CN107142226B - 一种枯草芽胞杆菌atr2及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种枯草芽胞杆菌ATR2及制备方法和应用，步骤是：A、生姜根腐病拮抗菌分离与培养：称取土样加入到无菌水中，稀释后涂布于平板，随后涂布病原菌B.pumilus GR8共培养，挑选形成抑菌圈的平板，重复纯化，获得单菌落；B、生姜根腐病拮抗菌筛选：GR8涂布平板后，向牛津杯中加入无菌上清液，培养后测量各个样品的抑菌圈，获得一种抗菌活性较好的枯草芽胞杆菌ATR2。该枯草芽胞杆菌ATR2可应用于防治生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类医学病原菌假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌、多种农业植物病原真菌。从高效的防虫抗病活性、对人和动植物安全、不污染环境等方面考虑，枯草芽孢杆菌ATR2具有良好的推广应用前景。

Description

一种枯草芽胞杆菌ATR2及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物农药及生物医药技术领域，更具体涉及一种防治作用的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)，同时涉及一种防治作用的枯草芽胞杆菌的制备方法，还涉及一种防治作用的枯草芽胞杆菌在防虫抗病中的应用。该菌株的发酵液对生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类病原菌假结核耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、及多种植物病原真菌具有较强的抑制活性，该菌产生的抗菌活性物质为杆菌抗霉素D和表面活性素，此外，该菌发酵液对农业刺吸式口器害虫蚜虫和红蜘蛛等具有较强的毒杀作用，因此该菌株可以用于生产防治农业植物病虫害、人类医学病原菌的生物制剂。
背景技术
自1945年Johnson发现枯草芽胞杆菌具有防治植物病害的作用[Science 1945,102(2650):376-377]，枯草芽胞杆菌作为一种生防细菌防治植物病害成为国内外研究的热点。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种重要的植物根系促生菌，在自然界分布广泛，极易培养。枯草芽胞杆菌在生长代谢过程中可以产生多种抗菌活性物质，目前已报道的枯草芽胞杆菌产生的抗菌活性物质多达60多种，主要包括非核糖体合成途径合成[生物化学与生物物理进展2002,29(5):667-669]和核糖体合成途径合成两大类。非核糖体途径合成的抗菌活性物质包括脂肽类如表面活性素[Biochemical and biophysical researchcommunications 1968,31(3):488-494]、伊枯草菌素家族[Biotechnology and AppliedBiochemistry 1990,12(4):370-375]、芬原素家族[Archives of microbiology 1996,165(4):243-251]和罗克霉素[Applied and Environmental Microbiology 2016,81(19):6601-6609]；多肽类如杆菌肽[蚕业科学2006,32(3):392-398]和溶杆菌素[植物病理学报2003,33(2):97-103]等；磷脂类如Bacilysocin[Antimicrobial agents andchemotherapy 2002,46(2):315-320]；多烯类如Bacillaene、Difficidin和Oxydifficidin[The Journal of antibiotics 1995,48(9):997-1003]等；核糖体合成途径合成的抗菌活性物质包括细菌素如枯草菌素[Peptides 2004,25(9):1415-1424]、枯草杆菌蛋白酶[Journal of biochemistry 1985,98(3):585-603]和TasA[Journal of bacteriology1999,181(5):1664-1672]；细胞壁降解酶类如几丁质酶[植物病理学报2004,34(2):166-172]和葡聚糖酶[生命科学仪器2009,7(4):19-23]；某些活性蛋白[江苏农业学报2005,21(4):288-293]等。
作为一种重要的生防细菌，目前已发现枯草芽胞杆菌可以防治多种植物病害，如水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)[Biological Control 2009,51(1):61-65]、百合枯萎病(Fusarium oxysporum)[西北农林学报2010,19(10)：133-136]、苹果霉心病(Alternariaalternata)[植物 病理学报2000,30(1):66-70]、辣椒疫霉病(Phytophthora capsici)[中国生物防治学报2012,28(2):235-242]等。其作用机制主要包括竞争作用，竞争作用是生防微生物发挥作用的重要机制，杜立新等发现,Bacillus subtilis BS-208在番茄叶面上的分布不均匀,多定殖于叶面凹陷处、伤口和绒毛根部,且在自然土壤和灭菌土中均能成功定殖[河北农业大学学报2004,27(6):78-82]；拮抗作用，枯草芽胞杆菌可以产生脂肽类、多肽类、细菌素等多种抗菌物质抑制或杀死其他微生物；诱导植物产生抗性，李德全等研究发现Bacillus subtilis Bs-916能诱导水稻叶鞘细胞POD、PPO和SOD活性增强[植物病理学报2008,38(2):192-198]和促进植物生长，张霞等研究发现枯草芽胞杆菌B931可以产生生长素、赤霉素和细胞分裂素等植物激素促进植物生长[作物学报，2007，33(2)：236－241]。
除抗病活性，研究发现枯草芽胞杆菌在防虫等方面也具有较大的应用前景。丁国春等研究发现枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilus)AR11对南方根结线虫(Meloidogyneincognita)具有较好防治效果[南京农业大学学报2005,28(2):46-49]；刘静等研究发现枯草芽胞杆菌JA粗提液对红蜘蛛有杀虫效应[微生物学报2004,44(4):511-514]；余琼等研究发现枯草芽胞杆菌发酵液对于常见的农业害虫菜青虫具有毒杀作用[黑龙江科学2011,2(3):13-15]；刘慰等研究发现枯草芽胞杆菌HX08可以产生草酸脱羧酶，对于常见鳞翅目害虫棉铃虫具有致死作用[湖南师范大学自然科学学报2014,37(5):14-20]。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种抗生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类医学病原菌假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌、农业植物病原真菌黑曲霉、油菜灰霉及辣椒灰霉病原菌灰葡萄孢、甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌的枯草芽胞杆菌ATR2，该细菌分类命名：枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis ssp.ATR2(CCTCC NO.M 2016071)；该枯草芽胞杆菌对上述病原菌均具有拮抗作用，该菌产生的抗菌活性物质为杆菌抗霉素D(Bacillomycin D)和表面活性素(Surfactin)。
本发明的另一个目的是在于提供了一种枯草芽胞杆菌ATR2的制备方法，方法易行，成本低廉，操作简便快速，极大地减少了工作量和缩短了制备时间。
本发明的再一个目的是在于提供了一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备治疗或预防生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类医学病原菌假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌、农业植物病原真菌的生物农药及生物医药中的应用，枯草芽胞杆菌ATR2高效广谱的抑菌活性，使其可广泛应用于多种病原菌的防治中，增加了枯草芽胞杆菌产品的多样化和系列化，扩大了枯草 芽胞杆菌制剂的使用范围。
本发明的再一个目的是在于提供了一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防农业刺吸式害虫蚜虫及红蜘蛛等的生物农药中的应用，用该细菌的发酵液，可有效地杀死农作物叶茎上的蚜虫和红蜘珠。
为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ATR2是一株由本实验室从中国土壤样品中分离、并以生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌Bacillus pumilus GR8[Plant Disease,2013,97(10):1308-1315]为拮抗对象，采用琼脂扩散法中的牛津杯法(Appl MicrobiolBiotechnol,2010,86:535–543.)，经过观测抑菌圈而筛选出来的对短小芽胞杆菌GR8具有明显抑制作用的细菌菌株。取抗(Anti-)的两个字母AT、生姜根腐病(Ginger rhizome rot)的一个字母R组成其代码ATR，又因该菌株是从土样中分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为2号的一株，因此将该菌株命名为枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillus subtilis ATR2)。
一种枯草芽胞杆菌菌株ATR2的制备方法，其步骤是：
A、生姜根腐病拮抗菌分离与培养：称取土样0.1到0.2g加入到1mL的无菌水中，10倍梯度稀释后涂布于Luria-Bertani琼脂培养基后，再在平板上涂布108cfu/ml B.pumilusGR8。平板于30℃培养24h，挑选形成抑菌圈的平板，从抑菌圈内挑取目的细菌进行划线，挑取单菌落接种于Luria-Bertani培养基上培养。重复该纯化过程三次，获得纯化的单菌落，将这些分离的细菌接种在Luria-Bertani培养液中培养，28℃，180rpm，恒温振荡培养72h。收集发酵液，8000rpm，4℃离心10min；收集离心后上清液通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌上清液，4℃保存待用。该Luria-Bertani培养液(LB)的组成为：1％胰蛋白胨(重量/体积)0.5％酵母提取物(重量/体积)，1％NaCl(重量/体积)，pH 7.0。
B、生姜根腐病拮抗菌筛选：取150μl 108cfu/ml B.pumilus GR8涂布在Luria-Bertani平板(60mm)表面，在每个平板中央轻轻放置1个无菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分钟后，向每个牛津杯中加入200μl上述所制备的无菌上清液样品，然后将平板置入培养箱中，28℃，培养24h后，测量各个样品的抑菌圈直径。筛选到一株对生姜根腐病病原菌抑制效果较好的细菌菌株，取抗(Anti-)的两个字母AT、生姜根腐病(Gingerrhizome rot)的一个字母R组成其代码ATR，又因该菌株是从土样中分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为2号的一株，因此将该菌株命名为枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillussubtilis ATR2)。该Luria-Bertani培养液(LB)的组成为：1％胰蛋白胨(重量/体积)0.5％酵母提取 物(重量/体积)，1％NaCl(重量/体积)，pH 7.0。获得了一株抗生姜根腐病的枯草芽胞杆菌ATR2。
该枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillus subtilis ATR2)已于2016年2月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCCNO.M2016071。
所述的枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillus subtilis ssp.ATR2)中含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
枯草芽孢杆菌ATR2的具体特征如下：
A.形态学特征：枯草芽胞杆菌ATR2的细胞形态为杆状，产生椭圆形芽胞。
B.培养特征：枯草芽胞杆菌ATR2在Luria-Bertani琼脂平板培养基中于28℃培养72小时后，形成圆盘状菌落，菌落呈乳白色、边缘不整齐、表面粗糙。
C.生化特性：枯草芽胞杆菌ATR2的生理生化特征如表一所示。
表一枯草芽胞杆菌ATR2菌株的生理生化特征
Figure BDA0000932814770000041
Figure BDA0000932814770000051
z+、–分别代表阳性和阴性反应。
D.分子生物学鉴定：以枯草芽胞杆菌ATR2的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA的通用引物(27f:5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,1492r:5-TAC GGC TAC CTT GTT ACGACT T-3)用PCR技术按下列程序进行ATR2的16S rDNA扩增：94℃变性5分钟，然后94℃30秒,54℃1分30秒，72℃2分钟，35个循环；最后72℃延伸7分钟。PCR产物经过1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳，用DNA胶回收试剂盒进行回收，回收的PCR产物测序。得到的ATR2的16S rDNA(GeneBank:KP685408.1)列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
该SEQ ID NO.1序列经NCBI BLAST生物学软件比对分析表明，ATR2的16S rDNA与枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis NCDO1769的16S rDNA相似性最高，达98％。
综合拮抗菌ATR2的菌落形态特征、显微结构及16S rDNA序列分析结果，ATR2属于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。
E.生物活性：枯草芽胞杆菌ATR2发酵液具有高效、广谱的抗菌活性，对一些农业病原细菌和真菌以及医学病原细菌均具有较强抗菌活性。对供试的几种植物病原细菌和真菌及医学病原细菌的抗菌活性见表二。
经室内毒力生物测定，枯草芽胞杆菌ATR2发酵液对农业刺吸式害虫蚜虫和红蜘蛛有较高毒杀作用，其发酵液使用24h后对蚜虫的致死率达93.33％，发酵液10倍稀释液使用48h后对红蜘蛛的致死率达60.00％
表二ATR2发酵上清液的抗菌谱
Figure BDA0000932814770000052
Figure BDA0000932814770000061
注：a“+”表明对相应菌株有抗菌活性，“-”表示对相应菌株无抗菌活性。
F.ATR2活性物质理化性质：采用琼脂扩散法测定ATR2发酵上清液的热稳定性。在60℃和80℃分别处理发酵上清液2h后，其抑菌活性没有明显变化，100℃处理2h仍能保持较强的抑菌活性。由此可知，上清液中的抑菌活性物质具有较好的温度耐受性。
使用酸碱调节ATR2发酵上清液的pH至设定值后，室温放置2h，再调回到原pH，然后分别测定各处理上清液抑菌活性的变化。在pH 4-pH 10的范围内，发酵上清液均保持较高的抑菌活性，pH值为2时活性略有所下降，但仍具有很强的抗菌活性。由此说明，上清液中抑菌活性成分具有较宽的pH耐受性。
使用200μg/ml的蛋白酶K于58℃水浴中处理ATR2的发酵上清液2h后，其抑菌活性没有显著变化，说明上清液中的抑菌活性成分对蛋白酶K不敏感。使用20mg/ml的胰蛋白酶，37℃水浴处理上清液2h后，其抑菌活性没有显著变化，说明上清液中的抑菌活性成分对胰蛋白酶不敏感。由此说明，上清液中抑菌活性成分对常见的蛋白酶不敏感。
G.ATR2活性物质纯化及鉴定：ATR2抗菌活性物质的纯化首先通过酸沉淀法进行初步纯化并对活性物质进行浓缩，通过薄层层析法进行进一步纯化，最后通过高效液相色谱进行 活性物质的分离。收集的活性峰，进一步通过LC-MS对抗菌活性物质进行鉴定。LC-MS结果表明，抗菌活性物质为一组分子量为1031，1045，1059，1073等相差一个亚甲基的同系物，通过二级质谱对其组成成分进行进一步分析，最终确定抗菌活性物质的组成，该抗菌活性物质为Bacillomycin D，属于脂肽类伊枯草菌素家族。
ATR2活性物质杆菌抗霉素D不仅对革兰氏阳性细菌如短小芽胞杆菌等具有拮抗作用，而且对革兰氏阴性细菌，如假结核耶尔森氏菌等也具有较强拮抗作用。
除了杆菌抗霉素，枯草芽胞杆菌ATR2还可以产生一组分子量为1008，1022，1036等相差一个亚甲基的同系物，通过二级质谱对其组成成分进行进一步分析，最终确定该物质的组成，该物质为Surfactin，属于脂肽类表面活性素家族。
H.ATR2发酵特性：菌株ATR2易于培养，发酵性能优良，通过摇瓶发酵选择最佳发酵配方，优化发酵条件，采用不同的含固量和不同的C/N比进行正交试验，获得菌株ATR2的最佳培养基配方：1.5％玉米淀粉(重量/体积)，1.5％豆饼粉(重量/体积)，0.4％酵母浸粉(重量/体积)，0.5％蛋白胨(重量/体积)，0.5％葡萄糖(重量/体积)，0.2％K2HPO4(重量/体积)，0.04％MgSO4，pH 7.5。
一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备治疗或预防生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类医学病原菌假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌、农业植物病原真菌的生物农药及生物医药中的应用，其应用过程如下：
A：枯草芽孢杆菌ATR2抗病原细菌的应用过程：
接种待测的病原细菌短小芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌于Luria-Bertani培养液中培养，28℃，180rpm，12h，用无菌水将菌浓度稀释到0.5麦氏浊度。分别取4ml上述浓度菌液与已溶化并冷却至50℃左右的100ml的琼脂培养基混合，摇匀后，将25ml该混合培养基加到无菌培养皿中，待琼脂凝固后，用无菌打孔器(内径10mm)打孔，每平板3孔，两孔加入200μl的无菌上清液样品，另一孔加无菌水作对照，然后将平板置入培养箱中，28℃，培养24h后，观测抑菌效果。该试验重复3次，每次设3个重复。
以上所述的病原细菌为生姜根腐病原菌短小芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌。
B.枯草芽孢杆菌ATR2抗农业病原真菌的应用过程：
接种待测的病原真菌于PDA平板培养，28℃，48h，用无菌打孔器打取10mm菌饼，将上述菌饼接种于另一PDA平板中央，在距离病原菌中心左右两侧2cm处，分别用无菌打孔器(内径10mm)打孔，一孔加入200μl的无菌上清液样品，另一孔加无菌水作对照。然 后将平板置入培养箱中，28℃，培养至对照侧真菌长满平皿时，观测抑菌效果。该试验重复3次，每次设3个重复。
所述的病原真菌为黑曲霉、油菜灰霉及辣椒灰霉病原菌灰葡萄孢、甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。
一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防农业刺吸式口器害虫蚜虫及红蜘蛛等的生物农药中的应用，其应用过程如下：
以虫害严重的菜叶上的蚜虫或红蜘蛛作为试虫，选取生长一致的植物叶片制成约6cm的叶段。先用毛笔挑取生理状态一致的试虫30头于叶段上，叶段置于一平皿中，室温放置3-5小时，待试虫自然聚集于叶段上后，将该平皿置于小型喷雾器下进行喷雾，喷液量为2ml，药液沉降1min后取出叶段，转移至另一置有一张湿润滤纸的塑料平皿中(平皿的上层盖子制数个通气小孔)，铺上两层卫生纸，盖上平皿的上层盖子。每处理设3个重复，并设不含药液(PH7.4的PBS缓冲液)的处理作空白对照。将处理的试虫置于温度为(25±1)℃、光周期L：D＝(16：8)h条件下饲养和观察。处理后48h检查试虫死亡情况，分别记录总虫数和死虫数。根据实验数据，计算处理的校正死亡率。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
枯草芽胞杆菌ATR2具有高效、广谱的抗菌活性，对生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类病原菌假结核耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌、及多种植物病原真菌具有较强的抑制活性，其可产生多种抗菌活性物质如杆菌抗霉素D(Bacillomycin D)和表面活性素(Surfactin)等，且抗菌活性物质具有较好的酸碱及温度耐受性，同时，该菌发酵液对农业刺吸式口器害虫蚜虫和红蜘蛛等具有较强的毒杀作用，其发酵液使用24h后对蚜虫的致死率达93.33％，发酵液10倍稀释液使用48h后对红蜘蛛的致死率达60.00％.。因此利用该菌株生产防治农业植物病虫害、及人类医学病原菌的生物制剂，能够增加枯草芽胞杆菌产品的多样化和系列化，扩大枯草芽胞杆菌制剂的使用范围；作为一种植物根际促生菌，枯草芽胞杆菌不仅可以防虫抗病，还可以促进植物生长；目前已有多种枯草芽胞投入市场并得到广泛使用，其生产和使用成本低、对人、畜及动植物无害，不污染环境，减少了化学农药对环境的污染。因而，从高效的防虫抗病活性、对人和动植物安全、不污染环境、生产和使用成本低及市场需求等方面考虑，枯草芽孢杆菌ATR2具有良好的推广应用前景。
具体实施方式
实施例1：
一种抗生姜根腐病的枯草芽胞杆菌的制备方法，其步骤如下：
A、生姜根腐病拮抗菌分离与培养：称取土样0.1到0.2g加入到1mL的无菌水中，10倍梯度稀释后涂布于Luria-Bertani琼脂培养基后，再在平板上涂布108cfu/ml B.pumilusGR8。平板于30℃培养24h，挑选形成抑菌圈的平板，从抑菌圈内挑取目的细菌进行划线，挑取单菌落接种于Luria-Bertani培养基上培养。重复该纯化过程三次，获得纯化的单菌落，将这些分离的细菌接种在Luria-Bertani培养液中培养，28℃，180rpm，恒温振荡培养72h。收集发酵液，8000rpm，4℃离心10min；收集离心后上清液通过0.22μm滤膜过滤除菌，得到无菌上清液，4℃保存待用。该Luria-Bertani培养液(LB)的组成为：1％胰蛋白胨(重量/体积)0.5％酵母提取物(重量/体积)，1％NaCl(重量/体积)，pH 7.0。
B、生姜根腐病拮抗菌筛选：取150μl 108cfu/ml B.pumilus GR8涂布在Luria-Bertani平板(60mm)表面，在每个平板中央轻轻放置1个无菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分钟后，向每个牛津杯中加入200μl上述所制备的无菌上清液样品，然后将平板置入培养箱中，28℃，培养24h后，测量各个样品的抑菌圈直径。筛选到一株对生姜根腐病病原菌抑制效果较好的细菌菌株，取抗(Anti-)的两个字母AT、生姜根腐病(Gingerrhizome rot)的一个字母R组成其代码ATR，又因该菌株是从土样中分离的多株芽孢杆菌中筛选出来的、且编号为2号的一株，因此将该菌株命名为枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillussubtilis ATR2)。该Luria-Bertani培养液(LB)的组成为：1％胰蛋白胨(重量/体积)0.5％酵母提取物(重量/体积)，1％NaCl(重量/体积)，pH 7.0。获得了一株抗生姜根腐病的枯草芽胞杆菌ATR2。
该枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillus subtilis ssp.ATR2)已于2016年2月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，湖北省武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCCNO.M2016071。所述的枯草芽胞杆菌ATR2(Bacillus subtilis ssp.ATR2)中含有SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
实施例2：
一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防农业刺吸式口器害虫蚜虫及红蜘蛛等的生物农药中的应用，其具体步骤如下：
以虫害严重的菜叶上的蚜虫或红蜘蛛作为试虫，选取生长一致的植物叶片制成约6cm的叶段。先用毛笔挑取生理状态一致的试虫30头于叶段上，叶段置于一平皿中，室温放置3-5小时，待试虫自然聚集于叶段上后，将该平皿置于小型喷雾器下进行喷雾，喷液量为2ml，药液沉降1min后取出叶段，转移至另一置有一张湿润滤纸的塑料平皿中(平皿的上层盖子制数个通气小孔)，铺上两层卫生纸，盖上平皿的上层盖子。每处理设3个重复，并设不含 药液(PH7.4的PBS缓冲液)的处理作空白对照。将处理的试虫置于温度为(25±1)℃、光周期L：D＝(16：8)h条件下饲养和观察。处理后48h检查试虫死亡情况，分别记录总虫数和死虫数。根据实验数据，计算处理的校正死亡率。
所述的农业刺吸式口器害虫具体为蚜虫、红蜘蛛。
实施例3：
一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备治疗或预防生姜根腐病病原菌短小芽胞杆菌、人类医学病原菌(假结核耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌)、农业植物病原真菌(黑曲霉、油菜灰霉及辣椒灰霉病原菌灰葡萄孢、甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌)的生物农药及生物医药中的应用，其应用过程如下：
A：枯草芽孢杆菌ATR2抗病原细菌的应用过程：
接种待测的病原细菌短小芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌于Luria-Bertani培养液中培养，28℃，180rpm，12h，用无菌水将菌浓度稀释到0.5麦氏浊度。分别取4ml上述浓度菌液与已溶化并冷却至50℃左右的100ml的琼脂培养基混合，摇匀后，将25ml该混合培养基加到无菌培养皿中，待琼脂凝固后，用无菌打孔器(内径10mm)打孔，每平板3孔，两孔加入200μl的无菌上清液样品，另一孔加无菌水作对照，然后将平板置入培养箱中，28℃，培养24h后，观测抑菌效果。该试验重复3次，每次设3个重复。
所述的病原细菌为生姜根腐病病原菌短小芽孢杆菌、假结核耶尔森氏菌、炭疽芽胞杆菌。
B：枯草芽孢杆菌抗病原真菌的应用过程：
接种待测的病原真菌于PDA平板培养，28℃，48h，用无菌打孔器打取10mm菌饼，将上述菌饼接种于另一PDA平板中央，在距离病原菌中心左右两侧2cm处，分别用无菌打孔器(内径10mm)打孔，一孔加入200μl的无菌上清液样品，另一孔加无菌水作对照。然后将平板置入培养箱中，28℃，培养至对照侧真菌长满平皿时，观测抑菌效果。该试验重复3次，每次设3个重复。
所述的病原真菌为黑曲霉、油菜灰霉及辣椒灰霉病原菌灰葡萄孢、甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种枯草芽胞杆菌ATR2及制备方法和应用
<130> 一种枯草芽胞杆菌ATR2及制备方法和应用
<160> 1
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1455
<212> DNA
<213> 枯草芽胞杆菌
<400> 1
cgggttggcg ggtgctatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg 60
ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg 120
ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg 180
cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct 240
caccaaggca acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac 300
acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg 360
acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga 420
agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc 480
taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg 540
gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg 600
gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta 660
gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt 720
aactgacgct gagggagcga aagcgtgggg gagcgaacac gattacatac gctgtgtagt 780
ccacgccgta aacgatgagt gctaagtgtt agggggtttc cgccccttag tgctgcagct 840
aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac ggtcgcaaga ctgaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gttaattcga agcaacgcga agaaccttac 960
caggtcttga catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga 1020
caggtggtgc atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080
agcgcaaccc ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt 1140
gacaaaccgg aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta 1200
cacacgtgct acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca 1260
caaatctgtt ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct 1320
agtaatcgcg gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg 1380
tcacaccacg agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg 1440
ccgaagtgac agagg 1455

Claims (7)

1.一种枯草芽胞杆菌ATR2，其特征在于：枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis ATR2 的保藏编号为CCTCC NO： M 2016071。
2.根据权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2，其特征在于：所述的枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis ATR2中含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防农业刺吸式害虫蚜虫的生物农药中的应用。
4.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防红蜘蛛的生物农药中的应用。
5.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防生姜根腐病病原细菌短小芽胞杆菌的生物农药中的应用。
6.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备治疗或预防人类医学病原菌假结核耶尔森氏菌及炭疽芽胞杆菌的生物医药中的应用。
7.权利要求1所述的一种枯草芽胞杆菌ATR2在制备防治或预防农业病原真菌的生物农药中的应用；所述的病原真菌为黑曲霉、油菜灰霉及辣椒灰霉病原菌灰葡萄孢、甘蔗凤梨病病原菌奇异长喙壳、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢镰刀菌。
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