CN1590535A

CN1590535A - 枯草芽孢杆菌株、制备方法,制剂、制备方法及用途

Info

Publication number: CN1590535A
Application number: CN 200410014484
Authority: CN
Inventors: 刘静; 王军; 余增亮
Original assignee: Institute of Plasma Physics of CAS
Current assignee: Institute of Plasma Physics of CAS
Priority date: 2004-03-27
Filing date: 2004-03-27
Publication date: 2005-03-09

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌株、制备方法，制剂、制备方法及用途，从土壤中分离对小麦赤霉病菌具有强烈抑制作用的枯草芽孢杆菌JA，通过不同剂量N⁺注入诱变，从突变株中获得一株对抗菌活性有极大提高的枯草芽孢杆菌株，于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为1107。对突变菌株进行微生物发酵，获得的发酵液进行超滤浓缩，发酵液能够抑制水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌等多种植物病原真菌并且对烟草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病细菌有明显的防治作用，另外对有害的红蜘蛛有杀灭作用。

Description

枯草芽孢杆菌株、制备方法，制剂、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种微生物的菌株，更具体的说是属于一种枯草芽孢杆菌的菌株。

背景技术

为了对付病虫害，每年全世界要生产农药200多万吨，其中主要是化学农药。但是长期使用某些化学农药，病虫、害虫容易产生抗药性；而且一些化学农药品种已被证实有致癌、致畸和致突变的毒性；同时农药残留是制约农产品生产的隐患。生物农药的最大优点就是对人畜安全，无毒害，不污染环境，也不易产生抗性，日益成为发展绿色农业的唯一选择。微生物农药是公认的“无公害农药”，防治对象不易产生抗药性，不伤害天敌；繁殖快，是综合防治农林病虫害的重要手段。随着全球农药公害问题的日趋严重，微生物农药的研究已经倍受重视。枯草芽孢杆菌能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质，抗菌物质包括大分子量的抗菌蛋白和低分子量的抗菌肽，同时它又是自然界广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，不污染环境，因而在生物防治植物病害中起着重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种枯草芽孢杆菌株及该菌株的制备方法；利用该菌株的发酵液可以制成枯草芽孢杆菌株制剂，能够抑制多种植物病原真菌和细菌生长并对红蜘蛛有杀灭作用；发酵液的活体和离体生测实验均表明其强烈的抑菌活性，是一种较好的生物农药；也可用于人类疾病的治疗。

本发明的技术方案为：

一株枯草芽孢杆菌株(Bacillus subtilis)，菌种保藏编号为1107。

一种枯草芽孢杆菌株的制备方法，是将从土壤中分离得到的菌枯草芽孢杆菌JA经20keV，2.6×10¹⁵～3.9×10¹⁵ions/cm²，不同剂量的N⁺注入诱变处理筛选到高产高抗菌活性菌株JA026。

该菌株与原始出发菌株相比，抗菌活性增强，相对效价提高10.4％；发酵条件有所改变如生长周期缩短6～8hr、需氧量降低等。

所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征是采用N⁺脉冲式辐照处理，样品置于水冷的无菌靶台上，将枯草芽孢杆菌株JA制成菌悬液，取0.1mL菌悬液铺于Φ90mm的空白平皿中，于超净台中风干制成菌膜备用；用不同剂量N⁺的辐照处理后将菌膜用1mL无菌水洗脱涂布于PDA固体培养基上培养24hr后挑单菌落；将经过离子束注入处理的，从培养24h的斜面挑一环细胞接种于种子培养基中培养后再接种于发酵培养基，培养后，测效价，筛选高产菌株。

所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征是种子培养基中培养的最佳种龄12hr，再按接种量1∶10接种于发酵培养基，发酵液的pH值为7.2，发酵罐转速为333r/min，温度为30℃，发酵时间为48hr。

所述的枯草芽孢杆菌株制剂，是菌枯草芽孢杆菌发酵后的混合液，并经过超滤后的产物。

所述的枯草芽孢杆菌株制剂，其特征是菌枯草芽孢杆菌发酵后的混合液，并经过截留分子量为1000D超滤膜的超滤物，并经5000～7000r/min离心取上清液得到的浓缩液。

所述的枯草芽孢杆菌株制剂的制备方法，是将高产菌枯草芽孢杆菌株进行发酵，发酵工艺包括：对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株斜面活化；种瓶培养；发酵罐发酵培养；发酵液高速离心除菌体并进行热处理。

所述的枯草芽孢杆菌株制剂的制备方法，其特征是斜面培养基为PDA培养基，种子培养基：鱼蛋白胨2％，甘油1％，K₂HPO₄ 0.15％，MgSO₄ 0.15％，pH7.2，最佳种龄时间为12hr；发酵培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K₂HPO₄0.15％，MgSO₄ 0.15％，最适pH值6.7～7.5，最适发酵周期为40hr～48hr，最适温度28℃～30℃，离心转速为8000r/min，热处理温度为108℃，10min。

所述的枯草芽孢杆菌株制剂的用途，是用于水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌等多种植物病原真菌的防治；对红蜘蛛的防治；对烟草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病细菌的防治；用于胃、肝、肺、大肠、肾、皮肤、食道等肿瘤的治疗。用于病毒性疾病抗病毒的治疗。

同时可用于治疗人畜的由真菌引发的皮肤病(如脚气等)，其中对红色毛癣菌、须毛癣菌作用明显；还可用作家畜的饲料添加剂，以预防黑曲霉、黄曲霉等真菌导致的饲料霉变；另外对正常哺乳动物细胞无不良影响，但对癌细胞株，部分病毒则有明显杀伤作用。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒方面具有良好的应用前景。

本发明从土壤中筛选并分离出对小麦赤霉病菌有强类抑制作用的枯草芽孢杆菌JA作为原始菌株。

原始菌株的离子注入实验于低能离子束细胞修饰技术和装置上进行，采用N⁺脉冲式辐照处理，该装置的专利号为93103361.6。

本发明对于制备的发酵液进行了生测试验与稳定性试验。

枯草芽孢杆菌株发酵液的离体生测试验用管碟法测定发酵液对不同检测菌的抑菌活性：牛津杯内加入粗提液200L，以抑菌圈直径表示抑菌活性的大小；活体生测试验在一叶期黄瓜幼苗上喷洒发酵液，待发酵液干后将黄瓜灰霉病菌(B.cinerea)和菌核病菌(S.sclerotiorum)的菌丝块(厚0.1cm，直径为0.4cm)直接贴在黄瓜叶面中央，处理后的试材置于21℃恒温保湿箱中培养发病，5d后考察各处理的防治效果。该试验由上海生物农药所协助测定。离体生测结果表明发酵液对水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌，根霉病菌和辣椒炭疽病菌等多种植物病原真菌及烟草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病细菌有明显的防治作用；活体生测实验中发酵液均有抑制黄瓜灰霉病菌和菌核病菌的作用，同时对红蜘蛛有杀灭作用。

枯草芽孢杆菌株发酵液的浓缩制备和稳定性试验：发酵液离心除菌体和热处理后，经1000D滤膜超滤浓缩。热稳定性试验：将粗提液分别经108℃、115℃和121℃高压灭菌处理，以经孔径为0.22m的微孔滤膜过滤的样品作为对照，用管碟法测抑菌活性，对照的抑菌活性定为100％，结果表明粗提液经108℃、115℃和121℃分别处理10min，其抑菌活性均没有降低，即使121℃处理60min后抑菌活性也仅下降20％，说明热稳定性较好；pH稳定性试验：通过直接调节粗提液的pH值考察环境酸碱度对抗菌物抑菌活性的影响，以未经酸碱调节的粗提液(pH为7.0)作为对照，其抑菌活性定为100％，试验表明抗菌物的最适pH范围是6.0～7.5；蛋白酶稳定性：37℃水溶条件下，用反应浓度均为1mg/mL的蛋白酶K和胰蛋白酶处理粗提液不同时间，测酶处理液的抑菌活性，以不加酶处理的为对照，抑菌活性定为100％，结果粗提液用两种蛋白酶处理不同时间后，抑菌活性降低不明显，说明粗提液对蛋白酶K、胰蛋白酶具有一定的耐受性。

本发明的产生菌的发酵工艺稳定简单，对环境无污染。

本发明的枯草芽孢杆菌株的抗菌活性、物质热稳定性好，对酸碱和蛋白酶有一定的耐受性，在生物防治领域有很好的应用前景。

具体实施方式

1、从土壤中筛选并分离出对小麦赤霉病菌有强类抑制作用的枯草芽孢杆菌JA作为原始菌株。

2、始菌株的离子注入实验于低能离子束细胞修饰技术和装置上进行，该装置的专利号为93103361.6。采用N⁺脉冲式辐照处理，经20keV，2.6×10¹⁵～3.9×10¹⁵ions/cm²，不同剂量的N⁺注入，其过程是：样品置于水冷的无菌靶台上，将JA制成菌悬液，取0.1mL菌悬液铺于Φ90mm的空白平皿中，于超净台中风干制成菌膜备用；用不同剂量N⁺的辐照处理后，将菌膜用1mL无菌水洗脱于固体培养基中培养24hr后挑单菌落；将经过离子束注入处理的，从培养24h的斜面挑一环细胞接种于种子培养基中培养12hr后按接种量1∶10接种于发酵培养基，发酵液的pH值为7.2，发酵罐转速为333r/min，温度为30℃，培养48hr后，管碟法测效价，筛选高产菌株，得到本发明的枯草芽孢杆菌株JA026，现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏编号为1107。

3、枯草芽孢杆菌株制剂的制备。是将本发明的高产菌枯草芽孢杆菌株(菌种保藏编号为1107)进行发酵，发酵工艺包括：对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株斜面活化；种瓶培养；发酵罐发酵培养；发酵液高速离心除菌体并进行热处理。斜面培养基为PDA培养基，种子培养基：鱼蛋白胨2％，甘油1％，K₂HPO₄ 0.15％，MgSO₄ 0.15％，pH7.2，最佳种龄时间为12小时；发酵培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K₂HPO₄0.15％，MgSO₄ 0.15％，最适pH值6.7～7.5，最适发酵周期为40hr～48hr，最适温度28℃～30℃，离心转速为8000r/min，热处理温度为108℃，10min，得到发酵液。

上述得到的菌枯草芽孢杆菌发酵合液，并经过截留分子量为1000D超滤膜的超滤物，并经5000～7000r/min离心取上清液得到的浓缩液，即可以作为生物农药农药制剂。

对多种农作物的病原菌有明显的抑制作用，如小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、黄瓜菌核、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄青枯病菌、烟草青枯病菌等，此外对红蜘蛛有杀灭作用。

Claims

1、一株枯草芽孢杆菌株(Bacillus subtilis)，菌种保藏编号为1107。

2、一种枯草芽孢杆菌株的制备方法，是将从土壤中分离得到的菌枯草芽孢杆菌JA经20keV，2.6×10¹⁵～3.9×10¹⁵ions/cm²，不同剂量的N⁺注入诱变处理筛选到高产高抗菌活性菌株JA026。

3、如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征是采用N⁺脉冲式辐照处理，样品置于水冷的无菌靶台上，将枯草芽孢杆菌株JA制成菌悬液，取0.1mL菌悬液铺于Φ90mm的空白平皿中，于超净台中风干制成菌膜备用；用不同剂量N⁺的辐照处理后将菌膜用1mL无菌水洗脱涂布于PDA固体培养基上培养24hr后挑单菌落；将经过离子束注入处理的，从培养24h的斜面挑一环细胞接种于种子培养基中培养后再接种于发酵培养基，培养后，测效价，筛选高产菌株。

4、如权利要求3所述的枯草芽孢杆菌株的制备方法，其特征是种子培养基中培养的最佳种龄12hr，再按接种量1∶10接种于发酵培养基，发酵液的pH值为7.2，发酵罐转速为333r/min，温度为30℃，发酵时间为48hr。

5、如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌株制剂，是菌枯草芽孢杆菌发酵后的混合液，并经过超滤后的产物。

6、如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌株制剂，其特征是菌枯草芽孢杆菌发酵后的混合液，并经过截留分子量为1000D超滤膜的超滤物，并经5000～7000r/min离心取上清液得到的浓缩液。

7、如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌株制剂的制备方法，是将高产菌枯草芽孢杆菌株进行发酵，发酵工艺包括：对斜面保存的枯草芽孢杆菌的高产菌株斜面活化；种瓶培养；发酵罐发酵培养；发酵液高速离心除菌体并进行热处理。

8、如权利要求7所述的枯草芽孢杆菌株制剂的制备方法，其特征是斜面培养基为PDA培养基，种子培养基：鱼蛋白胨2％，甘油1％，K₂HPO₄ 0.15％，M_gSO₄ 0.15％，pH7.2，最佳种龄时间为12hr；发酵培养基：葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K₂HPO₄ 0.15％，M_gSO₄ 0.15％，最适pH值6.7～7.5，最适发酵周期为40hr～48hr，最适温度28℃～30℃，离心转速为8000r/min，热处理温度为108℃，10min。

9、如权利要求5所述的枯草芽孢杆菌株制剂的用途，是用于水稻纹枯病菌、小麦赤霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜灰霉病菌等多种植物病原真菌的防治；对红蜘蛛的防治；对烟草青枯病菌和番茄青枯病菌等植物致病细菌的防治；用于胃、肝、肺、大肠、肾、皮肤、食道等肿瘤的治疗，用于病毒性疾病抗病毒的治疗。