马铃薯干腐病是马铃薯窖藏期间主要的真菌性病害之一，是由茄病镰孢侵染块茎造成的病害，病原种类有9个种和变种。据调查，在我国马铃薯各个产区中，有的产地马铃薯块茎腐烂率高达63％。
目前对马铃薯干腐病的防治通常采用物理预防和利用化学试剂，物理预防效果较差，使用化学试剂造成了农药残留和环境污染同时使菌株产生了抗药性等一系列问题。因此，对马铃薯干腐病的生物防治尤其是利用微生物源生防制剂的相关研究备受国内外的关注。目前为止，国内外已报道的关于马铃薯干腐病的生防制剂主要来源于放线菌Actinomyces bovis、芽孢杆菌Bacillus sp.、木霉菌Trichoderma sp.等生防菌株以及马铃薯非亲和菌株粉红单端孢Trichothe ciumroseum sp.菌丝细胞壁萃取物和寡雄蛋白等微生物来源的次级代谢产物。这些具有广泛生防前景的微生物主要分离自根际或根际土壤、植株发病部位、植株内部以及虫体内腔等陆地资源中，这就使得从陆地资源中分离得到类似功能菌株及活性化合物的可能性增大，但会造成病原物选择性抗性而不能达到有效防治作用的后果。因此，从海洋、白酒酒糟和盐湖等特殊生境中分离新菌株及结构新；颖的天然产物的研究逐渐引起国内外学者的关注。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时用于抑制马铃薯干腐病病原真菌和马铃薯Y病毒的中度嗜盐菌E20303，同时提供了该菌株的培养基和培养条件，进一步提高了菌株E20303对马铃薯干腐病的抑制活性。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明从青海察尔汗盐湖湖水中分离纯化得到一株中度嗜盐菌E20303，提取所述的菌株E20303的16S rDNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，E20303与GenBank中的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的相似度最高，从而确定了E20303在分类上属于萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
基于以上特征，本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)E20303，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，保藏日期：2019年6月17日，保藏编号为GDMCC No:60695。
在本发明的另一方面，提供了所述的萎缩芽孢杆菌E20303的发酵培养基配方：淀粉10.72g/L、酵母粉23.60g/L、MgSO4·7H2O 16g/L、CaCl2·2H2O 1.14g/L、KCl 8g/L和K2HPO416 g/L。
该发酵培养基可提高萎缩芽孢杆菌E20303对马铃薯干腐病病原菌的抑制率。
进一步的，该发酵培养基的培养条件为：装液量102.9mL，pH 8.6，温度28.7℃。
在本发明的另一方面，提供了所述的萎缩芽孢杆菌E20303在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用。
优选的，所述的萎缩芽孢杆菌E20303的发酵产物在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用也在本发明的保护范围内。
所述的马铃薯Y病毒引起的病害为马铃薯Y病毒病。
在本发明的另一方面，提供了所述的萎缩芽孢杆菌E20303或其发酵产物在制备防治马铃薯Y病毒引起的病害生物制剂中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌E20303，并提供了其优化培养基，优化后菌株E20303对马铃薯干腐病病原菌的抑制率由优化前的46.51％增加到62.00％，优化力度为：15.49％。本发明萎缩芽孢杆菌E20303为防治马铃薯干腐病病原菌引起的病害提供了新的途径，可有效改善病原物因选择性抗性而不能达到防治作用，应用前景良好。
附图说明
图1是不同碳源对菌株E20303抑制病原真菌活性的影响；
图2是不同氮源对菌株E20303抑制病原真菌活性的影响；
图3是不同无机盐对菌株E20303抑制病原真菌活性的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1菌株E20303的分离纯化
从青海察尔汗盐湖中采集湖水样品，保存带回实验室。
将采集的察尔汗盐湖湖水样品中的菌体进行富集：将滤膜分别装入滤器中，进行121℃灭菌30min，干燥。在无菌条件下，将水样混匀，用装有0.22μm孔径的滤膜的滤器过滤，在滤膜上富集菌体。用于富集的水样量达到30mL时，取下滤膜，放入装有3mL无菌海水的玻璃试管中，为10-1水样。振荡，并放置片刻。之后，将10-1水样依次梯度稀释为10-2水样及10-3水样，备用。吸取200μL上述样品，均匀涂布于培养基平板上，于培养箱中37℃静置培养，每天观察培养情况。待培养基平板上有菌落出现时，挑取单一，接种于新的培养基平板上。将平板纯化好的菌株接种至固体培养基斜面，进行斜面划线，待培养出菌体，加入无菌液体石蜡于4℃下恒温保存。
实施例2菌株E20303的鉴定
按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的操作程序提取菌株16S rDNA。选取细菌16S rDNA通用引物F27和P1541进行PCR扩增。
F27：agagtttgatcctggctcagg；
P1541：aaggaggtggtgatccagccgca。
PCR反应体系为(25μL)：10×Buffer2.5μL，模板DNA 1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，dNTPs(2.5mmol/μL)2μL，引物(10pmol/μL)各1μL，ddH2O 17.3μL。
反应条件为：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s，共30个循环；72℃10min。
PCR扩增产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳上检测后，进行序列测定。所测序列结果如SEQID No.1。
将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，E20303与GenBank中的萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)的相似度最高，从而确定了E20303在分类上属于萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)。
以及以上特征，本发明提供了一种萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)E20303，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，保藏日期：2019年6月17日，保藏编号为GDMCC No:60695。
实施例3菌株E20303培养基的配置
1)在ATCC213改良培养基(MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，蒸馏水至1000mL，pH 7.2-7.4)中加入不同的碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉、甘油)，其他成分及含量不变，在28℃、转速180r/min的摇床上发酵7d后，测定中度嗜盐菌E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性。
结果表明：不同碳源条件下，菌株E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌具有抑制活性。其中，随着对峙培养时间的延长，抑制率逐渐增大。菌株E20303对病原真菌的抑制活性由高到低依次为：淀粉、玉米粉、葡萄糖、蔗糖和甘油，对应的抑制率分别为：39.42％、32.03％、11.35％、11.35％和3.47％(图1)。
2)以不同的氮源(胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、(NH4)2SO4、NH4NO3)分别代替ATCC213改良培养基中的氮源，其他成分及含量不变，摇瓶发酵7d后，测定中度嗜盐菌E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性。
结果表明：不同氮源条件下，菌株E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌具有抑制活性。其中，随着对峙培养时间的延长，抑制率逐渐增大。不同氮源条件下，菌株E20303对病原真菌的抑制活性由高到低依次为：酵母粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硝铵、牛肉膏和硫铵，对应的抑制率分别为：46.44％、39.58％、18.74％、14.30％、13.65％和8.88％(图2)。
3)以不同的无机盐(MgSO4·7H2O、CaCO3、KH2PO4、K2HPO4)分别代替ATCC213改良培养基中NaCl，其他成分及含量不变，摇瓶发酵7d后，测定中度嗜盐菌E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌的抑制活性。
结果表明：不同无机盐条件下，菌株E20303无菌发酵液对马铃薯干腐病病原真菌具有抑制活性。其中，随着对峙培养时间的延长，抑制率逐渐增大。不同无机盐条件下，菌株E20303对病原真菌的抑制活性由高到低依次为：MgSO4·7H2O、K2HPO4、CaCO3、NaCl和KH2PO4，对应的抑制率分别为：36.47％、33.51％、25.63％、24.65％和12.83％(图3)。
4)在碳源、氮源和无机盐优化的基础上，就培养基各组分浓度配比对嗜盐菌E20303抑制马铃薯干腐病病原真菌活性的影响进行研究，所研究变量如表1所示。
表1实验变量的取值及范围
Figure GDA0002334684690000071
以淀粉为碳源，酵母粉为氮源，MgSO4和K2HPO4为主要无机盐的不同组合形成20个实验组合处理，三个独立变量(淀粉、酵母浸粉和K2HPO4)对病原真菌的抑制活性可通过测定值和预测值进行评价，结果表明(表2)：培养基中三个独立变量抑制PVY的活性变化较大。其中，处理5、7、和20对病原真菌的抑制率大于60％；处理5的抑制作用最大，达到62.09％；处理4的抑制率最小，达到48.37％。
表2中心组合设计编码值、观测值和预测值
Figure GDA0002334684690000081
5)为了计算因变量与自变量之间的关系以及对三个变量产生最大抑制率的最佳水平进行准确衡量，需建立一个二阶多项式模型来对三个变量的最佳水平进行预测。
各因子响应二阶方程式为：
y＝48.19+0.68x1-0.13x2+0.48x3-0.06x1 2-0.01x2 2-0.01x3 2+0.03x1x2-0.01x1x3+0.01x2x3
式中，Y是响应值，即抑制率。x1、x2和x3分别表示：淀粉、酵母浸粉和无机盐。
对回归模型进行一阶偏导求导，并令其为零，从而求得曲面的最大点。
0.068-0.012x1+0.003x2-0.001x3＝0；
0.013+0.003x1-0.002x2+0.001x3＝0；
0.048-0.001x1+0.001x2-0.002x3＝0；
对3个三元一次方程求解得：x1＝1.44；x2＝4.86；x3＝4.11。
根据所求得的三个变量最大值，通过响应面回归方程，求得Y＝62.00％。
再根据上述三个变量最大值，通过自变量的编码转化公式，可计算得出各因子及其水平值分别为淀粉(x1)10.72g/L，酵母粉(x2)23.60g/L，无机盐(x3)41.14g/L。
特别需要注意的是，无机盐为MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KCl和K2HPO4的总和，其中MgSO4·7H2O 16g/L、CaCl2·2H2O 1.14g/L、KCl 8g/L和K2HPO416 g/L。
综上所述：嗜盐菌菌株E20303发酵培养基配方为：淀粉10.72g/L、酵母粉23.60g/L、MgSO4·7H2O 16g/L、CaCl2·2H2O 1.14g/L、KCl 8g/L和K2HPO416 g/L。优化后菌株E20303对PVY的抑制率由优化前的46.51％增加到62.00％，优化力度为：15.49％。
实施例4菌株E20303对马铃薯Y病毒的抑制作用
将菌株去菌体发酵液与等体积PVY病毒液混合，同时设置不同阳性对照，采用半叶枯斑法，通过常规摩擦接种方法接种苋色藜，左半叶为空白对照，右半叶为发酵液处理。每个植株接种5片叶片为1个处理，每个处理重复3次，5d后计算抑制率。PVY抑制率的计算方法如下：
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
结果显示，嗜盐菌菌株E20303)在钝化模式下具有中等的抗病毒活性，抑制率为58.12％(表3)。通过相对荧光定量方法对菌株E20303抑制PVY活性进行测定，结果表明：菌株E20303在钝化模式下具有较高的抑制活性，抑制率为96.11％(表3)。
表3菌株E20303抑制马铃薯Y病毒的活性
Figure GDA0002334684690000101
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 青海省农林科学院
<120> 一种萎缩芽孢杆菌E20303及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1393
<212> DNA
<213> 萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)
<400> 1
gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 60
aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg atgcttgttt 120
gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat ggacccgcgg 180
cgcattagct agttggtgag gtaatggctc accaaggcaa cgatgcgtag ccgacctgag 240
agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 300
gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt 360
ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc 420
ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 480
aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt 540
ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg aacttgagtg 600
cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg tggaggaaca 660
ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag 720
cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta agtgttaggg 780
ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg gagtacggtc 840
gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 900
aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacac ccctagagat 960
agggcttccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1020
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg ccagcattca 1080
gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1140
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa caaagggcag 1200
cgagaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc gcagtctgca 1260
actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1320
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg 1380
gtgaggtaac ctt 1393
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag g 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaggaggtgg tgatccagcc gca 23

Claims (4)

1.一种萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)E20303，其特征在于，所述的萎缩芽孢杆菌E20303已于2019年6月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60695。
2.权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌E20303在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用。
3.权利要求1所述的萎缩芽孢杆菌E20303或其菌悬液或其发酵产物在制备防治马铃薯Y病毒引起的病害生物制剂中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的马铃薯Y病毒引起的病害为马铃薯Y病毒病。
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