KR101759881B1

KR101759881B1 - 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아 nibryj209 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101759881B1
Application number: KR1020160174380A
Authority: KR
Inventors: 배창환; 지원재; 여주홍
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2017-07-21

Abstract

본 발명은 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에서는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P)가 잔디병 원인균의 성장을 억제시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 자연 친화적인 생물 농약으로 사용될 수 있으며, 잔디 병원균에 대한 방제 효과 및 식물의 생육을 촉진시키는 효과가 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주 및 이의 용도{Bacillus vanillea NIBRYJ209 strain for having antifungal activity against fungus causing turfgrass disease and improved plant growth activity and uses thereof}

본 발명은 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

환경부는 수질 및 수생태계 보전에 관한 법률 제61조 및 동법 시행규칙 제89조에 따라 골프장 농약 사용실태조사 및 잔류량 검사를 통해 맹·고독성 농약의 사용을 방지하고 골프장 및 주변지역의 토양·지하수 오염과 하천 하류에 미치는 환경피해를 사전에 예방·감시하고 있다. 또한, 그 결과를 매년 SGIS(Soil Groundwater Information System, 토양지하수정보시스템)에 공개하고 있는데 2014년 전국 503개 골프장을 대상으로 농약사용 실태를 조사한 결과 제주(에코랜드)와 경남(의령친환경골프장) 두 곳을 제외한 전국 대부분의 골프장에서는 화학 농약을 사용하고 있으며, 농약 사용량은 전년 대비 7.6%로 증가한 총 159.3톤('13년 148톤)으로 농약과다 사용에 따른 지하수 오염 등 환경피해가 예상된다.

전 세계적으로 잔디에 발생하는 병의 종류는 리족토니아 잎마름병 등 약 64종이며, 국내 골프장에 발생하는 중요한 병은 10여종이 보고(한국식물병리학회, 2009)되어 있다. 국내 발생되는 잔디병해 가운데 동전마름병(Dollar spot, Sclerotinia homoeocarpa), 봄마름병(Rhizoctonia cerealis) 및 갈색잎마름병(Brown patch, Rhizoctonia solani)은 현재 만연되어 발생하는 심각한 잔디병으로 전국 골프장에 널리 발생하고 있다. 동전마름병의 경우 병반의 크기가 5cm 이하로 병이 진전되면서 대형의 불규칙한 병반이 형성되기도 하며, 습하고 이슬이 많이 맺히는 서늘한 기온에서 병 발생이 용이하다. 리족토니아 잎마름병(라지패치)의 병원균은 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) AG2-2(Ⅳ)이며 균사생육 최적온도는 25∼30℃이고, 병징은 잔디가 휴면에 들어가는 늦은 가을과 휴면이 깨어나는 이른 봄에 주로 발생되는 것으로 알려져 있다.

최근 골프인구 증가 및 환경문제에 대한 관심도가 증가되면서 환경 친화적인 골프장 관리에 대한 요구도 더불어 증가되고 있다. 또한, 농약사용에 대한 규제가 강화되고 이용 가능한 농약에 대한 저항성을 가진 병원균이 출현함에 따라 친환경 방제방법 개발이 대안으로 요구된다. 미생물제제의 특징은 화학 농약에 비해 병원균의 저항성 발생이 낮으며 환경오염 문제를 발생시키지 않는 장점이 있다. 다양한 미생물을 토양으로부터 분리하여 토양을 매개로 하는 식물병원균의 발생을 억제하는 연구가 이루어지고 있는데, 동전마름병의 생물농약으로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis, Novozymes Biologicals, USA), 바실러스 서틸리스(AgraQuest INC., USA)가 해외에서 개발되어 사용되고 있다. 국내에서도 항균활성물질을 함유한 방선균(Streptomyces sp.) 등을 활용하여 골프장에서 발생하는 병원균의 생물학적 방제제로서의 가능성에 대한 연구를 부분적으로 수행하고 있다.

한편, 한국공개특허 제2009-0104337호에는 '길항 미생물 함유 잔디의 생육촉진 및 병해방제용 조성물 및 이를 이용한 잔디 관리 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1323177호에서는 '식물 병원균 방제 효과를 가지는 바실러스 속 CNU-BA-2 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 '잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 토양에서 분리한 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주가 잔디병 원인균 3종인 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 리족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대해 항진균 활성을 보이는 것을 확인하였으며, 이 외에도 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리컴 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 피시움 알파니데르마툼(Pythium aphanidermatum)인 5종의 식물병원균에 대해 항진균 활성을 보이는 것을 확인하였다. 게다가, 프로테아제 및 β-글루카나제를 분비하고, IAA(Indole 3-Acetic Acid) 및 암모니아를 생성하여 식물생육 촉진 활성을 가지는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 통해 분리된 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주는 특히, 식물생육 촉진제로서뿐만 아니라 잔디병 방제제로 매우 유용하게 사용될 수 있는 점을 확인하였으므로, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 유효성분으로 함유하는 잔디병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주의 유효량을 식물 또는 토양에 살포함으로써 잔디병을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명에서는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주가 잔디병 원인균의 성장을 억제시키는 것을 확인하였다. 본 발명의 바실러스 바닐레아 NIBRYJ209 균주는 농약의 부작용으로 발생하는 환경 오염 및 잔류 농약으로 인한 인체 독성의 위험성이 없는 자연 친화적인 생물 농약으로 사용될 수 있으며, 잔디 병원균에 대한 방제 효과 및 식물의 생육을 촉진시키는 효과가 있으므로, 산업적으로 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 잔디병 원인균 3종에 대한 항진균 효능을 검정한 결과이다.
도 2는 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 배양시간에 따른 균주 밀도변화(A) 및 배지 종류에 따른 항진균 활성(B)을 조사한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 초기 배지 pH 조건에 따른 성장곡선(A) 및 48시간 배양액 시료를 이용한 항진균 활성(B)을 조사한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주 배양액의 항진균 활성에 있어서 열에 대한 안정성을 조사한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주 배양액의 항진균 활성에 있어서 pH에 대한 안정성을 조사한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주 배양액의 항진균 활성에 있어서 효소에 대한 안정성을 조사한 결과이다.
도 7은 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 식물병 원인균 5종에 대한 항진균활성을 조사한 결과이다.
도 8은 본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 항진균 이차대사물 분석을 위해 부탄올층을 취하여 TLC 및 바이오오토그래피(bioautography)로 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성 및 식물생육 촉진 활성을 가지는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P)에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 잔디병 원인균은 동전마름병(Dollar spot) 원인균, 봄마름병 원인균 또는 갈색잎마름병(Brown patch) 원인균일 수 있고, 바람직하게는 동전마름병 원인균인 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 봄마름병 원인균인 리족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 또는 갈색잎마름병 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리컴 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 피시움 알파니데르마툼(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택되는 진균에 대한 항진균 활성을 추가로 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 프로테아제 및 β-글루카나제를 분비하고, IAA(Indole 3-Acetic Acid) 및 암모니아를 생성하여 식물생육 촉진 활성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 항진균 물질인 설팍틴(surfactin), 이투린(iturin) 또는 펜기신(fengycin)을 생산할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 잔디병 방제용 조성물은 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P)를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 잔디병 방제용 조성물은 수화제(wettable powder) 또는 액상수화제(suspension concentrate) 형태의 제형일 수 있다. 본 발명에 의한 방제용 조성물은 액상 살균제 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 즉 화학 살균제 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물 살균제로 제형화가 가능하다.

본 발명의 수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P) 또는 이의 배양액, 흡습제로서 화이트 카본(white carbon), 습윤제로서 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 분산제로서 소듐 리그노설포네이트 및 증량제로서 카올린으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 중량% 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P) 또는 이의 배양액, 1 중량% 화이트 카본(white carbon), 1 중량% 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 1 중량% 소듐 리그노설포네이트 및 87 중량% 카올린으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 액상수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P) 또는 이의 배양액, 습윤제 및 분산제로서 MBSC(Nonylphenol, ethoxylated, monoether with sulfuric acid, sodium salt, Sodium bis[20 ethylhexyl] sulfosuccinate Polyoxyethylene nonylphenol), 부형제로서 이소프로판올 및 증량제로서 물로 이루어질 수 있다. 상기 액상수화제는 바람직하게는 50 중량% 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P) 또는 이의 배양액, 4 중량% MBSC, 30 중량% 이소프로판올 및 16 중량% 물로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 조성물에서, 상기 잔디병은 동전마름병, 봄마름병 또는 갈색잎마름병일 수 있고, 바람직하게는 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa)에 의한 동전마름병, 리족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis)에 의한 봄마름병 또는 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 의한 갈색잎마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 잔디병을 방제하는 방법으로는 상기 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P)를 배양한 배양액 또는 상기 균주를 이용한 방제용 조성물을 잔디나 토양에 분무 또는 살포하여 수행할 수 있다. 상기 잔디는 바람직하게는 한국형 잔디(zoysiagrass)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 '유효량'은 유익한 또는 원하는 결과를 일으키기에 충분한 양으로, 잔디병을 방제하기 위해 방제용 조성물을 물로 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 식물체 및 경작지에 살포할 수 있다. 본 발명의 수화제 또는 액상수화제를 물에 희석하는 경우 수화제 또는 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 10⁵ 내지 10¹⁰cfu/㎖, 바람직하게는 10⁸cfu/㎖ 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

1. 잔디병해에 대한 항균활성을 가지는 균주 선발 및 동정

가. 균주 선발

항균성 균주를 선발하기 위해 2015년 1월부터 전국 50개 지역으로부터 토양시료를 확보한 후 토양 10 g을 살균수 90 ㎖와 혼합하고, 1 ㎖을 채취하여 9 ㎖ 멸균수에 차례대로 희석한 후 100 ㎕씩 취하여 NA(Nutrient Agar) 배지에 평판희석법으로 25℃에서 3일 이상 배양하여 각 균주를 순수분리하였다. 배양 후 생성된 콜로니의 모양, 색, 중심부의 형태, 주변부의 형태 등 다른 특성을 가진 균주를 순수 분리하였다.

나. 잔디병 원인 진균 생장억제 능력 검정

순수 분리된 균주들을 대상으로 잔디병원균 3종, 동전마름병(Dollar spot, Sclerotinia homoeocarpa), 봄마름병(Rhizoctonia cerealis), 갈색잎마름병(Brown patch, Rhizoctonia solani)에 대한 항진균 활성이 있는 균주를 선발하기 위해 PDA(potato dextrose agar) 평판배지 위에 대치배양한 후, 잔디병 3종의 생육을 저해하는 균주를 최종 선발하였다.

다. 길항균주의 동정

잔디병원균 3종에 항진균 활성을 가진 균주 NIBRYJ209를 16s rRNA 염기서열 분석하여 NCBI 진뱅크에 등록된 균주들과 유사도 및 EZtaxon의 형태 균주와 비교한 결과 NIBRYJ209는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea)와 99% 상동성을 나타내었다. 16s RNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 바실러스 속 균주와 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위해 계통수를 작성한 결과, 선발된 균주는 바실러스 바닐레아를 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있었다.

2. 항균 균주의 성장조건 탐색

(1) 적정 배양온도 조건

선발된 균주의 성장을 위한 적정 배양 온도 조건을 알아보기 위해서, 각각의 균주의 단일 콜로니를 TSA (Tryptic Soy Agar) 배지에 접종한 후 15-45℃(5℃ 간격)에서 2일간 배양하며 균의 성장을 관찰하였다.

(2) 적정 pH 조건

선발된 균주의 성장을 위한 적정 배양 pH 조건을 알아보기 위해서, HCl 및 NaOH를 이용하여 TSA 배지의 pH 4.0-11.0(0.5 간격)으로 조정한 후 각각의 균주의 단일 콜로니를 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양하며 균의 성장을 관찰하였다.

(3) 적정 NaOH 농도 조건

선발된 균주의 성장을 위한 적정 배양 pH 조건을 알아보기 위해서, HCl 및 NaOH를 이용하여 TSA 배지의 NaOH 농도조건을 0-8.0%로 조정한 후 균주의 단일 콜로니를 접종하여 37℃에서 3일간 정치배양하며 균의 성장을 관찰하였다.

3. 항균 물질생산 조건 탐색

(1) 적정 배지 조건

선발된 균주에 대한 적정 배양 배지 조건을 알아보기 위해서 균주의 단일 콜로니를 100 ml BHI (Brain Heart Infusion), 100 ml TSB, 100 ml LB (Luria Broth), 100ml NB (Nutrient Broth), 100 ml YB (효모 추출물 0.1%, Meat extract 2%)에 접종하여 37℃ 및 200rpm의 조건에서 4일간 진탕배양하면서 24시간 간격으로 샘플링하여 세균수 측정을 위해 분광광도계 파장 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 시료는 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 균체를 분리하여 배양여액을 준비하였다. 배지별 48시간 배양여액 100 μl를 사용한 아가 웰 확산법으로 동전마름병 원인균에 대한 항진균 활성을 비교하였다.

(2) 적정 배양 pH 조건

초기 pH 조건이 균주의 성장 및 항진균 물질 생산에 미치는 영향을 알아보기 위해서 100 ml TSB (Tryptic Soy Broth) 배지의 pH를 6.0-11.0(1.0 간격)으로 조정하여 배지를 준비하였다. 균주의 단일 콜로니를 접종하여 37℃에서 4일간 진탕배양하면서 24시간 간격으로 샘플링하여 분광광도계 파장 600 nm의 흡광도에서 세균수(Cell mass)를 측정하였고, 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 균체를 제거한 배양여액을 준비하였다. 각 pH별 48시간 배양여액 100 μl를 사용한 아가 웰 확산법으로 동전마름병 원인균에 대한 항진균 활성을 비교하였다.

4. 항균 활성을 가지는 균주의 특성 조사

가. 세포외 효소생산 조사

(1) 키티나제( Chitinase )

선발된 균주의 키틴 분해효소(chitinase)의 분비 여부를 확인하기 위해서 균주의 단일 콜로니를 0.5%의 콜로이드성의 키틴(colloidal chitin, Megazyme, USA)이 포함된 TSA 배지에 접종한 후 37℃에서 7일간 정치배양하면서 콜로니 주변의 키틴 분해환 생성 유무를 관찰하였다.

(2) 프로테아제(Protease)

선발된 균주의 단백질 분해효소(protease)의 분비 여부를 확인하기 위해서 균주의 단일 콜로니를 2%의 스킴 밀크가 포함된 TSA 배지에 접종한 후 37℃에서 2일간 정치배양하면서 콜로니 주변의 분해환(halo zone) 생성 유무를 관찰하였다. 분해환의 명확한 관찰을 위해 쿠마시 브릴리언트 블루 G(Sigma, USA)로 염색하였다.

(3) β-글루카나제(β- glucanase )

선발된 균주의 글루칸 분해효소(β-glucanase)의 분비 여부를 확인하기 위해서, 균주의 단일 콜로니를 글루칸이 포함된 TSA 배지에 접종한 후 37℃에서 2일간 정치배양하면서 콜로니 주변의 분해환(halo zone) 생성 유무를 관찰하였다.

나. 길항균주의 IAA( Indole 3-Acetic Acid) 생성 조사

선발된 균주의 IAA (Indole 3-Acetic Acid)의 분비 유무를 확인하기 위해서 균주의 단일 콜로니를 100 ml TSB 배지에 접종하여 37℃ 및 200 rpm의 조건에서 2일간 진탕배양하였다. 배양액을 150,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 배양여액을 취하여 반응에 사용하였다. 배양여액 1 ml에 Salkowsky's reagent 2 ml을 가하여 암조건에서 30분간 반응을 유도한 후 분홍색으로의 발색유무를 확인하였다. 균주를 접종하지 않은 TSB 배지를 이용한 반응액을 대조군으로 사용하였다.

다. 암모니아 생성 조사

선발된 균주의 암모니아 생성 유무를 확인하기 위해서 균주의 단일 콜로니를 10 ml 펩톤수 (1% 펩톤, 0.5% NaCl)에 접종하여 37℃ 및 200 rpm의 조건에서 2일간 진탕배양하였다. 배양액을 150,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 배양여액을 취하여 반응에 사용하였다. 배양여액 1 ml에 Nessler's reagent 0.05 ml을 가하여 암조건에서 30분간 반응을 유도한 후 노란색으로의 발색 유무를 확인하였다. 균주를 접종하지 않은 TSB 배지를 이용한 반응액을 대조군으로 사용하였다.

라. 인산가용화 (Phosphate solubilizing ) 조사

선발된 균주의 인산가용화 유무를 확인하기 위해서 균주의 단일 콜로니를 PVK 배지(0.05% 효모 추출물, 1% 글루코스, 0.5% Ca₃(PO₄)₂, 0.05% (NH₄)₂SO₄, 0.002% KCl, 0.01% MgSO₄, 0.00001% MnSO₄, 0.00001% FeSO₄, 1.5% 아가)에 접종하여 37℃에서 5일간 정치배양하면서 콜로니 주변의 분해환을 관찰하였다.

마. 식물병 항진균 활성 조사

선발된 균주를 대상으로 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotlorum), 콜레토트리컴 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 피시움 알파니데르마툼(Pythium aphanidermatum)의 식물병 5종에 대한 항진균 활성 여부를 알아보기 위해 PDA 평판배지 위에 대치배양하였다.

5. 항균물질의 안정성 조사

선발된 균주의 48시간 배양여액을 이용하여 온도, pH 및 각종 효소처리에 대한 안정성을 조사하였다. 온도에 대한 영향을 알아보기 위해서 배양여액을 4℃, 50℃, 100℃에서 1시간, 121℃에서 15분간 열처리한 후 아가 웰 확산(agar-well diffusion)법으로 잔존활성을 측정하였다. pH에 대한 영향을 알아보기 위해서 pH를 2.0-11.0(1.0 간격)으로 조정한 후 4℃에서 24시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다. 각종 효소(펩신, 프로나제, 프로테아제 및 프로티나제 K)에 대한 영향을 알아보기 위해서 반응 완충액은 25 mM Tris-Cl(pH 7.5)를 사용하였으며, 효소의 최종 농도는 2 mg/ml이 되도록 처리하여 37℃에서 2시간 방치한 후 잔존활성을 측정하였다. 효소를 처리하지 않은 반응액을 대조군으로 사용하였다.

6. 항균물질 검정

가. 항균 물질 추출 및 농축

선발된 균주의 단일 콜로니를 100 ml TSB 배지에 접종하여 37℃ 및 200 rpm의 조건에서 2일간 진탕배양하였다. 배양액을 150,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양여액과 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)를 섞고 3시간 이상 방치한 후 에틸아세테이트층을 취하는 방식으로 3회 반복하였다. 에틸아세테이트층과 분리된 배양여액은 동량의 부탄올(BuOH)을 첨가하여 섞고 3시간 이상 방치한 후 부탄올층을 취하는 방식으로 3회 반복하였다. 부탄올층과 분리된 배양여액층과 에틸아세테이트층 및 부탄올층을 각각 감압농축기로 농축하여 무게를 측정한 후 최종 농도가 100 mg/ml이 되도록 100% 메탄올을 가하여 녹였다.

나. 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, TLC) 분석

상기 부탄올층을 실리카 겔 60 F₂₄₅(Merck, USA)을 사용한 TLC로 분석하였다. 전개용매는 클로로포름:메탄올:물(14:6:1)을 사용하였으며, 물질의 소수성의 특징을 이용한 물 발색을 수행하여 전개된 물질을 확인하였다.

실시예 1. 잔디병해에 대한 항균활성을 가지는 균주 선발 및 동정

가. 균주 선발 및 잔디병 원인 진균의 생장억제 능력 검정

유용균주 선발을 위해 전국 50개 지역의 토양으로부터 균주를 순수 분리하여 모양, 색, 중심부의 형태, 주변부의 형태 등 특성이 다른 콜로니 200개의 균주를 선발하였다. 1차 분리한 균주를 대상으로 수집 보관 중인 잔디 동전잎마름병 원인균인 스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 갈색잎마름병 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 그리고 봄마름병균 원인균인 리족토니아 세리알리스(Rhizoctonia cerealis) 균주와 대치배양한 결과 잔디 병해 3종에 대하여 항진균 활성이 우수한 균주 NIBRYJ209를 선발하였다(도 1 및 표 1).

본 발명에서 선발된 NIBRYJ209 균주의 잔디병해에 대한 효과

Pathogen	Isolated bacteria
Pathogen	NIBRYJ209
Sclerotinia homoeocarpa (A)	+++
Rhizoctonia cerealis (B)	++
Rhizoctonia solani (C)	++

A : +++: 저지대(IZ) 15mm 초과, ++: IZ 12~15mm, +: IZ 12mm 미만

B : +++: 저지대(IZ) 18mm 초과, ++; IZ 15~18mm, +; IZ 15mm 미만

C : +++; 저지대(IZ) 14mm 초과, ++; IZ 11~14mm, +; IZ 11mm 미만

나. 길항균주의 동정

잔디병원균 3종에 항진균 활성을 가진 균주 NIBRYJ209를 16s rRNA 염기서열 분석하여 NCBI 진뱅크에 등록된 균주들과 유사도 및 EZtaxon의 형태 균주와 비교한 결과 NIBRYJ209는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea)와 99% 상동성을 나타내었다. 16s RNA 유전자의 구조에 근거하여 기존 바실러스 속 균주와 분자계통학적 유연관계를 파악하기 위해 계통수를 작성한 결과, 선발된 균주는 바실러스 바닐레아를 포함하는 계통학적 그룹에 포함됨을 알 수 있다. 또한, 생화학적 특성조사를 위해 키트 검정결과 바실러스 속(Bacillus sp.)의 결과를 보였으며, 선발된 균주는 농업생명공학연구원에 기탁번호 KACC92160P로 기탁하였다.

선발된 NIBRYJ209 균주의 생화학적 특성

No.	기질종류	반응 결과	No.	기질종류	반응 결과
1	potassium nitrate	+	11	D-mannose	-
2	L- tryptophane	-	12	D-mannitol	-
3	D-glucose	+	13	N-acetyl-glucosamine	-
4	L-arginine	+	14	D-maltose	-
5	urea	+	15	potassium gluconate	-
6	esculin ferric citrate	-	16	capric acid	-
7	gelatine(bovine origine)	+	17	adipic acid	-
8	4-nitrophenyl-βD- galactopyranoside	+	18	malic acid	-
9	D-glucose	-	19	trisodium citrate	-
10	L-arabinose	-	20	phenylacetic acid	-

실시예 2. 항균 활성을 가지는 균주의 성장조건 탐색

선발된 균주의 성장을 위한 조건 탐색 결과, 온도 37∼40℃, pH 6.0∼7.0 그리고 NaCl 농도 1.0∼1.5%에서 잘 성장하였다.

실시예 3. 항균물질 생산 조건 탐색

균주에 의해 생산되는 항진균 물질은 배지의 종류, 배지의 pH 및 배양온도 등에 따라 달라진다. 따라서 항진균 물질의 생산에 관여하는 배양변수를 조사하는 것은 중요하다. 선발된 NIBRYJ209 균주의 온도조건에 따른 배양적 특성을 조사한 결과 30℃, pH7, 48시간 이상 배양 조건에서 600nm 파장의 OD값이 1.4 이상으로 가장 잘 배양되었다. 적정 배지선발을 위해 배지 종류별 30℃에서 배양한 결과 TSB(Tryptic Soy Broth, Difco) 배지에서 200rpm으로 48시간 배양하였을 경우 OD값이 가장 높았으며, 항진균 활성 역시 가장 높게 나타났다(도 2).

선발된 NIBRYJ209 균주의 항진균 활성 물질 생산에 대한 초기 pH의 영향을 조사하기 위하여 pH 6~11까지 배지에서 배양한 결과는 도 3과 같다. pH 6-10에서 균체는 생육을 잘 하였으나, pH 11에서 균체는 생육하지 않았으며, 항진균 활성은 pH 6에서는 50%, pH 7-8에서는 100%인 반면, pH 9-11에서는 항진균 활성을 나타내지 않았다(도 3).

실시예 4. 항균물질의 안정성 조사

선발된 NIBRYJ209 균주 배양 상등액의 항균 활성에 있어서 온도, pH, 효소에 대한 안정성을 조사한 결과는 도 4 내지 도 6과 같다. 배양 상등액의 온도에 대한 안정성의 경우 4~50℃ 범위에서 100% 활성을 보였으며, 100℃에서는 110% 활성을 보인 반면 121℃에서는 15분간 열처리한 후 72%의 활성을 나타내었다(도 4). 선발된 균주 배양 상등액은 pH 7, 8, 9에서 각각 100%, 99%, 103%, pH 5, 6에서는 80-90% 활성을 나타내었으며, pH 10, 11에서 94%의 활성을 나타내었다(도 5). 또한 배양 상등액은 무처리구와 비교하여 펩신, 프로테아제 등을 포함한 모든 효소를 처리하였을 때 84-100%로 높은 활성을 나타내었다(도 6).

실시예 5. 식물병원성 진균 생장억제 능력 검정

선발된 균주 NIBRYJ209가 2차 대사산물로 키티나제, 프로테아제, β-글루카나제 생성여부를 조사하였다. 진균의 세포벽 주성분인 키틴을 분해하는 키티나제의 분비를 확인한 결과 선발된 균주는 키티나제를 분비하지 않았다. 단백질 분해 효소생성 여부는 2% 스킴 밀크 배지에 접종하고 쿠마시 브릴리언트 블루 G로 염색한 결과, 선발된 균주에서 프로테아제를 분비하는 것으로 확인되었다. 또한 선발된 균주가 글루칸 분해효소의 분비 여부를 확인한 결과 분해 환(halo zone)이 생성하였다. 식물생육 촉진과 관련하여 NIBRYJ209 균주의 배양 상등액을 Salkowsky 시약을 처리한 결과 분홍색으로 변화됨에 따라 식물 성장호르몬인 IAA(indole-3-acetic acid)를 생성함을 확인하였다. 암모니아의 경우 휘발성 항진균 물질로 작용할 수 있는데, Nessler 시약을 처리한 결과 노란색으로 발색됨에 따라 암모니아 생성 여부를 확인하였다(표 3). 또한 선발된 균주 NIBRYJ209는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리컴 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 피시움 알파니데르마툼(Pythium aphanidermatum) 등의 식물병원성 진균의 생육억제에 효과가 확인되었다(표 4 및 도 7).

본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 식물 생육촉진 활성

용액	결과
Chitinase	(-)
Protease	(+)
ß-glucanase	(+)
Phosphate solubilizing	(-)
IAA(Indole 3-Acetic Acid)	(+)
Ammonification	(+)

본 발명에서 선발한 NIBRYJ209 균주의 식물병원균 항진균 활성

병원균	항진균 활성(*)
Sclerotinia sclerotiorum	++
Colletotrichum acutatum	+++
Botrytis cinerea	+++
Fusarium oxysporum	++
Pythium aphanidermatum	++

(*) +++: 저지대 20mm 초과, ++: 저지대 10~20mm, +: 저지대 10mm 미만

실시예 6. 길항균주의 항진균 물질 검정

선발된 균주 NIBRYJ209의 항진균 이차대사물 분석을 위해 부탄올층을 취하여 TLC 분석한 결과 시클로리포펩티드(cyclolipopeptide) 계열인 설팍틴(surfactin), 이투린(iturin), 그리고 펜기신(fengycin) 등 3종류의 항진균 물질이 분리되었다(도 8). 분리된 3종류의 항진균 물질 가운데 봄마름병에 활성이 있는 물질 확인을 위해 바이오오토그래피(bioautography) 분석 결과 이투린 및 펜기신에 의한 항진균 활성을 나타내는 것으로 추정된다.

농업생명공학연구원

KACC92160P

20161215

Claims

스클레로티니아 호모에오카르파(Sclerotinia homoeocarpa), 리족토니아 세레알리스(Rhizoctonia cerealis) 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)의 잔디병 원인균에 대한 항진균 활성, 프로테아제 및 β-글루카나제를 분비하고, IAA(Indole 3-Acetic Acid) 및 암모니아를 생성하는 바실러스 바닐레아(Bacillus vanillea) NIBRYJ209 균주(기탁번호: KACC92160P).
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclerotiorum), 콜레토트리컴 아쿠타툼(Colletotrichum acutatum), 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum) 및 피시움 알파니데르마툼(Pythium aphanidermatum)으로 이루어진 군에서 선택되는 진균에 대한 항진균 활성을 추가로 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
삭제
제1항에 있어서, 상기 균주는 설팍틴(surfactin), 이투린(iturin) 또는 펜기신(fengycin)을 생산하는 것을 특징으로 하는 균주.
제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 균주를 유효성분으로 함유하는 동전마름병, 봄마름병 또는 갈색잎마름병 방제용 조성물.
삭제
제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 균주의 유효량을 식물 또는 토양에 살포함으로써 동전마름병, 봄마름병 또는 갈색잎마름병을 방제하는 방법.