KR101152671B1

KR101152671B1 - 항균활성을 가지는 신규의 바실러스 속 ｂｓ061 균주 및 이를 이용한 식물병 방제용 조성물

Info

Publication number: KR101152671B1
Application number: KR1020100006258A
Authority: KR
Inventors: 윤봉식; 김영숙; 이인경
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2010-01-25
Filing date: 2010-01-25
Publication date: 2012-06-15
Also published as: KR20110086890A

Abstract

본 발명은 식물체 잎에서 분리한 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주 및 이를 이용한 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주는 각종 작물에 발생하는 흰가루병 및 잿빛곰팡이병 방제효과가 뛰어나며, 기타 식물병원균에 광범위한 항균 활성 스펙트럼을 나타낸다. 또한 항균활성의 지속성이 뛰어나며 균주의 특성 역시 물리화학적으로 안정하므로 우수한 다기능의 생물농약 재료로 활용이 가능하다.

Description

항균활성을 가지는 신규의 바실러스 속 ＢＳ061 균주 및 이를 이용한 식물병 방제용 조성물{A novel strain of Bacillus sp. BS061 having anti-pathogens activity and composition for controlling plant disease}

본 발명은 식물체 잎에서 분리한 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주 및 이를 이용한 식물병 방제용 조성물에 관한 것이다.

식물 병원균 방제를 위한 화학합성 농약 사용량 증대는 내성균주의 출현을 유발하였고, 이에 따라 내성 균주를 방제하기 위하여 새로운 종류의 합성농약 수요와 농약 사용량은 계속 증가하고 있는 실정이다. 이같이 점차적으로 증가하는 화학합성 농약은 생분해성과 선택성이 낮아 생태계를 파괴함은 물론 토양에 축적되어 먹이 사슬을 통해 사람과 가축에 직접적, 간접적인 피해를 준다. 그러므로 화학합성 농약에 비하여 인간의 건강과 환경에 해가 적고, 저독성이며, 생분해성인 생물학적 방제(biological control)제의 개발이 절실히 요구된다.

미생물이나 이들이 생산하는 물질을 이용한 생물학적 방제는 화학농약의 오 남용에 의한 부작용 없이 식물 병원균을 방제하는 대체 수단으로 이용되고 있다. 그람양성 세균인 바실러스 속 미생물은 슈도모나스(Pseudomonas)속 다음으로 널리 연구되고 상용화된 미생물로서 내생포자(endospore)를 형성하는 특징을 가지는 속으로 다양한 식물병 방제제로 보고되어 있다. 이들 바실러스 속의 미생물은 즈비터마이신(zwittermicin)-A, 카노사민(kanosamine)이나, 설팍틴(surfactin), 이투린(iturin) 및 펜지신(fengycin)이 속한 리포 펩타이드(lipopeptides)계 항균물질을 생산하는 것으로 알려져 있다. 중국에서는 바실러스 속의 많은 미생물들을 수확량 증진을 위하여 널리 사용하고 있으며, 독일 바이엘(Bayer)사는 바실러스 FZB 24을 포함하는 토양전염병 방제제를 개발한 바 있다. 또한 2001년 구스타프손(Gustafson)사는 바실러스 섭틸러스(B. subtilis)와 바실러스 아밀로리퀴페이시언스(B. amyloliquefaciens)을 섞어 바이오일드(BioYield)라는 미생물 살균제를 출시하였다.

한편, 미국 아그라퀘스트(AgraQuest)사는 세레나데(Serenade)라는 바실러스 섭틸리스 QST713 균주를 이용한 미생물 살균제를 개발하였다. 이 미생물 살균제는 상기 바실러스균을 이용한 제품들과는 달리 주로 엽면에 발병하는 공기전염병을 효과적으로 방제하는 살균제로서 잿빛곰팡이병, 모발록병 및 흰가루병 등 40여 가지 이상의 식물병을 방제하는 것으로 알려져 있다. 상기 미생물은 항생물질로 이투린(iturin), 플리파스틴(plipastin) 및 서펙틴(surfactin)을 포함한 30여가지 이상의 리포펩타이드(lipopeptide)를 생산하는 것으로 알려져 있다.

국내에서는 바실러스 속의 미생물을 이용한 살균제로서 탑시드(그린바이오텍), 가루스타(고려바이오) 등이 있으나 이들은 오직 흰가루병에만 효과를 나타내므로 그 사용에 있어 많은 제한이 따른다.

이에 본 발명자들은 각종 작물의 흰가루병 및 잿빚곰팡이병에 방제효과를 가지며 다양한 식물병원균에 대하여 항진균 활성이 우수한 미생물을 제공하고자 연구, 노력한 결과, 아카시아의 잎에서 분리, 동정된 바실러스 속 BS061 균주가 다양한 식물병원균에 항진균 활성을 가지는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 항진균 활성을 갖는 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주 및 이를 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 항진균 활성을 갖는 신규의 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주(수탁번호: KCTC 10977BP)를 그 특징으로 한다.

또한 본 발명은 상기 균주, 균주 현탁액 또는 균주의 배양 상등액을 포함하는 식물병 방제용 조성물을 또 다른 특징으로 한다.

본 발명의 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주는 각종 작물에 발생하는 흰가루병 및 잿빛곰팡이병 방제효과가 뛰어나며, 기타 식물병원균에 광범위한 항균 활성 스펙트럼을 나타낸다. 또한 항균활성의 지속성이 뛰어나며 균주의 특성 역시 물리화학적으로 안정하므로 우수한 다기능의 생물농약 재료로 활용이 가능하다.

도 1은 BS061 균주가 생산하는 항진균 물질을 분리 및 정제하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 BS061 균주의 배양 상등액의 물층 분획물의 흰가루병에 대한 항균활성을 나타낸 사진이다.
도 3은 BS061 균주의 배양 상등액의 부탄올층 분획물의 잿빛곰팡이병에 대한 항균활성을 나타낸 사진이며, Bu는 부탄올층 분획물, W는 물층 분획물을 나타낸 것이다.
도 4는 BS061 균주가 생산하는 항진균 물질의 HPLC 분석 결과이다.
도 5는 BS061 균주가 생산하는 이투린 A2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A3의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 7은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A4의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 8은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A5의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 9는 BS061 균주가 생산하는 이투린 A2의 ESI-mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 10은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A3의 ESI-mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A4의 ESI-mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12은 BS061 균주가 생산하는 이투린 A5의 ESI-mass 스펙트럼을 나타낸 것이다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 바실러스 속 (Bacillus sp.) BS061균주는 그람 양성균으로서, 내생 포자를 형성하고, 이투린(iturin) 계열의 항균 물질을 생산하며, 대한민국 대전시 유성구에 위치한 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 2006년 8월 2일자로 기탁되었다(기탁번호 : KCTC10977BP).

본 발명에 의한 상기 균주, 균주 현탁액 또는 균주의 배양 상등액은 다양한 식물병 병원균에 대한 방제효과를 나타내므로, 상기 균주, 균주 현탁액 또는 균주의 배양 상등액 포함하는 식물병 방제용 조성물을 권리범위로 포함한다. 상기 식물병 병원균으로는 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 흰가루병원균, 토마토 잎곰팡이병원균(Fulvia fulva), 고추탄저병원균(Colletotrichum gloeosporioides), 인삼 뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans), 인삼모잘록병원균(Rhizoctonia solani), 시들음병원균(Fusarium oxysporum), 사과 점무늬낙엽병원균(Alternaria mali), 인삼 점무늬병원균(Alternaria panax) 또는 인삼잘록병원균(Pythium sp.) 등이 있으며, 상기 흰가루병원균으로는 오이의 스페로테카 후스카(Sphaerotheca fusca), 딸기의 스페로데카 아파니스(Sphaerotheca aphanis)가 있다.

본 발명의 바실러스 속 (Bacillus sp.) BS061균주는 80℃ 이상의 고온에서 안정하고, UV나 pH의 변화에도 항균 활성을 유지할 수 있다.

본 발명의 바실러스 속 (Bacillus sp.) BS061균주가 생산하는 항진균 활성물질은 4 종류의 화합물로 나타났으며, 이에스아이-메스(ESI-mass) 분석 결과 분자량 1057, 1043, 1057, 1057인 물질로, 수소핵자기공명 (¹H-NMR) 과 탄소핵자기공명(¹³C-NMR) 스펙트럼으로부터 8개의 아미노산으로 구성된 하기 화학식 1의 이투린(iturin) A2, A3, A4, A5로 확인되었다.

상기 화학식 1에서, R은 (CH₂)₈CH(CH₃)CH₂CH_3,(CH₂)₁₀CH_3,(CH₂)₉CH(CH₃)₂또는(CH₂)₁₁CH₃ 를 나타낸다.

상기 이투린 화합물은 사이드 체인(R)의 종류에 따라 4종류의 화합물로 나타나며, R이 (CH₂)₈CH(CH₃)CH₂CH₃ 인 경우가 이투린 A2,R이 (CH₂)₁₀CH₃ 인 경우가 이투린 A3, R이(CH₂)₉CH(CH₃)₂인 경우가 이투린 A4, R이 (CH₂)₁₁CH₃ 인 경우가 이투린 A5 화합물을 의미한다.

이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자 하는 하나의 예일 뿐, 이에 의하여 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.

실시예 1 : BS061 균주의 분리 및 동정

본 발명의 균주는 대전 인근의 야산에 자생하는 아카시아(Robinia pseudo-acacia)의 잎에서 분리하였다.

채집한 잎을 물로 씻고 풍건한 후, 1 중량% 차아염소산나트륨으로 표면살균하고 막자사발로 충분하게 갈아 멸균 증류수로 희석하였다. 희석액을 뮤엘라 힌톤 한천배지(Mueller Hinton agar)에 중층법으로 처리하여 27℃ 배양기에서 2~3일 배양한 후 몇 번의 계대배양을 거쳐 순수하게 1종의 미생물을 분리하였으며, 분리된 미생물을 BS061이라 명명하였다.

분리된 균주는 뉴트리언트 한천(nutrient agar) 배지, 감자 슈크로스 한천(potato sucrose agar) 배지 및 뮤엘라 힌톤 한천(Mueller Hinton agar) 배지에서 양호하게 생육하며 뮤엘라 힌톤 액체 배지에서 주황색 색소를 형성하였으며, 생육 적온은 30℃ 였다. 균주는 그람 양성이며 간상형 미생물로, 운동성을 가지며 내생포자를 형성하는 호기성 미생물임을 확인하였다.

실시예 2 : BS061 균주의 배양

상기 실시예 1에서 확인한 바와 같이, 상기 분리된 균주 BS061은 감자 슈크로스 한천 배지, 뉴트리언트 한천 배지, 뮤엘라 힌톤 한천 배지 등에서 충분히 생장, 배양이 가능함을 확인한 바, 이하에서는 뮤엘라 힌톤 한천 배지를 사용하였다.

상기 균주의 배양을 위해, 뮤엘라 힌톤 한천 21g을 1 리터 증류수에 넣어 잘 녹인 후, 500ml 삼각플라스크에 200ml씩 각각 분주하고, 1.5기압 121℃로 20분간 고압 살균하여 배지를 얻었다다. 상기 배지에 플레이트 상태의 BS061 균을 백금이로 취하여 접종한 후 30℃에서 150rpm으로 흔들어주면서 4일간 배양하였다.

상기 배양된 배양액은 주황색을 띠고 점성을 보이며, pH는 8.0 이었다.

실시예 3 : BS061 균주의 항균 활성 분석

상기 실시예 2에 의하여 얻어진 배양액을 원심분리(8000rpm, 20분, 10℃)하여 균체와 배양 상등액으로 나누고, 상기 균체를 멸균수에 현탁한 균체 현탁액과 상기 배양 상등액 각각을 페이퍼 디스크(paper disk)에 50㎕씩 점적하고 풍건하였다. 상기 페이퍼 디스크를 미리 제작한 병원균 검정용 플레이트에 치상하여 2 ~ 3일 배양한 후 생성된 저지환의 크기를 조사하였다

병 원 균	항균 활성 (mm)
병 원 균	배양 상등액	균체 현탁액
Botrytis cinerea	15±1.4	31
Magnaporthe grisea	21.5±2.1	21
Fusarium oxysporum	15±1.9	18
Fulvia fulva	13.5±1.1	10
Alternaria mali	17±1.5	15
Colletotrichum gloeosporiodes	27±2.3	14
Alternaria panax	28±1.5	20
Pythium sp .	0	15
Cylindrocarpon destructans	11±1.3	17
Rhizoctonia solani	10±1.5	15
Trichoderma sp.	0	10

상기 BS061균주의 균체 현탁액 또는 배양 상등액은, 식물병원성 진균인 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 벼 도열병균(Magnaporthe grisea), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 토마토 잎곰팡이병균(Fulvia fulva), 사과 점무늬낙엽병균(Alternaria mali), 고추 탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides), 인삼잘록병균(Pythium sp.), 인삼 뿌리썩음병균(Cylindrocarpon destructans), 인삼 모잘록병균(Rhizoctonia solani) 등에 대하여 우수한 항균활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 시설재배에서 극심한 피해를 야기하는 잿빛곰팡이병균에 매우 우수한 항균효과를 나타내었다.

실시예 4 : BS061 균주의 배양 상등액의 오이흰가루병 방제효과

온실조건의 포트에서 재배 중인 오이 잎에 흰가루병(Sphaerotheca fusca)이 10 %정도 발생한 시기에 상기 실시예 3에 의하여 얻은 BS061 배양 상등액을 물에 20 배로 희석하여 일주일 간격으로 3회 살포하고, 최종 살포 7일 후 잎에서의 발병율을 조사하였다.

한편 동일한 조건으로 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis)를 유효성분으로 하는 세레나데(아그라퀘스트사, 400 배 희석)와 화학농약인 훼나리유제(동양화학, 4000배 희석)를 살포하여 발병율을 비교하였고, 하기 수학식 1, 2는 발병율, 방제가의 계산 방법을 나타내며, 상기 비교 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

[수학식 1]

발병지수 : 0 : 발병 면적율 0 %

1 : 발병 면적율 1~5 %

2 : 발병 면적율 5.1~20%

3 : 발병 면적율 20.1~40 %

4 : 발병 면적율 40 % 이상

N= 조사주수

[수학식 2]

방제가(%)=(1-처리구의 발병율/무처리구의 발병율) × 100

처리내용	발병율(%)	방제가(%)
배양 상등액 희석액	29.3±5.8	62.4
세레나데 희석액	34.4±6.9	55.9
훼나리 희석액	5.7±2.8	92.7
수돗물	78±9.3	-

상기 표 2에서 보는 바와 같이 본 발명에서 얻은 배양 상등액 희석액은 합성농약인 훼나리보다는 낮은 활성을 나타내나 대조 바실러스 속 미생물 제제인 세레나데보다 현저하게 우수한 방제효과를 얻을 수 있었다.

실시예 5 : BS061 균주의 배양 상등액의 딸기흰가루병 방제효과

BS061균 배양물의 딸기 흰가루병(Sphaerotheca aphanis) 방제효과를 알아보기 위해 충남 논산에 위치한 논산딸기시험장에서 재배중인 매향 품종에 본 발명에 의한 균 배양물을 일주일 간격으로 3회 살포한 다음 최종 살포 7일 후 이병과율을 조사하였다.

한편 동일한 조건으로 미생물 농약인 세레나데(아그라퀘스트사, 400배 희석)와 화학농약인 트리후민(바이엘크롭사이언스사, 4000배 희석)을 살포하여 이병과율, 방제가를 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

처리 내용	처리과수		이병과율(%)	방제가(%)
처리 내용	전체과수	이병과수	이병과율(%)	방제가(%)
배양 상등액 희석액	459	74	16.1	80.3
세레나데 희석액	376	138	36.7	55.1
트리후민 희석액	431	56	13	84.1
수돗물	486	397	81.7

상기 표 3에서 보는 바와 같이 발명에서 얻은 배양 상등액 희석액은 수돗물이나 대조 바실러스 속 미생물 제제인 세레나데보다 현저하게 우수한 방제효과를 나타내었으며, 딸기 흰가루병에 널리 사용되는 화학 농약인 트리후민과도 유사한 효과를 나타내었다.

실시예 6 : BS061균주가 생산하는 항진균물질의 분리와 정제

본 발명에 의한 균주의 배양 상등액에 포함된 항진균 활성 물질을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다(도 1).

상기 실시예 3의 방법으로 얻은 BS061균주의 배양 상등액을 부탄올로 추출하여 부탄올층과 물층으로 분리하였다. 상기 분리된 분획물을 흰가루병과 잿빛곰팡이병에 대한 활성을 조사한 결과, 물층의 분획물은 흰가루병에 대하여(도 2), 부탄올층의 분획물은 잿빛곰팡이병에 대하여 항균활성을 나타내었다(도 3).

상기 부탄올층의 분획물을 세파덱스(Sephadex LH-20) 컬럼에 적용하여 메탄올(aq. 70%)로 용출시키고, 이를 다시 sep-pak cartridge 컬럼(메탄올 40 ~ 90%)을 통과시킨 뒤, 이 활성분획을 HPLC(Column: 4.6 × 150 mm, Mobile phase: 30% acetonitrile + 0.04% trifluoroacetic acid, Flow rate: 1 ㎖ / min, Detector: 210nm)를 실시하여 4종류의 항진균 물질을 분리하였다(도 4).

상기 4종류의 항진균 물질의 구조분석을 위하여 NMR 스펙트럼 (NMR spectrum)을 측정, 해석하였다.

상기 항진균 물질의 수소 스펙트럼 (¹H NMR spectrum (400 MHz))을 측정한 결과, 6.6 ~ 9.2 ppm 사이에서 다수의 아미드 프로톤 및 1,4-이치환벤젠에 기인하는 수소들이 관찰되었다. 또한 3.5 ~ 4.8 ppm 사이에서 펩티드의 알파수소에 기인하는 프로톤 및 0.82 ~ 1.98 ppm 사이에서 알킬사슬에 기인하는 시그널들이 확인되었다(도 5 ~ 8).

또한 탄소 스펙트럼 (¹³C NMR spectrum)에서는, 9.7 ~ 173.9 ppm 사이에서 12개의 카르보닐 탄소들이 관찰되었으며 1,4-이치환벤젠에 유래하는 탄소(127.6, 9.4, 15.0, 55.6 ppm) 및 46 ~ 60 ppm 사이에서 아미노산의 알파탄소에 기인하는 시그널들이 관찰되었다.

상기의 NMR 스펙트럼과 물리화학적 특성으로부터 상기 항진균 활성 화합물은 아미노산으로 구성된 리포펩티드로 추정되었다. 따라서 본 화합물의 분자량을 구명하고 화합물을 동정하기 위하여 ESI-메스 스펙트럼 (ESI-mass spectrum)을 측정하였다 (도 9 ~ 12).

상기 측정 결과, 4종류의 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 이투린(iturin) A2, A3, A4 및 A5로 확인되었다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 (CH₂)₈CH(CH₃)CH₂CH₃ _,(CH₂)₁₀CH₃ _,(CH₂)₉CH(CH₃)₂또는(CH₂)₁₁CH₃ 를 나타낸다.

상기 이투린 화합물에서, R이 (CH₂)₈CH(CH₃)CH₂CH₃인 경우가 이투린 A2,R이 (CH₂)₁₀CH₃인 경우가 이투린 A3, R이(CH₂)₉CH(CH₃)₂인 경우가 이투린 A4, R이 (CH₂)₁₁CH₃ 인 경우가 이투린 A5 화합물을 의미한다.

이투린(iturin)계 항진균 물질은 8개의 이성질체가 혼합되어 생산되며, 아스퍼질러스 피버스(Aspergillus feavus), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonis solani), 컬레토트리컴 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides) 등을 포함하는 다양한 식물병원균에 대하여 항진균 작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

따라서 본 발명의 BS061 균주, 균주 현탁액 또는 균주의 배양 상등액은 상기 이투린 A2, A3, A4, A5를 포함하고 있어, 잿빛곰팡이병원균을 비롯하여 다양한 식물병원균에 대하여 항진균 활성을 나타낼 수 있음을 확인할 수 있었다.

한국생명공학연구원

KCTC10977

20060802

Claims

항진균 활성을 갖는 하기 화학식 1로 표시되는 이투린(iturin) A의 항생물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주(수탁번호: KCTC 10977BP).
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 (CH₂)₈CH(CH₃)CH₂CH_3,(CH₂)₁₀CH_3,(CH₂)₉CH(CH₃)₂또는(CH₂)₁₁CH₃ 를 나타낸다.
제 1 항에 있어서, 잿빛곰팡이 또는 흰가루병에 항균효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 바실러스 속(Bacillus sp.) BS061 균주.
삭제
제 1 항 또는 제 2 항 중에서 선택된 어느 한 항의 균주, 균주 현탁액 또는 균주의 배양 상등액을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 조성물은 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 흰가루병원균, 토마토 잎곰팡이병원균(Fulvia fulva), 고추탄저병원균( Colletotrichum gloeosporioides), 인삼 뿌리썩음병원균(Cylindrocarpon destructans), 인삼모잘록병원균(Rhizoctonia solani), 시들음병원균(Fusarium oxysporum), 사과 점무늬낙엽병원균(Alternaria mali), 인삼 점무늬병원균(Alternaria panax) 또는 인삼잘록병원균(Pythium sp.)에 대하여 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 흰가루병원균은 스페로테카 후스카(Sphaerotheca fusca) 또는 스페로데카 아파니스(Sphaerotheca aphanis)인 것을 특징으로 하는 식물병 방제용 조성물.