CN101928678B - 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 - Google Patents
一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101928678B CN101928678B CN2009101482509A CN200910148250A CN101928678B CN 101928678 B CN101928678 B CN 101928678B CN 2009101482509 A CN2009101482509 A CN 2009101482509A CN 200910148250 A CN200910148250 A CN 200910148250A CN 101928678 B CN101928678 B CN 101928678B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bacillus subtilis
- bacillus
- subtilis
- substratum
- microbiobacterial agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 241000723920 Bacillus subtilis B2 Species 0.000 title abstract description 140
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 70
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 58
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims abstract description 54
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims abstract description 54
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 52
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 claims abstract description 50
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims abstract description 25
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 claims abstract description 18
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 claims abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 claims abstract description 14
- 241001558929 Sclerotium <basidiomycota> Species 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 33
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 25
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 23
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 12
- 241001290235 Ceratobasidium cereale Species 0.000 claims description 10
- 241001149475 Gaeumannomyces graminis Species 0.000 claims description 10
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 claims description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 10
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 10
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 9
- 235000002566 Capsicum Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000008574 Capsicum frutescens Species 0.000 claims description 7
- 241000813090 Rhizoctonia solani Species 0.000 claims description 7
- 239000001390 capsicum minimum Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 claims 3
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 claims 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 abstract description 57
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 abstract description 22
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 21
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 18
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 3
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 abstract 2
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 abstract 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 abstract 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 40
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 35
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 17
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 16
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 13
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 11
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 10
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 10
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 9
- 239000003570 air Substances 0.000 description 9
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 9
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 4
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 241000726221 Gemma Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 3
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 3
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000003899 bactericide agent Substances 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N L-arabinopyranose Chemical compound O[C@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-HWQSCIPKSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100257445 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) spb-4 gene Proteins 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940097012 bacillus thuringiensis Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000443 biocontrol Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 150000002475 indoles Chemical class 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004630 mental health Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用,其中,该微生物菌剂是枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵得到,活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml;该复合微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌B2,以及芽孢杆菌sp B3、芽孢杆菌sp B4、芽孢杆菌sp B5和芽孢杆菌sp B6中的至少一种菌株;总活菌数为1.33×109-4.06×1010cfu/ml;该微生物菌剂和该复合微生物菌剂可以抑制茄子菌核菌和番茄灰霉菌等病原菌。本发明所述菌剂及应用,可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差等缺陷,以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
Description
技术领域
本发明首次发现了一株枯草芽孢杆菌菌株,该菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2,该菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1747。
本发明涉及微生物农药领域,具体地,涉及一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂的制备方法及应用。
背景技术
为了保护生态环境,1992年“世界环境和发展大会”提出应在全球范围内控制并逐步减少化学农药的使用量,增加生物农药的使用量。我国政府也十分重视这项工作,将“绿色食品和生物农药的发展”引入21世纪议程。
众所周知,化学农药在作物、空气、水和土壤中有残留,加之害虫对化学杀虫剂逐渐产生抗性,容易引起化学农药对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物有毒害。在我国,农产品农药残留超标问题,严重影响着工农业生产、生态环境、对外贸易以及人类的身心健康。例如,蔬菜农药残留量超标,则面临“绿色贸易壁垒”,在WTO的大环境下无法进入国际市场。
随着人们生活水平的提高和环保意识的增强,在国际或国内市场,对蔬菜产品实行准入制,要进入市场的蔬菜必须是无公害蔬菜,这就要求人们对农药品种和性能进行调整,向无公害农药方向发展,开发并利用生物农药。
生物农药可以通过直接或间接的作用方式来防治害虫、病害和杂草,生物农药对病虫害防治效果好,对人畜无毒,不污染环境,无残留;对病虫害的杀伤特异性强,不伤害天敌及有益生物,能保持生态平衡;生产原料和有效成分为天然产物易降解,可回归大自然,保证可持续发展。为了更好地发挥生物农药的环保性,可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造,不断提高性能和质量;多种因素和成分发挥作用,害虫和病原菌难以产生抗药性。
微生物农药是公认的“无公害农药”,其防治对象不易产生抗药性,不伤害天敌;繁殖快,能利用农副产品甚至工业废水广泛生产,是综合防治农林病虫害的重要手段。随着环境保护法的贯彻执行,以及加入WTO参与国际市场竞争,微生物农药将作为一种高新技术,在保护环境、保证人类健康,在农业可持续发展中,发挥愈来愈重要的作用。
目前,国内外虽然对微生物农药都投入了巨大的人力及物力,但数量而言化学农药远远多于生物农药;另外,生物农药对环境的要求较高。
可见,开发符合当地环境条件的微生物农药尤为重要,促进当地绿色农业的发展、参与国际农产品市场的竟争、保护环境和保证人类健康就显得尤为重要。
综上所述,在实现本发明的过程中,发明人发现现有技术中的化学农药至少存在如下问题:
(1)环保性差:化学农药在作物、空气、水和土壤中均有残留,破坏生态环境;
(2)易产生抗药性:随着化学农药施用量的增加,化学农药容易对化学杀虫剂逐渐产生抗性;
(3)安全性差:化学农药易残留、且易产生抗逆性,容易引起对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物有毒害。
发明内容
本发明的第一目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷,提供一株枯草芽孢杆菌菌株,以利用所述枯草芽孢杆菌菌株的广谱杀菌活性和促生能力,制备环保性好、不易产生抗药性和安全性好的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂。
为实现上述第一目的,本发明发现了一株枯草芽孢杆菌菌株,所述菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2,所述菌株已于2006年6月29日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.1747。
本发明的第二目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷,提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,以实现微生物农药环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
为实现上述第二目的,本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,所述菌剂是枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵得到的发酵液,所述发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml。
以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,在所述牛肉胨培养基中,包括葡萄糖10-20g、牛肉胨6-l0g和酵母膏3.5-6.5g,并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml;所述牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。
以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵时,使用菜籽油作为消泡剂。这里,菜籽油作消泡剂使用,用于消除发酵过程中产生的泡沫。
以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,所述菜籽油在所述牛肉胨培养基中的重量百分比含量为0.8-1.2%。
以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵的条件包括:接种量5-10%、发酵温度25-28℃、发酵时间36-44h、通气量800-1000L/h和转速200-300r/min,所述发酵液的pH值为7.5-8.0。
本发明的第三目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷,提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
为实现上述第三目的,本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂,所述菌剂的活性成份包括枯草芽孢杆菌B2,以及芽孢杆菌sp B3、芽孢杆菌sp B4、芽孢杆菌sp B5和芽孢杆菌sp B6中的至少一种;其中,总活菌数为1.33×109-4.06×1010cfu/ml。
以上所述的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂,所述活性成份的接种量包括:所述枯草芽孢杆菌B2:≥50%;所述芽孢杆菌sp B3、所述芽孢杆菌sp B4、所述芽孢杆菌sp B5和所述芽孢杆菌sp B6中任一种:≤50%。
本发明的第四目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷,以及微生物农药单一有效成份使用效果较低的局限,提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用,以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
为实现上述第四目的,本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用,基于权利要求2或权利要求7所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂,所述应用包括对以下病原菌的抑制:茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌。
在上述枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用中,经试验验证,枯草芽孢杆菌B2对6属20种植物病原真菌具有较好的抑制作用,其中,对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等5种病原菌的抑菌效果最佳,抑菌率可以达到93-99%;对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等6种病原菌的抑菌效果次之,抑菌率至少可以达到70%。
下面通过试验一至试验三,分别对本发明的枯草芽孢杆菌B2在形态、
16S rDNA基因序列和生理生化方面进行鉴定。
试验一:对枯草芽孢杆菌B2的形态进行鉴定。
将枯草芽孢杆菌B2接种于牛肉胨培养基上,培养48小时后的培养性状为:枯草芽孢杆菌B2产生芽孢,芽孢大多数为中生、少数为近端生,孢子囊膨大明显;牛肉胨培养基斜面上菌苔呈念珠状、表面不平整、乳白色、膜质,不透明、表面暗色。
经革兰氏染色,枯草芽孢杆菌B2的形态为:革兰氏阳性,杆状、两端钝园,少数呈不同程度链状排列;并且,大小为(0.796-1.750)um×(1.490-4.730)um。
试验二:对枯草芽孢杆菌B2的16S rDNA基因序列进行鉴定。
将枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis B2的16S rDNA基因序列在Genebank中与芽孢杆菌16S rDNA基因序列的同源性进行比较。比较结果表明,枯草芽孢杆菌B2与AF411118芽孢杆菌(即Bacillus)sp.的同源性可以达到99%以上。
由试验二可知,枯草芽孢杆菌B2与AF411118 Bacillus sp.的同源性可以证明枯草芽孢杆菌B2的确属于芽孢杆菌属Bacillus。
试验三:对枯草芽孢杆菌B2的生理生化性能进行鉴定。
将枯草芽孢杆菌B2与以下枯草芽孢杆菌标准菌株在相同条件下进行生理生化性能检测,具体检测结果参加表一。这里,枯草芽孢杆菌标准菌株购自中国科学院微生物研究所菌株保藏中心,可以包括:枯草芽孢杆菌B.subtilis、腊状芽孢杆菌B.cereus和苏云金芽孢杆菌B.thuringionsis。
表一:对Bacillus subtilis B2的生理生化性能检测结果
特征 | Bacillus subtilis B2 | B.subtilis | B.cereus | B.thuringionsis |
细胞直径>1.0 | + | + | - | - |
芽孢圆形 | - | - | - | - |
孢囊膨大 | + | - | - | - |
伴孢晶体 | ND | - | - | ND |
接触酶 | + | + | + | + |
厌氧生长 | - | - | + | + |
V-P测定 | + | + | + | + |
V-P培养物终pH<6 | + | + | + | + |
V-P培养物终pH>7 | - | - | - | - |
产酸:D-葡萄糖 | + | + | + | + |
产酸:L-阿拉伯糖 | + | + | - | - |
产酸:D-木糖 | - | -/+ | - | - |
产酸:D-甘露醇 | + | + | - | + |
葡萄糖产气 | - | - | - | - |
水解:酪朊 | + | + | + | + |
水解:明胶 | + | + | + | + |
水解:淀粉 | + | + | - | + |
利用:柠檬酸盐 | + | + | + | + |
利用:丙酸盐 | - | - | - | - |
酪氨酸水解 | - | - | + | - |
苯丙氨酸脱氨酶 | - | - | - | - |
卵黄卵磷脂酶 | -/+ | - | + | + |
硝酸盐还原到亚硝酸盐 | + | + | + | + |
形成:吲哚 | - | - | + | + |
需要NaCl和KCl | - | - | - | - |
生长pH 6.8营养肉汤 | + | + | + | + |
生长pH 5.7营养肉汤 | + | + | + | + |
在NaCl上生长:2% | + | ND | + | + |
在NaCl上生长:5% | + | ND | + | + |
在NaCl上生长:7% | + | ND | + | + |
在NaCl上生长:10% | + | ND | + | + |
生长温度:5℃ | - | - | - | - |
生长温度:10℃ | + | d | d | d |
生长温度:30℃ | + | + | + | + |
生长温度:40℃ | + | d | + | + |
生长温度:50℃ | - | - | - | - |
生长温度:55℃ | - | - | - | - |
生长温度:65℃ | - | - | - | - |
在表一中,“+”表示阳性,“-”表示阴性,“-/+”表示介于阴性与阳性之间;“ND”表示未测定;“d”表示11-89%的菌株为阳性。
综上所述,在试验二中,通过16S rDNA基因序列结果,对枯草芽孢杆菌B2与AF411118 Bacillus sp.的同源性进行分析,该同源性分析结果可以说明枯草芽孢杆菌B2属于芽孢杆菌属Bacillus;在试验三中,对枯草芽孢杆菌B2的生理生化性能进行检测,该生理生化性能检测结果可以进一步说明枯草芽孢杆菌B2的确属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
下面通过试验对枯草芽孢杆菌B2的室内抑菌活性进行测定。
首次筛选出枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis B2拮抗菌株,将该拮抗菌株接种于牛肉胨培养基中进行培养;同时,将指示菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(即PDA)培养基中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后,分别用打孔器打成直径为7mm的菌饼。选取拮抗菌株的菌饼一块,置于PDA培养基中;具体的,可以将该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置(平皿直径9cm);再选取由指示菌株得到的菌柄四块,根据对峙法,将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为3.5cm的圆周上。将该培养皿在26℃的环境温度下培养5天后,用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径,在本试验中,重复测定3次。
将接种有上述由拮抗菌株得到的一块菌饼和由指示菌株得到的四块菌饼的PDA培养基,在26℃的环境温度下培养5天后,用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径,在本试验中,可以重复测定3次。
枯草芽孢杆菌B2拮抗菌株的无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表二。
表二:Bacillus subtilis B2拮抗菌株无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果
由表二可知,枯草芽孢杆菌B2拮抗菌株对表二中11中常见植物病菌的抑制率至少可以达到70%,开发前景较好。
下面通过试验对枯草芽孢杆菌B2的最适培养基及其微生物菌剂的性
能进行检测。
试验一:确定枯草芽孢杆菌B2的最适培养基。
将枯草芽孢杆菌B2分别接种于标号依次为A、B、C、D、E、F、G和H的培养基中,观测枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中的生长能力和抑菌能力。
经观测,发现枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中均能生长,但抑菌能力有差异。其中,对枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中抑菌能力的测定结果可以参见表三。
表三:对枯草芽孢杆菌B2在8种培养基中的抑菌能力的测定结果
在表三中,“A”表示营养琼脂(Nutrient Agar,简称NA)培养基,在NA培养基中,包括牛肉胨5.0g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL;“B”表示PDA培养基,在PDA培养基中,包括马铃薯200g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL;“C”表示营养肉汤(Nutrient Broth,简称NB)培养基,在NB培养基中,包括牛肉胨3g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL;“D”表示养酵母葡萄糖固体(即NYDA)培养基,在NYDA培养基中,包括牛肉胨8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL;“E”表示第一玉米淀粉培养基,在第一玉米淀粉培养基中,包括玉米淀粉2.5g、(NH4)2SO4 10g、蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL;“F”表示第二玉米淀粉培养基,在第二玉米淀粉培养基中,包括玉米淀粉3.0g、(NH4)2SO4 10g、KH2PO415g、蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL;在“G”培养基中,包括5×M9:Na2HPO4 64g、KH2PO4 15g、NaCl 2.5g、NH4Cl 5.0g和蒸馏水/去离子水1000mL,取5×M9 20mL定容至1000mL;“H”表示蛋白胨培养基,在蛋白胨培养基中,包括蛋白胨10g、酵母浸膏5.0g、NaCl 10g和蒸馏水/去离子水1000mL。
由表三可知,在上述8种培养基中,NYDA培养基最有利于枯草芽孢杆菌B2抑菌物质的积累,在NYDA培养基中,枯草芽孢杆菌B2的抑菌率可以达到71.1%。
在确定NYDA培养基为最适合枯草芽孢杆菌B2生长和抑菌的培养基的基础上,进一步利用正交法对NYDA培养基中各组份含量和pH值进行优化。
在10L的发酵罐中,将枯草芽孢杆菌B2以5%的接种量,以100r/min的转速,在28℃的温度条件下发酵24h后,测定发酵液中的活菌数。经综合测定,发现优化后的培养基比上述NYDA培养基更适合枯草芽孢杆菌B2的生长和抑菌。其中,上述优化后的培养基的组份、含量和pH值分别为:葡萄糖10-20g,牛肉胨6-10g,酵母膏3.5-6.5g,蒸馏水/去离子水1000ml,pH值7.0-8.0。
将枯草芽孢杆菌B2在上述优化后的培养基中发酵,发酵液中活菌数可以达到1.33×109-4.06×1010cfu/ml。另外,将枯草芽孢杆菌B2在包含葡萄糖10g、牛肉胨8g、酵母膏5g和蒸馏水1000ml、且pH值为8.0的培养基中发酵,发酵液中活菌数可以达到4.06×1010cfu/ml。
试验二:对枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的活性进行检测。
在上述试验一中已确定枯草芽孢杆菌B2的最适培养基的基础上,将保存在斜面培养基中的枯草芽孢杆菌B2,在营养琼脂(Nutrient Agar,简称NA)培养基的平皿上培养活化24h后,接种于营养肉汤(Nutrient Broth,简称NB)培养基中;培养24h之后,以5%的接种量接入种子发酵罐中培养20h之后,转接种于10L的发酵罐中进行发酵,以发酵液中活菌数和对病原菌的抑菌能力为指标,分别对通气量、转速、接种量和装液量进行优化,最终确定枯草芽孢杆菌B2在10L发酵罐中的最适发酵条件为:温度25-28℃,接种量5%-10%,pH值7.5-8.0,通气量800-1000L/h,转速200-300r/min,培养时间为36-44h,活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml。
将枯草芽孢杆菌B2在上述发酵条件的发酵罐中发酵,即可制得到具有良好促生能力和抑菌能力的微生物菌剂。其中,在温度为28℃接种量为10%,pH值为7.5,通气量为1000L/h,转速为200r/min和培养时间为36h的发酵条件下,发酵液中活菌数可以达到1.73×1012cfu/ml。
下面对枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的质量检测方法进行验证。
平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度,比浊法用于测定平板菌落中活菌体的个数。这里,分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度和个数,测定结果基本一致,即平板菌落上活菌体的密度越大、个数越多,紫外分光光度计测定OD600nm处的吸收值越高。
可见,枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测,也可以采用比浊法检测。
下面对枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2与其它生防菌株的复合
菌株进行复配试验。
以豌豆尖镰孢菌Fusarium oxysporum Schl.f.sp.pisi(Van Hall)Snyder& Hanson为指示菌株,对枯草芽孢杆菌B2与Bacillus sp B3、Bacillus spB4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株的复合菌株进行复配试验。这里,Bacillus sp B3为芽孢杆菌sp B3,Bacillus sp B4为芽孢杆菌sp B4,Bacillus sp B5为芽孢杆菌sp B5,Bacillus sp B6为芽孢杆菌sp B6。
具体为:将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus spB6无菌液任取两种,其重量百分比含量为25%,与重量百分比含量为50%的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2复配,后将复配液无菌液接入培养皿,其中,两个培养皿中培养基的组份相同;然后测定不同组合中培养基的组份相同,浓度不同;然后,测定两个培养皿中复合菌株的生物活性;这里,生物活性以药物安全性指标EC50和共毒系数表示。
测定结果表明,上述菌株复配中,部分复配组合具有明显的协同作用,可以提高枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2的抑菌和促生能力。
针对上述不同菌株复配中,分别计算不同组合中菌落的直径平均值,并求出抑制率;再以浓度对数-抑制率的机率值求出回归直线方程,并根据得到的回归直线方程求出EC50,根据得到的EC50比较两个组合中菌落的毒力大小;然后,根据得到的EC50,分别计算不同组合中菌落的共毒系数。最后,根据得到的毒力指数、理论毒力指数、实际毒力指数和共毒系数四个指标,对上述复配试验的结果进行综合分析评价。
其中,抑制率、毒力系数、理论毒力指数、实际毒力指数和共毒系数的计算公式如下,依次为公式(1)-公式(5)。
理论毒力指数=第1杀菌剂的毒力指数×第1杀菌剂在混合杀菌剂中的质量百分数
(3)
+第2杀菌剂的毒力指数×第2杀菌剂在混合杀菌剂中的质量百分数
当某一组合中复配菌株的共毒系数大大超过100时,该组合具有增效作用或协同作用;当某一组合中复配菌株的共毒系数接近100时,该组合具有相加作用;当某一组合中复配菌株的共毒系数明显低于100(如为80以下)时,该组合具有拮抗作用。
上述不同菌株复配组合对豌豆尖镰孢菌的生物活性测定结果见表四。
表四:枯草芽孢杆菌B2与两种其它菌株的复合无菌液对豌豆尖镰孢菌的
生物活性测定结果
更进一步的,将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillussp B6无菌液任取三种,将接种量为55%的枯草芽孢杆菌B2分别与接种量均为15%的三种无菌液复合后,对豌豆尖镰孢菌的生物活性进行测定,测定结果见表五。
表五:枯草芽孢杆菌B2与三种其它菌株的复合无菌液对豌豆尖镰孢菌的
生物活性测定结果
由表五可知,枯草芽孢杆菌B2与其它菌株复合后,如果复合菌株的EC50比复合菌株中各菌株单独的EC50小,则说明复合后各菌株的抑菌效果大大提高。由表五可知,复合菌株B2346的EC50为41.02μl.ml-1,其浓度为200μl.ml-1时,抑制率高达80.5%,比枯草芽孢杆菌B2以及其它复合菌株的抑制率都强。
另外,以枯草芽孢杆菌B2为标准菌株,测定上述各复合菌株的共毒系数(即CTC),测定结果参见表六。
表六:拮抗菌株不同组合的共毒系数
组合 | EC50/μl.ml-1 | I | II | CTC |
B2 | 52.00 | 100 | ||
B234 | 76.78 | 67.73 | 84.40 | 80.25 |
B235 | 87.74 | 59.27 | 75.43 | 78.58 |
B236 | 90.92 | 57.19 | 84.01 | 68.08 |
B245 | 90.85 | 57.24 | 81.41 | 70.31 |
B246 | 80.22 | 64.82 | 89.99 | 72.03 |
B256 | 79.43 | 65.47 | 81.00 | 80.83 |
B2345 | 65.01 | 79.99 | 80.43 | 99.45 |
*B2346 | 41.02 | 126.77 | 86.14 | *147.17 |
B2356 | 61.94 | 83.95 | 80.15 | 104.74 |
B2456 | 65.01 | 79.99 | 87.14 | 95.07 |
B23456 | 68.08 | 76.38 | 76.95 | 99.26 |
注:“I”表示实际毒力指数,“II”表示理论毒力指数。
表六表明,各复配组合的CTC差异很大,大部分小于100,说明复配组合中各菌株之间具有拮抗作用;但复配无菌液B2346的CTC高达147.17,说明复配后,无菌液B2346中各菌株具有明显的协同作用,可大大提高枯草芽孢杆菌B2的抑菌和促生能力。
对于上述各试验中的试验方法,如无特别说明,则均为常规方法。
综上所述,本发明提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用,即将具有生物活性的枯草芽孢杆菌B2以5-10%的接种量,接种于牛肉胨培养基中进行液体发酵,同时加入菜籽油作消泡剂,得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml,可以直接作为Bacillus subtilis B2微生物菌剂使用;另外,将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株经牛肉胨培养基中液体发酵,得到的发酵液与Bacillus subtilis B2按比例复配,可以得到Bacillus subtilis B2复合微生物菌剂,可以直接作为Bacillus subtilisB2复合微生物菌剂使用,其中,总活菌数为1.33×109-4.06×1010cfu/ml;枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力,可以作为微生物农药和微生物化肥使用;使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂,可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌;从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷,以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述,并且,部分地从说明书中变得显而易见,或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
下面通过附图和实施例,对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解,并且构成说明书的一部分,与本发明的实施例一起用于解释本发明,并不构成对本发明的限制。在附图中:
图1为根据本发明枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用中草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2的光学显微镜照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明的基本思想是:保藏编号为CGMCC No.1747的枯草芽孢杆菌B2具有抑菌和促生能力,将枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵,得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml,可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用;另外,可以将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株接种于牛肉胨培养基中,分别进行液体发酵,得到的发酵液与Bacillussubtilis B2按比例复配,得到总活菌数为1.33×109-4.06×1010cfu/ml的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂;该枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力,可以作为微生物农药和微生物化肥使用;使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂,可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌。其中,牛肉胨培养基包括葡萄糖10-20g、牛肉胨6-10g和酵母膏3.5-6.5g,并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml;这里,牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。
菌株实施例
根据本发明实施例,提供了一株枯草芽孢杆菌菌株,该枯草芽孢杆菌菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2,由中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC No.1747。
如图1-图3所示,分别提供了枯草芽孢杆菌B2的光学显微镜照片、系统进化树和相似性比较图。
微生物菌剂实施例
实施例一
根据本发明实施例,提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,该微生物菌剂由接种量为5%的枯草芽孢杆菌B2,在牛肉胨培养基中液体发酵,当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.007×1010cfu/ml时,得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用,发酵液的pH值可以达到7.5。
其中,牛肉胨培养基包括葡萄糖10g、牛肉胨6g和酵母膏3.5g,使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里,牛肉胨培养基的pH值可以达到7.0。
在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中,难免产生许多泡沫,可以加入重量占牛肉胨培养基0.8%的菜籽油作为消泡剂,消除发酵过程中产生的泡沫。
在上述发酵过程中,发酵条件包括:发酵温度25℃、发酵时间36h、通气量800L/h和转速200r/min。
实施例二
在本实施例中,提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,该微生物菌剂由接种量为7.5%的枯草芽孢杆菌B2,在牛肉胨培养基中液体发酵,当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.50×1011cfu/ml时,得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用,发酵液的pH值可以达到7.8。
其中,牛肉胨培养基包括葡萄糖15g、牛肉胨8g和酵母膏5.5g,使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里,牛肉胨培养基的pH值可以达到7.5。
在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中,难免产生许多泡沫,可以加入重量占牛肉胨培养基1.0%的菜籽油作为消泡剂,消除发酵过程中产生的泡沫。
在上述发酵过程中,发酵条件包括:发酵温度27.5℃、发酵时间40h、通气量900L/h和转速250r/min。
实施例三
在本实施例中,提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂,该微生物菌剂由接种量为10%的枯草芽孢杆菌B2,在牛肉胨培养基中液体发酵,当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.73×1012cfu/ml时,得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用,发酵液的pH值可以达到8.0。
其中,牛肉胨培养基包括葡萄糖20g、牛肉胨10g和酵母膏6.5g,使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里,牛肉胨培养基的pH值可以达到8.0。
在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中,难免产生许多泡沫,可以加入重量占牛肉胨培养基1.2%的菜籽油作为消泡剂,消除发酵过程中产生的泡沫。
在上述发酵过程中,发酵条件包括:发酵温度28℃、发酵时间44h、通气量1000L/h和转速300r/min。
经试验验证,在上述微生物菌剂实施例中,枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂适宜在干旱、半干旱及冷凉地区使用。
复合微生物菌剂实施例
实施例一
根据本发明实施例,提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂。在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括:
枯草芽孢杆菌B2:50%;
芽孢杆菌sp B2:25%;
芽孢杆菌sp B3:25%。
经测定,在上述复合微生物菌剂中,活菌数可以达到1.33×109cfu/ml。
实施例二
在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括:
枯草芽孢杆菌B2:50%;
芽孢杆菌sp B4:25%;
芽孢杆菌sp B5:25%。
经测定,在上述复合微生物菌剂中,活菌数可以达到1.33×109cfu/ml。
实施例三
在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括:
枯草芽孢杆菌B2:55%;
芽孢杆菌sp B2:15%;
芽孢杆菌sp B6:30%。
经测定,在上述复合微生物菌剂中,活菌数可以达到2.03×109cfu/ml。
实施例四
在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括:
枯草芽孢杆菌B2:50%;
芽孢杆菌sp B3:15%;
芽孢杆菌sp B4:15%;
芽孢杆菌sp B5:20%。
经测定,在上述复合微生物菌剂中,活菌数可以达到10.50×109cfu/ml。
实施例五
在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括:
枯草芽孢杆菌B2:50%;
芽孢杆菌sp B2:15%;
芽孢杆菌sp B3:10%;
芽孢杆菌sp B4:15%;
芽孢杆菌sp B5:5%;
芽孢杆菌sp B6:5%。
经测定,在上述复合微生物菌剂中,活菌数可以达到4.06×1010cfu/ml。
应用实施例
实施例一
根据本发明实施例,提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的应用。在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等病原菌具有抑制作用。
经测定,枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌的抑菌率可以达到93%,对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌的抑菌率可以达到70%。
实施例二
根据本发明实施例,提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的应用。在本实施例中,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等病原菌具有抑制作用。
经测定,枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌的抑菌率可以达到95%,对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌的抑菌率可以达到70%。
综上所述,本发明各实施例,以枯草芽孢杆菌B2为生物活性物质,将枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵,得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×1010-1.73×1012cfu/ml,可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用;另外,可以将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种与Bacillus subtilis B2为活性物质,分别接种于牛肉胨培养基进行液体发酵,再按比例复配,得到总活菌数为1.33×109-4.06×1010cfu/ml的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂;该枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力,具有生物农药和/或生物肥料特性,可以作为微生物农药和微生物化肥使用;使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂,可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌;从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差等缺陷,以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B2,该菌株的保藏编号为CGMCC No.1747。
2.一种包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.1747的微生物菌剂
,其特征在于,所述微生物菌剂是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B2 CGMCC No.1747在牛肉胨培养基中液体发酵得到的发酵液,所述发酵液中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B2 CGMCC No.1747的活菌数为1.007×1010-1.73×l012cfu/ml。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,在所述牛肉胨培养基中,包括葡萄糖l0-20g、牛肉胨6-10g和酵母膏3.5-6.5g,并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml;所述牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B2 CGMCC No.1747在所述牛肉胨培养基中液体发酵时,使用菜籽油作为消泡剂。
5.根据权利要求4所述的微生物菌剂,其特征在于,所述菜籽油在所述牛肉胨培养基中的重量百分比含量为0.8-1.2%。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的微生物菌剂,其特征在于,所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B2 CGMCC No.1747在所述牛肉胨培养基中液体发酵的条件包括:接种量5-10%、发酵温度25-28℃、发酵时间36-44h、通气量800-1000L/h和转速200-300r/min,所述发酵液的pH值为7.5-8.0。
7.权利要求2所述的包含枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.1747的微生物菌剂在制备微生物农药中的应用,其特征在于,所述应用包括对以下病原菌的抑制:茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镳孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009101482509A CN101928678B (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2009101482509A CN101928678B (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101928678A CN101928678A (zh) | 2010-12-29 |
CN101928678B true CN101928678B (zh) | 2012-08-22 |
Family
ID=43368109
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2009101482509A Expired - Fee Related CN101928678B (zh) | 2009-06-19 | 2009-06-19 | 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101928678B (zh) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102648733A (zh) * | 2011-02-24 | 2012-08-29 | 上海三智生物科技有限公司 | 对刺参生长和免疫力影响的复合微生物制剂 |
CN103103149A (zh) * | 2013-01-11 | 2013-05-15 | 陈秀蓉 | 土壤枯草芽孢杆菌菌株s001及其菌剂的制备方法和应用 |
CN103783085B (zh) * | 2014-02-13 | 2016-01-06 | 甘肃省科学院生物研究所 | 一种抗病增产的生防菌多效复合制剂及其制备方法 |
CN104628434B (zh) * | 2015-02-04 | 2018-01-02 | 浙江大学 | 一种抗黑果枸杞病理真菌的生物肥的制备方法 |
CN106731737A (zh) * | 2015-11-23 | 2017-05-31 | 江阴昊松格氏生物技术有限公司 | 带有党参薄荷柠檬念珠藻的复合微生物除臭剂 |
CN105907680B (zh) * | 2016-05-27 | 2019-07-19 | 河北省科学院生物研究所 | 一种枯草芽孢杆菌j-5及其生物菌剂和应用 |
CN105838656B (zh) * | 2016-06-15 | 2019-09-24 | 东北农业大学 | 防治番茄灰霉病和叶霉病的广谱抗病促生抗逆芽胞杆菌及其应用 |
CN106244490A (zh) * | 2016-08-29 | 2016-12-21 | 佛山市艳晖生物科技有限公司 | 一种防治小麦全蚀病的复合微生物菌肥及其制备方法 |
CN107056524A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-08-18 | 北京绿穑生物科技有限责任公司 | 一种新型微生物育苗营养液及其制备方法和应用 |
CN107164285B (zh) * | 2017-07-11 | 2020-08-07 | 河南科技大学 | 一株枯草芽孢杆菌bbd012及防治番茄病害中的应用 |
CN108991019A (zh) * | 2018-07-06 | 2018-12-14 | 东北农业大学 | 防治番茄灰霉病及叶霉病的生防菌剂组合物 |
CN109156477A (zh) * | 2018-09-14 | 2019-01-08 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 枯草芽孢杆菌bab-1在防治番茄叶霉病上的应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1468954A (zh) * | 2002-07-18 | 2004-01-21 | 黑龙江省科学院应用微生物研究所 | 防治作物菌核病等真菌病害的生防菌株及其生产方法和应用 |
CN1590535A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-03-09 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 枯草芽孢杆菌株、制备方法,制剂、制备方法及用途 |
WO2007043771A1 (en) * | 2005-10-07 | 2007-04-19 | Kyu Jin Yum | Compositions for preventing plant disease comprising bacillus subtilis kccm 10639 or kccm 10640 and methods of preventing plant disease by using them |
CN101148650A (zh) * | 2007-09-03 | 2008-03-26 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 |
-
2009
- 2009-06-19 CN CN2009101482509A patent/CN101928678B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1468954A (zh) * | 2002-07-18 | 2004-01-21 | 黑龙江省科学院应用微生物研究所 | 防治作物菌核病等真菌病害的生防菌株及其生产方法和应用 |
CN1590535A (zh) * | 2004-03-27 | 2005-03-09 | 中国科学院等离子体物理研究所 | 枯草芽孢杆菌株、制备方法,制剂、制备方法及用途 |
WO2007043771A1 (en) * | 2005-10-07 | 2007-04-19 | Kyu Jin Yum | Compositions for preventing plant disease comprising bacillus subtilis kccm 10639 or kccm 10640 and methods of preventing plant disease by using them |
CN101148650A (zh) * | 2007-09-03 | 2008-03-26 | 河北省农林科学院植物保护研究所 | 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Jamali F et al."Biological control of chickpea Fusarium wilt by antagonistic bacteria under greenhouse condition.".《Commun Agric Appl Biol Sci.》.2004,第69卷(第4期), |
王艳."枯草芽孢杆菌B1、B2对几种植物病原真菌的抗菌机理及其抗菌物质的分离与鉴定".《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 (硕士) 农业科技辑》.2005,(第2期), |
辛中尧 等."枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1、B2 菌株对当归、黄芪的防病促进生长效果".《植物保护》.2008,第34卷(第6期), |
辛中尧 等."枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B1、B2 菌株对当归、黄芪的防病促进生长效果".《植物保护》.2008,第34卷(第6期), * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN101928678A (zh) | 2010-12-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101928678B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用 | |
CN111088191B (zh) | 一种芽孢杆菌和木霉菌联合培养方法及应用 | |
CN102433282B (zh) | 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用 | |
CN102010835B (zh) | 一种黄麻链霉菌nf0919菌株、用途及其活性发酵液的制备方法 | |
CN100540656C (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其菌剂和应用 | |
CN103103149A (zh) | 土壤枯草芽孢杆菌菌株s001及其菌剂的制备方法和应用 | |
CN104946567B (zh) | 一株深褐芽孢杆菌及其应用 | |
CN104480046B (zh) | 一株侧孢短芽孢杆菌及其应用 | |
CN104164394A (zh) | 一株拮抗植物病原菌的菌株及其应用 | |
CN102199563B (zh) | 一种防治植物病害的生防菌及其制备方法 | |
CN101974450A (zh) | 一株肠膜明串珠菌及其应用 | |
CN102827790B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌菌株a97、菌剂及制备方法和应用 | |
CN102643760A (zh) | 一株可产生铁载体防治植物病害的拮抗细菌 | |
CN104017749B (zh) | 一种内生枯草芽孢杆菌正突变株、制备方法和制备的生防菌剂及其防治石榴干腐病的应用 | |
CN105462881B (zh) | 一种用于防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用 | |
CN102250814A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在防治白粉病的生防制剂中的应用 | |
CN105746503A (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌可湿性粉剂及其制备方法和应用 | |
CN102747005B (zh) | 一种用于防治棉铃疫病的萎缩芽孢杆菌及其微生物菌剂 | |
KR101175532B1 (ko) | 신규한 버크홀더리아 균주, 버크홀더리아 균주의 항진균성을 증가시키는 효과가 있는 미생물 대량생산용 배지 및 이 배지를 이용한 대량생산방법 | |
CN113604376A (zh) | 一株甘蔗内生枯草芽孢杆菌及其应用 | |
CN105176885A (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在降解有机磷农药中的应用 | |
CN105176893A (zh) | 一种用于防治作物立枯病的解淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
KR20080045346A (ko) | 신규한 바실러스 서브틸리스 엠27 균주 및 이를유효성분으로 한 식물 균핵병 방제 방법 | |
CN102443559B (zh) | 一株用于防治棉花黄萎病的芽孢杆菌及其应用 | |
CN102154155B (zh) | 防治植物真菌病害的短短芽孢杆菌及生物农药的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120822 |