KR101670592B1

KR101670592B1 - 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 lb14 균주

Info

Publication number: KR101670592B1
Application number: KR1020150058118A
Authority: KR
Inventors: 김경수
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2016-10-28

Abstract

본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 아트로페우스 LB14 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 이용하면, 여러 식물병을 일으키는 진균을 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 합성 농약으로 인한 토양 및 수질 오염 문제를 일으키지 않을 수 있어, 소비자에게 품질이 우수하고, 안전한 농산물을 공급할 수 있다.

Description

식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14 균주{Bacillus atrophaeus LB14 Having Anti-fungal Activity}

본 발명은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.

최근 전 세계적으로 건강한 삶과 환경 보존을 동시에 추구하고 실천하려는 움직임이 커지고 있다. 그 중에서도 식생활, 특히 농산물은 건강과의 연관성이 강하고 직접 섭취함으로써 효과가 비교적 빠르게 나타나기 때문에 이러한 변화에 민감한데, 우리나라 또한 2000년대 이후 황사, 광우병, 구제역 등의 환경재해, 환경오염에 대한 우려로 인해 안전한 먹거리에 대한 소비자의 관심이 높아지고 있다. 그에 따라 친환경농산물에 대한 선호도가 커지며 친환경농산물 재배를 위한 생물농약과 같은 생물학적 방제에 대한 관심과 연구가 증가하는 추세이다.

농업생산에 있어 농약은 작물의 수량과 품질을 향상시키고 인구증가에 따른 공급량을 증가시킨다는 면에서 중요성이 부각되어 왔으며 지금까지 화학비료와 유기합성농약을 통한 화학적 방제가 주를 이루었다. 하지만 농약의 과다사용으로 인한 난분해성 잔류독성이 공기, 토양, 지하수를 오염시켜 환경과 생태계에 미치는 악영향과 식물병원균의 농약 저항성 획득 등에 의한 약효감소 등의 부작용이 증가하고 있다. 이러한 부작용에 대해 미생물제제를 이용한 생물학적 방제법은 잔류독성이 없고 농업생태계를 교란하지 않는다는 점에서 효과적인 대처법으로 각광받고 있으나, 아직 전 세계 농약시장에서 생물학적 방제에 대한 비중이 낮다.

2010년 한국과학기술연구원의 보고에 따르면 국내외 생물농약 시장 규모는 화학농약 대비 약 11% 수준이며, 국내 미생물농약 시장은 80억 원이다. 그러나 전세계적으로 농약 시장에서 합성농약은 줄어드는 반면 생물농약은 연 평균 약 10% 씩 증가하고 있으며 이에 따라 국내 생물농약 역시 2015년엔 약 1800억 원의 규모로 성장할 것으로 예상하고 있다. 현재 우리나라에서는 시도별 친환경 농산물 인증 사업이 시행되고 있으며 그 규모는 점차 증가하고 있지만 대부분의 미생물제제를 수입에 의존하고 이들 미생물이 우리나라의 기후, 토양과 같은 환경조건에 적응하지 못해 효과를 충분히 발휘하지 못하는 경우가 많다.

병원성 곰팡이에 대한 미생물의 항균기작은 미생물에 의한 직접적 길항작용과 식물의 면역시스템을 자극하는 간접적 길항작용으로 나눌 수 있다. 직접적인 길항작용에 의한 생물학적 방제는 사용하는 미생물이 키티나아제와 같은 세포벽 가수분해효소를 분비하거나 철이온에 대한 높은 친화력을 가지고 병원성 진균과 경쟁하여 포자 발아를 억제하는 시데로포어를 분비하여 경쟁적 길항작용을 나타내거나 병원성 진균의 생장을 직접적으로 억제하는 항생물질을 생산하여 곰팡이의 사멸 또는 생육을 정지시켜 식물병 유발을 감소시킨다.

토양에 존재하는 주된 미생물 중 하나인 방선균은 균사형태를 띠고 형태분화를 하는 그람양성 토양미생물이며 복잡한 형태적 분화뿐만 아니라 스트렙토마이신, 액티노마이신, 린코마이신과 같은 항생제, 항암제, 면역억제제로 대표되는 다양한 종류의 이차대사산물을 생산한다. 실제로 자연계에서 미생물이 생장과정에서 생산한 이차 대사산물 중 10,000 여종의 항생물질을 조사한 결과 방선균, 세균 그리고 곰팡이가 각각 64%, 13% 그리고 23%를 차지하며 방선균이 가장 많은 유용 생리활성 물질을 생산하는 것으로 조사되었다. 또한 방선균은 식물병원균으로부터 뿌리를 보호하고, 다양한 인돌-아세트산(indole-acetic acid, IAA)과 같은 다양한 식물 호르몬을 분비하여 식물체의 발달에 영향을 주기도 한다. 하지만 현재 생물학적 방제에 이용되는 미생물 제제로는 고초균, 효모, 광합성균 등으로 대표되는 다양한 유용미생물을 사용하고 있으나 아직까지 방선균의 연구와 활용은 미비한 상태이다.

1. 대한민국 등록특허 제10-121915호

본 발명의 일 양상은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 양상은 바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양상은 식물에 상기 균주 또는 방제용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주를 제공한다.

본 발명은 기존의 미생물 제제에 사용되었던 미생물 종류와는 전혀 다른 신규한 균주로서, 본 발명의 균주는 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균을 억제하며 동시에 식물체에는 철을 공급하여 식물 생장을 촉진할 수 있는 것으로 알려진 시데로포어(siderophore)의 분비 능력이 탁월하며, 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase)의 활성이 월등히 높아 친환경적이고 경제적인 미생물 제제로 이용될 수 있는 장점을 가진다.

본 발명은 다양한 식물에 있어서 식물 병원성 진균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 균주이며, 특히 식량작물, 특용작물, 채소, 과수목 및 화훼 식물에 발생할 수 있는 여러 식물병들에 대한 항균 활성을 나타낼 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 식물은 고구마, 오이, 마늘, 양파, 상추, 고추, 가지, 콩, 옥수수, 감자, 벼, 깨, 밀, 보리, 호박, 무, 부추, 파, 파프리카, 배, 사과, 참외, 메론, 수박, 귤, 포도, 딸기, 토마토, 잔디, 담배, 아이비, 유채, 장미, 리지나, 아밀라리아, 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물이나, 이에 한정하지는 않는다.

본 명세서에서 용어, "식물 병원성 진균"은 식물에 침입하여 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실을 손실 및 손상을 일으키는 병원성 진균(fungi)을 의미하며, 일 구체예에 따르면, 상기 식물 병원성 진균은 탄저병균, 시들음병균, 덩굴 쪼김병균, 검은별무늬병균, 점무늬병균, 잎마름병균, 뿌리음병균, 줄기음병균, 균핵병균, 도열병균, 잿빛곰팡이병균, 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 토양 내 미량 존재하는 필수 생리물질인 철 성분을 선택적으로 흡수하여 병원성 진균을 억제하며 동시에 식물체에는 철을 공급하여 식물 생장을 촉진할 수 있는 시데로포어(siderophore)를 생성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase)를 생성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 세포벽 가수분해 효소인 프로테아제(protease)를 생성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 세포벽 가수분해 효소인 셀룰라아제(cellulase)를 생성하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명의 균주는 불용성 인산의 가용화능을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 식물병은 탄저병, 시들음병, 덩굴 쪼김병, 검은별무늬병, 점무늬병,잎마름병, 뿌리음병, 줄기음병, 균핵병, 도열병, 잿빛곰팡이병, 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 본 발명은 바실러스 아트로페우스 LB14(수탁번호 KACC92039P) 균주가 1.0 x 10⁶ 내지 1.0 x 10¹² cfu/㎖(colony/㎖)의 양으로 포함되어 있는 배양액 또는 균주 건조 분말 10 내지 70 중량%를 포함할 수 있다.

또한, 바실러스 아트로페우스 LB14를 포함하는 식물병 방제용 조성물은 계면활성제, 디옥시벤존(Dioxybenzone), 소듐트리이소프로필설포네이트(Sodium triisopropylsulfonate), 대두유, 옥배유, 면실유 등의 식물성 오일 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 자외선차단제, 글루코오스(Glucose), 수크로오스(Sucrose), 구연산 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 균주의 영양원, 대두유, 이소프로필산포스페이트(Isopropyl acid phosphate), 소듐트리폴리포스페이트(STPP ; Sodium tripolyphosphate) 또는 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 안정제, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검, 잔탄검 또는 이들 중 2 이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 결합제 및 잔량으로서 증량제 등을 혼합하여 제조될 수 있다.

본 발명에 포함되는 계면활성제는 계면활성이 큰 물질로서 분자 중에 친수성기 및 친유성기를 모두 포함하는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력 등이 우수하며, 본 발명에 포함된 바실러스 아트로페우스 LB14가 효과적으로 약효를 발현하도록 습윤, 붕괴 및 분산시키는 작용을 한다.

본 발명에 포함될 수 있는 계면활성제로는 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제 및 비이온성 계면활성제 등 상용화된 모든 종류의 계면활성제들이 사용될 수 있다.

예를 들면, 음이온성 계면활성제로는 탄소수 8-12의 알킬벤젠설포네이트, 탄소수 3-6의 알킬나프탈렌설포네이트, 탄소수 3-6의 디알킬나프탈렌설포네이트, 탄소수 8-12의 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 나프탈렌설포석시네이트포르 말린축합물, 탄소수 8-12의 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 탄소수 8-12의 알킬설페이트, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬설페이트, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 폴리옥시알킬렌숙시네이트와 같은 숙시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등을 들 수 있으며, 비이온성 계면활성제로는 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 탄소수 8-12의 폴리옥시에틸렌알킬페닐폴리머 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 포함될 수 있는 자외선차단제는 제제된 방제용 조성물의 운반, 저장 및 작물에의 처리 후 등에서 빛에 노출 시 빛 중에 포함된 자외선을 차단하여 방제용 조성물 내의 활성성분으로서의 바실러스 아트로페우스 LB14의 안정성을 유지하는 기능을 하는 것으로서, 디옥시벤존, 소듐트리이소프로필설포네이트, 대두유, 옥배유, 면실유 등의 식물성 오일 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 것이 바람직하다. 특히, 불포화기를 많이 포함하는 식물성 오일들이 바람직하다.

본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 영양원은 바실러스 아트로페우스 LB14의 생존을 위한 것으로서, 특히 글루코오스, 수크로오스 등의 당류나 당대사물인 구연산 등을 예로 들 수 있다.

또한, 상기 조성물에 포함될 수 있는 안정제는 본 발명에 따른 방제용 조성물의 안정성을 향상시키기 위하여 첨가되는 성분으로서, 대두유, 이소프로필산포스페이트, 소듐트리폴리포스페이트 등 통상적인 첨가제 등이 사용될 수 있다.

한편, 상기 조성물에 포함될 수 있는 결합제는 본 발명에 따른 방제용 조성물을 구성하는 각 성분들을 긴밀하게 결합 또는 수용토록 하는 것으로서, 일반적으로 널리 사용되는 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검, 잔탄검 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 조성물에 포함될 수 있는 증량제는 상기 계면 활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착 및 분상화시키고, 상기 계면활성제, 자외선차단제, 안정제, 영양원 및 결합제 등과 함께 방제용 조성물의 표면을 이루는 물질로 기능하며, 미생물과 같은 유효성분 및 결합제나 자외선차단제 등과 같은 성분들이 전체 조성에서 적절한 비율로 함유되도록 하기 위하여 전체 조성물의 양을 조절하는 기능을 한다. 이러한 증량제의 사용으로 유효성분이나 기타성분들이 적정량으로 포함될 수 있게 되며, 이들 기능성분들의 과다한 사용을 억제하여 효율적인 방제용 조성물의 제조를 가능하게 하는 역할을 하는 것으로 이해될 수 있다.

예를 들어, 상기 증량제로는 소듐알기네이트(Sodium alginate), 젤라틴화 전분(Pregelatinezed starch; 예를 들면 상품명 미라스퍼스, 미라젤 등), 옥수수전분, 대두박, 밀기울, 입상섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 적절하게 사용될 수 있다. 이들은 특별한 기능을 수행하기 위한 것이 아니고, 단지 방제용 조성물의 양을 증량시키기 위한 것으로서, 경제적이고 화학적으로 비활성인 것이 바람직하다.

본 발명의 방제용 조성물을 액상수화제로 제제하는 경우, 상기 증량제로는 물이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방제용 조성물은 제형에 제한을 받지 않는다.

즉, 본 발명의 하나의 구체적인 제형의 예로서의 입제 조성물 또는 분상의 수화제 조성물은 증량제로서 물을 제외한 증량제를 사용하여 상기 각 성분들을 균일하게 혼합하여 조성될 수 있으며, 혼합된 분상물 자체로서 수화제로 사용할 수 있고, 입제의 경우에만 상기 혼합물을 반죽한 후, 통상의 조립기를 이용하여 사출성형시키고, 건조시켜서 입상으로 성형할 수 있다. 조립기를 이용한 사출성형은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 구체적인 제형의 예로서의 액상수화제 조성물은 증량제로서 물을 사용하여 물에 상기 각 성분들을 분산시켜 조성될 수 있다. 특히, 액상수화제 조성물의 경우, 액제 특성상 칼슘카보네이트, 소르비톨(Sorbitol), 소르빈산(Sorbic acid) 또는 이들 중 2이상의 혼합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 첨가제 및 글리콜류의 동결방지제 등이 더 포함될 수 있다.

상기 첨가제는 붕괴, 확산 및 결합 등에 보조적인 역할을 하는 물질로서 상기 계면활성제를 보조하여 작용하는 것으로 여겨지며, 특히 제형의 액상화를 용이하게 하는 것으로 고려된다.

또한, 상기 동결방지제는 본 발명에 따른 조성물이 액상수화제로서 액상으로 존재하기 때문에 동절기의 혹한 중에도 용이하게 보관할 수 있도록 하기 위한 것으로서, 통상 물의 동결방지를 위한 부동액 성분인 글리콜류, 즉 에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류가 사용될 수 있다.

상기한 바와 같은 제형의 변경은 필요에 따라 적절히 조절될 수 있는 것으로서, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 기본적으로 약리효과를 가지는 본 발명의 균주에 계면활성제, 자외선차단제, 안정제, 미생물의 영양원, 결합제 등을 포함하는 방제용 조성물에 있어서, 다른 보조성분들을 적절히 가감하여 여러 제형으로 구체화시킬 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 식물에 식물병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14 균주 또는 상기 균주를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 식물병의 방제 방법을 제공한다.

일 구체예에 따르면, 상기 방법은 접촉시키는 단계 이전에 바실러스 아트로페우스 LB14 균주를 분리 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 접촉시키는 방법은 바실러스 아트로페우스 LB14 균주를 식물의 씨앗과 동시에 접촉시키거나 씨앗 발아 후 접촉시킬 수 있으며, 식물 성장 과정 또는 성숙된 식물에 접촉시킴으로써 식물 병원성 진균에 대한 항균 활성을 갖도록 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 바실러스 아트로페우스 LB14 균주를 식물에 접촉시키는 경우, 본 발명은 바실러스 아트로페우스 LB14 균주, 바실러스 아트로페우스 LB14 균주가 포함된 배양액 또는 바실러스 아트로페우스 LB14 균주를 분리시킨 배양액의 방식으로 식물에 접촉시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 제공하는 식물 병원성 진균에 대한 식물의 방제 방법은 상기 바실러스 아트로페우스 LB14 균주를 이용하는 방법이므로, 본 발명의 명세서의 과도한 중복 기재를 피하기 위하여, 이 둘의 공통된 내용은 생략한다.

본 발명에 따른 바실러스 아트로페우스 LB14 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 이용하면, 여러 식물병을 일으키는 진균을 효과적으로 저해할 수 있으며, 종래의 합성 농약으로 인한 토양 및 수질 오염 문제를 일으키지 않을 수 있어, 소비자에게 품질이 우수하고, 안전한 농산물을 공급할 수 있다.

도 1은 일 구체예에 따른 균주들(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 16s rRNA 염기서열 분석을 통하여 유전학적 위치를 동정한 결과이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주들의 C. acutatum(a~f) 및 C. gloeosporioides(g~l)에 대한 균사생장 억제율 결과를 나타낸 사진이다(LB01(a, g), LB14(b, h), HM03(c, i), HM17(d, j), LB15(e, k). Controls(f, l)).
도 3은 일 구체예에 따른 균주들(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 C. acutatum(a) 및 C. gloeosporioides(b)에 대한 균사생장 억제율 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주들(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 키티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제 생성능 조사 결과를 나타낸 사진이다.
도 5는 일 구체예에 따른 균주들(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 인산가용화능 및 시데로포어 생성능 조사 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 일 구체예에 따른 균주들(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 C. acutatum(a) 및 C. gloeosporioides(b)에 대한 포자발아 억제율 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 균주들 LB01(a), LB14(b), HM03(c), HM17(d), LB15(e)와 화학농약(피라클로스트로빈)(f), 무처리(g), 배양배지만 처리(h)한 경우 의 C. acutatum에 대한 방제효과를 나타낸 사진이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험 방법

1. 균주의 분리 및 동정

영종도 서쪽 해안의 갯벌(mudflat)로부터 토양시료를 채취하였다. 채취한 시료는 실험실로 옮겨와 갯벌 시료 1 g을 멸균수 9 ml에 넣어 진탕배양 후 10^-5까지연속 희석하였고, LB agar 평판 배지(trytone 1%, yeast extract 0.5%, NaCl 0.5%, agar 1.5%) 및 marine agar 평판 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 1 ml씩 첨가하여 도말하였다. 3일 동안 28℃에서 배양한 다음 같은 배지를 이용하여 계대 배양한 후, 분리한 균주들을 20%의 글리세롤(glycerol)이 담긴 LB 평판 배지에 -70℃에서 보관하였다.

상기 분리 과정을 통해 획득한 균주들 중에서 높은 항진균능을 갖는 5개의 균주를 분리하여 각각 LB01, LB14, HM03, HM17, LB15로 명명하였다.

균주 LB01, LB14, HM03, HM17, LB15를 동정하기 위해 16s rDNA의 염기서열을 분석하였다. 24시간동안 배양하여 얻어진 3 ml의 각각의 세균으로부터 DNA를 추출하였다. Wizard genomic DNA purification kit(Promega, USA)를 사용하여 DNA를 추출하였으며, 16s rRNA는 Thermal cycler thermal controller 2720 (Applied Biosystems, USA)에서 유니버셜 프라이머인 27F(서열번호 1: AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), 1492R (서열번호 2: TACGGYTACCTTGTTACGACTT)를 사용하여 증폭하였다. PCR 산물은 DNA purification kit(Intron, Korea) 를 이용하여 정제한 후, 518F (서열번호 3: CCAGCAGCCGCGGTAATACG) 및 800R (서열번호 4: TACCAGGGTATCTAATCC; Macrogen Inc., Seoul, Korea) 프라이머를 사용하여 염기서열을 판독하였다. 염기서열 분석에는 소프트웨어 NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)의 BLASTN 프로그램을 이용하였다. MEGA6.0의 ClusterW program으로 NCBI 뉴클레오티드 데이터베이스를 정렬하고, neighbor-joining treeing algorithm을 사용하여 계통도(phylogenetic tree)를 작성하였으며, 1,000 부트스트랩 값(bootstrap value)으로 계통간의 유전적 거리 차이를 표시하였다.

2. 항진균 활성 분석(균사 생장 억제능 조사)

식물 병원성 진균류인 탄저병균(C. acutatum , C. gloeosporioides)에 대한 균사 생장 억제율을 확인하기 위해 디스크 확산법(disc plate diffusion)을 이용하였다.

포테이토 덱스트로스 아가(Difco Co.) 평판 배지의 중앙에 직경 4 mm의 콜크 보러(Cork Borer)를 이용하여 잘라낸 탄저병균 디스크를 두고 주변부에 분리균주 디스크를 두어 대치한 실험군과 분리균주 디스크를 놓지 않은 대조군을 각각 암상태에서 25℃에서 10일간 배양하여 생육 저지환(Inhibition zone)의 유무와 크기를 조사하였다. 시험은 3번 반복으로 3번 실시하였으며, 균사 생장 억제율은 하기 수학식 1과 같이 계산하였다.

[수학식 1]

균사생장억제율(%)= (1-처리구 배지의 균총의 직경/대조군배지의 균총의 직경)*100

3. 항진균 물질 기능성 분석

LB01, LB14, HM03, HM17, LB15 균주 각각을 대상으로 곰팡이의 세포벽을 분해시키는 세포벽 가수분해 효소인 키티나아제(chitinase), 프로테아제(protease), 셀룰라아제(cellulase)와 경쟁적 길항작용으로 곰팡이의 생장을 저해하는 시데로포어(siderophore)의 생성 유무 및 인산가용화능을 조사하였다.

3-1. 키티나아제 생성능 조사

균주의 키티나아제 활성을 측정하기 위해 먼저 콜로이드 키틴을 제조하였다. 콜로이드 키틴은 80 g의 키틴에 1 L의 concentrated HCl을 첨가하여 1시간 동안 교반한 후, 콜로이드 키틴을 필터 페이퍼 위에 올려놓고 pH가 6-7이 되도록 증류수로 수회 세척하였다.

키티나아제 활성을 조사하기 위해서 키틴-펩톤 배지(K₂HPO₄ 0.7 g/L, KH₂PO₄ 0.3 g/L, MgSO₄·H₂O 0.5 g/L, FeSO₄·H₂O 0.01 g/L, ZnSO₄ 0.001 g/L, MnCl₂ 0.001 g/L, agar 15 g/L, 콜로이드 키틴 0.5 g, dH₂O 1 L)에 균주를 접종하여 25℃에서 5일간 배양 후 키티나아제 생성능을 평가하였다.

3-2. 프로테아제 생성능 조사

프로테아제 생성능을 조사하기 위해서 2%의 스킴 밀크(Difco Co., USA)와 3% NaCl이 첨가된 LB 배지에 균주를 접종하여 25℃에서 5일간 평판 배양 후 상기 배지에서 투명환을 형성하는 콜로니를 확인하였다.

3-3. 셀룰라아제 생성능 조사

셀룰라아제 생성능을 조사하기 위해 CMC 아가(KH₂PO₄ 1.0 g/L, MgSO₄·H₂O 0.5 g/L, NaCl 0.5 g/L, FeSO₄·H₂O 0.01 g/L, MnSO₄·H₂O 0.01 g/L, NH₄NO₃ 0.3g, carboxymethyl cellulose 10 g/L, agar 12 g/L) 배지에 균주를 각각 접종하여 3일간 25℃에서 배양한 후 Congo red plate 방법(Teather and Wood, 1982)으로 셀룰라아제의 생산을 확인하였다.

3-4. 시데로포어의 형성능 조사

균주의 시데로포어 분비 유무를 조사하기 위해 chrome azurol S (CAS) blue agar plate assay 방법을 이용하였다. 1L의 CAS agar를 만드는 방법은 다음과 같다: (1) siderophores indicator인 dark-blue dye solution은 60.5 mg의 CAS를 50 mL 증류수에 녹인 다음 FeCl₃·H₂O 1 mM과 HCl 10 mM이 첨가된 iron (III) solution을 10 ml 첨가한 후, 40 mL 증류수에 HDTMA 72.9 mg을 녹인 solution을 함께 멸균하였다. 또한, (2) medium solution (750 mL 증류수에 100 ml 10x MM9 salts (Na₂HPO₄ 60 g/L, KH₂PO₄ 0.9 g/L, NaCl 5 g/L, NH₄Cl 10 g/L), agar 15 g, PIPES 30.24 g, NaOH (50%, w/w) 12.0 g을 넣고 멸균하여 50℃로 냉각시킨 후, casamino acids (10%, w/v) 30 ml, glucose(20%, w/v) 10 mL, thiamine·HCl(0.2%, w/v) 1 mL, L-tryptophane(1%, w/v) 3 ml를 첨가한다)을 제조한 후, (1)과 (2)를 혼합하여 CAS blue agar plate를 만들었다. 제조된 CAS 아가 평판 배지에 직경 4 mm 콜크 보러를 이용하여 구멍을 낸 뒤, 각각의 구멍에 20 ㎕의 균주를 주입하여 25℃에서 5일간 배양시켜 시데로포어 생성능을 평가하였다. LB 배지를 음성 대조군으로 사용하였으며, 노란색 환의 형성 유무를 확인하고 활성 물질을 시데로포어로 판단하였다.

3-5. 인산가용화능 조사

균주의 인산가용화능을 조사하기 위해 Pikovskaya's 고체배지(glucose 10 g/L, Ca₃(PO₄)₂5 g/L, (NH₄)₂SO₄ 0.5 g/L, NaCl 0.2 g/L, MgSO₄·H₂O 0.1 g/L, KCl 0.1 g/L, yeast extract 0.2 g/L, MnSO₄·H₂O 0.001 g/L, FeSO₄·H₂O 0.001 g/L)를 사용하고, pH를 6.8로 조정하였다. Pikovskaya 배지에 균주를 접종하고 25℃에서 15일간 배양 후 투명환 형성 여부를 관찰하였다.

4. 식물성 병원균에 대한 예방효과 확인

4-1. 포자 발아 억제능 조사

고추탄저병균(C. acutatum , C. gloeosporioides)에 대한 바실러스 균주(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 포자 발아억제능을 확인하기 위해 각각의 균주를 배양한 배양액(1.0 OD)을 각각 10배, 100배, 1000배로 희석하여 고추 탄저병 분생 포자현탁액(1 x 10⁴conidia/ml)과 혼합하였다. 혼합액을 hydrophovic slide(Knittel Glaser, Germany)에 놓고 배양기에서 25℃, 20시간동안 배양하였다. 포자 발아 억제율은 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

[수학식 2]

포자 발아 억제율(%)= (1 - 처리구의 발아율/무처리구의 발아율)*100

4-2. 방제효과 조사

식물성 병원균 중 고추탄저병원균에 대한 예방효과를 확인하기 위해, 1% NaOCl으로 1분간 표면살균하고 멸균수로 세척 후 상온 건조된 고추 과실에 각각의 세균 배양액(1.0 OD)을 처리하여 24시간 경과 후 고추탄저병원균(C. acuatum)의 포자현탁액(3.5 x 10⁴conidia/ml)을 접종하고 14일간 배양하면서 식물성 병원균에 대한 병반을 측정(ImageJ 1.48V)하였다.

5. LB14 균주의 생화학적 특성 분석

LB14 균주의 생화학적 특성을 API 50CHB kit(Biomereux Co., France)를 사용하여 분석하였다. 탄수화물 이용능과 생화학적 특성을 판별하기 위한 API 50CHB 검사는 제조회사(BioMerieux Co, Durham, NC, USA)가 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다. 순수 분리한 각각의 균주를 API 50CHB 배지에 McFarland 1이 되도록 탁도를 맞추었다. 탁도를 맞춘 API 50CHB 배지를 API 50CHB 스트립의 튜브에 분주하고 공기와의 접촉을 막기 위해 mineral oil을 첨가한 후, 25℃에서 48시간 배양한 후 결과를 측정하였다.

6. LB14 균주의 항균 활성 분석 - 항진균 활성 분석(균사 생장 억제능 조사)

탄저병균(C. acutatum , C. gloeosporioides) 이외의 식물 병원성 진균류에 대한 균사 생장 억제율을 확인하기 위해 디스크 확산법(disc plate diffusion)을 이용하였다. 실험 방법은 상기 2에서 탄저병균에 대한 균사 생장 억제율을 확인하기 위해 실시한 방법과 동일한 방법으로 실시하였다.

실험 결과

1. 분리 균주의 동정

16s rDNA의 염기서열 분석 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 LB01은 Bacillus amyloliquefaciens로 동정되었으며, LB14, HM03, HM17은 Bacillus atrophaeus, LB15는 Bacillus pumilus로 동정되었다. 이 중, 후술한 바와 같이 항균 활성이 우수한 LB14를 "Bacillus atrophaeus LB14"로 명명하여 국립농업과학원에 기탁하고, 기탁번호 KACC92039P를 부여받았다.

2. 항진균 활성 분석 결과

디스크 확산법을 통해 식물 병원성 곰팡이 C. acutatum 및 C. gloeosporioides 를 균주와 함께 7일간 대치 배양하여 생육 저지환의 유무와 크기를 조사한 결과, LB01 균주가 C. acutatum 와 C. gloeosporioides 에 대하여 각각 60.15%, 58.12%의 생육 저해능을 보여 가장 높은 생육 저해능을 갖는 것으로 확인되었다. C. acutatum 와 C. gloeosporioides 에 대하여 LB14 균주는 각각 59.29%과 53.87%, HM03과 HM17 또한 50% 이상의 생육 저해능을 나타내었으며, LB15 균주가 가장 낮은 생육 저해능을 갖는 것으로 확인되었다(도 2 및 도 3).

3. 항진균 물질 기능성 분석 결과

키티나아제, 프로테아제, 셀룰라아제 생성능을 확인하기 위해 콜로이달 키틴, 스킴 밀크, 카복시메틸 셀룰로오즈를 각각 포함하는 평판 배지에 배양한 결과, 세 균주 LB14, HM03, HM17에서 키틴을 분해함을 알 수 있었다. 또한, LB01, LB14, HM03, HM17, LB01 균주의 경우 우수한 단백질 분해능을 가짐을 확인할 수 있었으며, LB01의 경우 우수한 셀룰라아제 생성능을 확인할 수 있었다(도 4).

시데로포어의 형성능을 조사한 결과, 모든 균주가 CAS 아가 배지에서 투명대를 형성하여 우수한 시데로포어 생산 균주임을 확인할 수 있었다. 특히, 다섯 개의 균주 중 LB14, HM03, LB15 균주는 매우 우수한 시데로포어 생산능을 가짐을 알 수 있었다. 또한, LB14, HM03, LB15 균주는 매우 높은 인산가용화능을 갖는 것으로 확인되었다(도 5).

4. 식물성 병원균에 대한 예방효과 확인

4-1. 포자 발아 억제능 조사

포자는 주요한 전염원으로 알려져 있는 바, 바실러스 균주(LB01, LB14, HM03, HM17, LB15)의 고추탄저병(C. acutatum , C. gloeosporioides)에 대한 포자 발아억제능을 확인한 결과, LB01, LB14, HM03, HM17 균주의 10배 희석된 배양액에서 효과적으로 포자 형성이 억제되었으며, LB14의 경우 모든 일련의 배양액에서 C. acutatum 및 C. gloeosporioides의 포자 발아 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다(도 6).

4-2. 방제 효과 조사

바실러스 균주의 고추탄저병 병원균에 대한 방제효과를 확인한 결과, 표 1및 도 7에 나타난 바와 같이 바실러스 균주에 처리에 의해 고추의 병반 면적이 현저히 감소하였다. 바실러스 균주를 처리한 고추의 병반 면적은 2.9~45%에 해당하나 무처리한 고추의 경우 88.6%의 병반 면적을 나타내었다. LB1의 경우 방제효과는 86.5%로 고추탄저병 병원균에 대한 가장 높은 방제효과를 나타내었다. 표 1에서 윗첨자 a, b, c는 Duncan's multiple range test (p=0.05)에 의한 통계결과로 control에 있는 c와 다른 알파벳인 a, b는 유의성이 있다는 것을 의미한다.

Treatment	Diseased area (%) ^a	Suppression efficiency (%)
LB01	5.3±4.3^a	94.0
LB14	2.9±2.4^a	96.7
HM03	9.1±7.2^a	89.7
HM17	5.2±5.6^a	94.2
LB15	45.9±16.4^b	48.1
Fungicide^c	2.8±0.7^a	96.8
Control	88.6±2.7^c	-
LB medium	0.0±0.0^a	-

5. LB14 균주의 생화학적 특성 분석 결과

위에서 살펴본 바와 같이 LB14 균주는 우수한 길항 효과 및 탄저병 억제능을 갖는 것으로 확인되어, LB14 균주를 선정하여 생화학적 특성을 분석하였다. API 50CHE 키트를 이용하여 LB14 균주의 당 분해능을 조사한 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 glycerol, L-arabinose, ribose, D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-manitol, L-sorbitol, arbutin, esculin, salicin, cellobiose, sucrose, trehalose를 분해하는 특성을 나타내었다. 계통학적으로 매우 유사한 바실러스 아트로페우스의 경우 D-xylose, inulin, gluconate를 대사할 수 있으나, LB14 균주에서는 음성반응을 보여 계통학적으로는 매우 유사하지만 탄소원 이용성 시험에서는 차이가 있음을 확인할 수 있었다.

Substrate	LB14	B. *subtilis*	Substrate	LB14	B. *subtilis*
Control	-	-	Esculin	+	+
Glycerol	+	+	Salicin	+	+
Ertythritol	-	-	Cellobiose	+	+
D-Arabinose	-	-	Maltose	△	+
L-Arabinose	+	+	Lactose	-	-
Ribose	+	+	Melibiose	-	+
D-Xylose	-	+	Sucrose	+	+
L-Xylose	-	-	Trehalose	+	+
D-Adonitol	-	-	Inulin	-	+
β-Methyl-D-Xyloside	-	-	Melexitose	-	-
D-Galactose	-	-	Raffinose	-	+
D-Glucose	+	+	Starch	-	+
D-Fructose	+	+	Glycogen	-	+
ibD-Mannose	+	+	Xylitol	-	-
L-Sorbose	-	-	β-Gentiobiose	△	-
L-Rhamnose	-	-	D-Turanose	-	+
Dulcitol	-	-	D-Lyxose	-	-
Inositol	△	+	D-Tagatose	-	-
D-Manitol	+	+	D-Fucose	-	-
L-Sorbitol	+	+	L-Fucose	-	-
α-Methyl-D-Mannoside	-	-	D-Arabitol	-	-
α-Methyl-D-Glucoside	△	+	L-Arabitol	-	-
N-Acethyl-Glucosamine	-	-	Gluconate	-	+
Amygdalin	+	+	2-keto-Gluconate	-	-
Arbutin	+	+	5-keto-Gluconate	-	-

6. LB14 균주의 항균 활성 분석 결과

LB14 균주는 탄저병균에 대한 항균활성 외에도, 표 3에 나타난 바와 같이 Cladosporium cucumerinum , Alternaria longissima , Magnaporthe oryzae , Botrytis cinerea, Corynespora cassiicola , fusarium solani , Fusarium oxysporum , Rhizoctonia solani , Sclerotinia sclerotiorum , Phytophthora nicotianae에 대하여 항균활성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 표 3에서 윗첨자 a 는 Duncan에 의한 통계학적 수치로 같은 letter끼리는 성장 억제 능력 차이가 유의성이 없고 다른 letter 와는 유의적 차이를 보인다는 것을 의미한다. 예를 들어, a는 b와 억제능력이 다르다는 것을 나타낸다.

Classification			Strain	Growth inhibition (%) ^a
Phylum	Class	Species	Strain	Growth inhibition (%) ^a
Ascomycota	Dothideomycetes	Cladosporium cucumerinum	KACC 45735	71.2±2.3a
Ascomycota	Dothideomycetes	Alternaria longissima	KACC 44350	68.6±3.9ac
Ascomycota	Sordariomycetes	Magnaporthe oryzae	KJ 201	62.1±2.3bc
Ascomycota	Leotiomycetes	Botrytis cinerea	KACC 40574	59.5±2.3c
Ascomycota	Dothideomycetes	Corynespora cassiicola	KACC 44719	55.6±2.3c
Ascomycota	Sordariomycetes	Fusarium solani	KACC 44891	46.4±2.3d
Ascomycota	Sordariomycetes	Fusarium oxysporum	KACC 24795	43.8±4.5de
Basidiomycota	Agaricomycetes	Rhizoctonia solani	KACC 40146	42.5±2.3de
Ascomycota	Leotiomycetes	Sclerotinia sclerotiorum	KACC 40457	37.3±3.9e
Heterokonta	Oomycetes	Phytophthora nicotianae	KACC 44717	12.4±2.3f

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

국립농업과학원

KACC92039P

20150211

Claims

탄저병균, 시들음병균, 덩굴 쪼김병균, 검은별무늬병균, 점무늬병균, 잎마름병균, 뿌리음병균, 줄기음병균, 균핵병균, 도열병균, 잿빛곰팡이병균 및 잎집무늬마름병균으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물 병원성 진균에 대하여 항균 활성을 갖는 바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 식물은 고구마, 오이, 마늘, 양파, 상추, 고추, 가지, 콩, 옥수수, 감자, 벼, 깨, 밀, 보리, 호박, 무, 부추, 파, 파프리카, 배, 사과, 참외, 메론, 수박, 귤, 포도, 딸기, 토마토, 잔디, 담배, 아이비, 유채, 장미, 리지나, 아밀라리아, 및 인삼으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물인 것인 균주.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 시데로포어(siderophore)를 생성하는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 키티나아제(chitinase)를 생성하는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 프로테아제(protease)를 생성하는 것인 균주.
청구항 1에 있어서, 상기 균주는 셀룰라아제(cellulase)를 생성하는 것인 균주.
바실러스 아트로페우스 LB14(Bacillus atrophaeus LB14)(수탁번호 KACC92039P) 균주를 유효성분으로 포함하는 탄저병, 시들음병, 덩굴 쪼김병, 검은별무늬병, 점무늬병, 잎마름병, 뿌리음병, 줄기음병, 균핵병, 도열병, 잿빛곰팡이병, 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병에 대한 방제용 조성물.
삭제
식물의 씨앗 또는 식물체 자체에 청구항 1의 균주 또는 청구항 8의 조성물을 접촉시키는 단계를 포함하는 탄저병, 시들음병, 덩굴 쪼김병, 검은별무늬병, 점무늬병, 잎마름병, 뿌리음병, 줄기음병, 균핵병, 도열병, 잿빛곰팡이병, 및 잎집무늬마름병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 식물병에 대한 방제 방법.
삭제