CN101928678A

CN101928678A - 一种枯草芽孢杆菌b2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用

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Publication number: CN101928678A
Application number: CN2009101482509A
Authority: CN
Inventors: 陈秀蓉; 杨成德; 薛莉; 刘晓妹; 盛红梅; 王艳; 辛中尧; 闫沛迎; 李美丽; 荆卓琼
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-06-19
Filing date: 2009-06-19
Publication date: 2010-12-29
Anticipated expiration: 2029-06-19
Also published as: CN101928678B

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用，其中，该微生物菌剂是枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵得到，活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml；该复合微生物菌剂包括枯草芽孢杆菌B2，以及芽孢杆菌sp B3、芽孢杆菌sp B4、芽孢杆菌sp B5和芽孢杆菌sp B6中的至少一种菌株；总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml；该微生物菌剂和该复合微生物菌剂可以抑制茄子菌核菌和番茄灰霉菌等病原菌。本发明所述菌剂及应用，可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差等缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

Description

一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用

技术领域

本发明首次发现了一株枯草芽孢杆菌菌株，该菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2，该菌株在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.1747。

本发明涉及微生物农药领域，具体地，涉及一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂的制备方法及应用。

背景技术

为了保护生态环境，1992年“世界环境和发展大会”提出应在全球范围内控制并逐步减少化学农药的使用量，增加生物农药的使用量。我国政府也十分重视这项工作，将“绿色食品和生物农药的发展”引入21世纪议程。

众所周知，化学农药在作物、空气、水和土壤中有残留，加之害虫对化学杀虫剂逐渐产生抗性，容易引起化学农药对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物有毒害。在我国，农产品农药残留超标问题，严重影响着工农业生产、生态环境、对外贸易以及人类的身心健康。例如，蔬菜农药残留量超标，则面临“绿色贸易壁垒”，在WTO的大环境下无法进入国际市场。

随着人们生活水平的提高和环保意识的增强，在国际或国内市场，对蔬菜产品实行准入制，要进入市场的蔬菜必须是无公害蔬菜，这就要求人们对农药品种和性能进行调整，向无公害农药方向发展，开发并利用生物农药。

生物农药可以通过直接或间接的作用方式来防治害虫、病害和杂草，生物农药对病虫害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌及有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展。为了更好地发挥生物农药的环保性，可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改造，不断提高性能和质量；多种因素和成分发挥作用，害虫和病原菌难以产生抗药性。

微生物农药是公认的“无公害农药”，其防治对象不易产生抗药性，不伤害天敌；繁殖快，能利用农副产品甚至工业废水广泛生产，是综合防治农林病虫害的重要手段。随着环境保护法的贯彻执行，以及加入WTO参与国际市场竞争，微生物农药将作为一种高新技术，在保护环境、保证人类健康，在农业可持续发展中，发挥愈来愈重要的作用。

目前，国内外虽然对微生物农药都投入了巨大的人力及物力，但数量而言化学农药远远多于生物农药；另外，生物农药对环境的要求较高。

可见，开发符合当地环境条件的微生物农药尤为重要，促进当地绿色农业的发展、参与国际农产品市场的竟争、保护环境和保证人类健康就显得尤为重要。

综上所述，在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术中的化学农药至少存在如下问题：

(1)环保性差：化学农药在作物、空气、水和土壤中均有残留，破坏生态环境；

(2)易产生抗药性：随着化学农药施用量的增加，化学农药容易对化学杀虫剂逐渐产生抗性；

(3)安全性差：化学农药易残留、且易产生抗逆性，容易引起对非目标生物如人、家畜、益虫和野生动物有毒害。

发明内容

本发明的第一目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，提供一株枯草芽孢杆菌菌株，以利用所述枯草芽孢杆菌菌株的广谱杀菌活性和促生能力，制备环保性好、不易产生抗药性和安全性好的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂。

为实现上述第一目的，本发明发现了一株枯草芽孢杆菌菌株，所述菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2，所述菌株已于2006年6月29日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1747。

本发明的第二目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，以实现微生物农药环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

为实现上述第二目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，所述菌剂是枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵得到的发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml。

以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，在所述牛肉胨培养基中，包括葡萄糖10-20g、牛肉胨6-10g和酵母膏3.5-6.5g，并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml；所述牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。

以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵时，使用菜籽油作为消泡剂。这里，菜籽油作消泡剂使用，用于消除发酵过程中产生的泡沫。

以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，所述菜籽油在所述牛肉胨培养基中的重量百分比含量为0.8-1.2％。

以上所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵的条件包括：接种量5-10％、发酵温度25-28℃、发酵时间36-44h、通气量800-1000L/h和转速200-300r/min，所述发酵液的pH值为7.5-8.0。

本发明的第三目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

为实现上述第三目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂，所述菌剂的活性成份包括枯草芽孢杆菌B2，以及芽孢杆菌sp B3、芽孢杆菌sp B4、芽孢杆菌sp B5和芽孢杆菌sp B6中的至少一种；其中，总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml。

以上所述的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂，所述活性成份的接种量包括：所述枯草芽孢杆菌B2：≥50％；所述芽孢杆菌sp B3、所述芽孢杆菌sp B4、所述芽孢杆菌sp B5和所述芽孢杆菌sp B6中任一种：≤50％。

本发明的第四目的是针对现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以及微生物农药单一有效成份使用效果较低的局限，提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

为实现上述第四目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用，基于权利要求2或权利要求7所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂，所述应用包括对以下病原菌的抑制：茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌。

在上述枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用中，经试验验证，枯草芽孢杆菌B2对6属20种植物病原真菌具有较好的抑制作用，其中，对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等5种病原菌的抑菌效果最佳，抑菌率可以达到93-99％；对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等6种病原菌的抑菌效果次之，抑菌率至少可以达到70％。

下面通过试验一至试验三，分别对本发明的枯草芽孢杆菌B2在形态、 16S rDNA基因序列和生理生化方面进行鉴定。

试验一：对枯草芽孢杆菌B2的形态进行鉴定。

将枯草芽孢杆菌B2接种于牛肉胨培养基上，培养48小时后的培养性状为：枯草芽孢杆菌B2产生芽孢，芽孢大多数为中生、少数为近端生，孢子囊膨大明显；牛肉胨培养基斜面上菌苔呈念珠状、表面不平整、乳白色、膜质，不透明、表面暗色。

经革兰氏染色，枯草芽孢杆菌B2的形态为：革兰氏阳性，杆状、两端钝园，少数呈不同程度链状排列；并且，大小为(0.796-1.750)um×(1.490-4.730)um。

试验二：对枯草芽孢杆菌B2的16S rDNA基因序列进行鉴定。

将枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis B2的16S rDNA基因序列在Genebank中与芽孢杆菌16S rDNA基因序列的同源性进行比较。比较结果表明，枯草芽孢杆菌B2与AF411118芽孢杆菌(即Bacillus)sp.的同源性可以达到99％以上。

由试验二可知，枯草芽孢杆菌B2与AF411118 Bacillus sp.的同源性可以证明枯草芽孢杆菌B2的确属于芽孢杆菌属Bacillus。

试验三：对枯草芽孢杆菌B2的生理生化性能进行鉴定。

将枯草芽孢杆菌B2与以下枯草芽孢杆菌标准菌株在相同条件下进行生理生化性能检测，具体检测结果参加表一。这里，枯草芽孢杆菌标准菌株购自中国科学院微生物研究所菌株保藏中心，可以包括：枯草芽孢杆菌B.subtilis、腊状芽孢杆菌B.cereus和苏云金芽孢杆菌B.thuringionsis。

表一：对Bacillus subtilis B2的生理生化性能检测结果

在表一中，“+”表示阳性，“-”表示阴性，“-/+”表示介于阴性与阳性之间；“ND”表示未测定；“d”表示11-89％的菌株为阳性。

综上所述，在试验二中，通过16S rDNA基因序列结果，对枯草芽孢杆菌B2与AF411118 Bacillus sp.的同源性进行分析，该同源性分析结果可以说明枯草芽孢杆菌B2属于芽孢杆菌属Bacillus；在试验三中，对枯草芽孢杆菌B2的生理生化性能进行检测，该生理生化性能检测结果可以进一步说明枯草芽孢杆菌B2的确属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

下面通过试验对枯草芽孢杆菌B2的室内抑菌活性进行测定。

首次筛选出枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis B2拮抗菌株，将该拮抗菌株接种于牛肉胨培养基中进行培养；同时，将指示菌株接种于马铃薯葡萄糖琼脂(即PDA)培养基中进行培养。当拮抗菌株和指示菌株在各自的培养基中培养活化后，分别用打孔器打成直径为7mm的菌饼。选取拮抗菌株的菌饼一块，置于PDA培养基中；具体的，可以将该菌饼接种于盛装PDA培养基的平皿的中央位置(平皿直径9cm)；再选取由指示菌株得到的菌柄四块，根据对峙法，将该四块菌饼等距接种于距该平皿中央位置为3.5cm的圆周上。将该培养皿在26℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，重复测定3次。

将接种有上述由拮抗菌株得到的一块菌饼和由指示菌株得到的四块菌饼的PDA培养基，在26℃的环境温度下培养5天后，用十字法多次重复测定该PDA培养基中上述菌株的抑菌圈直径，在本试验中，可以重复测定3次。

枯草芽孢杆菌B2拮抗菌株的无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果可以参见表二。

表二：Bacillus subtilis B2拮抗菌株无菌液对部分病原菌抑菌能力的测定结果

由表二可知，枯草芽孢杆菌B2拮抗菌株对表二中11中常见植物病菌的抑制率至少可以达到70％，开发前景较好。

下面通过试验对枯草芽孢杆菌B2的最适培养基及其微生物菌剂的性能进行检测。

试验一：确定枯草芽孢杆菌B2的最适培养基。

将枯草芽孢杆菌B2分别接种于标号依次为A、B、C、D、E、F、G和H的培养基中，观测枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中的生长能力和抑菌能力。

经观测，发现枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中均能生长，但抑菌能力有差异。其中，对枯草芽孢杆菌B2在这8种培养基中抑菌能力的测定结果可以参见表三。

表三：对枯草芽孢杆菌B2在8种培养基中的抑菌能力的测定结果

在表三中，“A”表示营养琼脂(Nutrient Agar，简称NA)培养基，在NA培养基中，包括牛肉胨5.0g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL；“B”表示PDA培养基，在PDA培养基中，包括马铃薯200g、蛋白胨10g、蔗糖20g和蒸馏水/去离子水1000mL；“C”表示营养肉汤(Nutrient Broth，简称NB)培养基，在NB培养基中，包括牛肉胨3g、蛋白胨5.0g、葡萄糖2.5g和蒸馏水/去离子水1000mL；“D”表示养酵母葡萄糖固体(即NYDA)培养基，在NYDA培养基中，包括牛肉胨8g、酵母浸膏5.0g、葡萄糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“E”表示第一玉米淀粉培养基，在第一玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉2.5g、(NH₄)₂SO₄ 10g、蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；“F”表示第二玉米淀粉培养基，在第二玉米淀粉培养基中，包括玉米淀粉3.0g、(NH₄)₂SO₄ 10g、KH₂PO₄15g、蔗糖10g和蒸馏水/去离子水1000mL；在“G”培养基中，包括5×M9：Na₂HPO₄ 64g、KH₂PO₄ 15g、NaCl 2.5g、NH₄Cl 5.0g和蒸馏水/去离子水1000mL，取5×M₉20mL定容至1000mL；“H”表示蛋白胨培养基，在蛋白胨培养基中，包括蛋白胨10g、酵母浸膏5.0g、NaCl 10g和蒸馏水/去离子水1000mL。

由表三可知，在上述8种培养基中，NYDA培养基最有利于枯草芽孢杆菌B2抑菌物质的积累，在NYDA培养基中，枯草芽孢杆菌B2的抑菌率可以达到71.1％。

在确定NYDA培养基为最适合枯草芽孢杆菌B2生长和抑菌的培养基的基础上，进一步利用正交法对NYDA培养基中各组份含量和pH值进行优化。

在10L的发酵罐中，将枯草芽孢杆菌B2以5％的接种量，以100r/min的转速，在28℃的温度条件下发酵24h后，测定发酵液中的活菌数。经综合测定，发现优化后的培养基比上述NYDA培养基更适合枯草芽孢杆菌B2的生长和抑菌。其中，上述优化后的培养基的组份、含量和pH值分别为：葡萄糖10-20g，牛肉胨6-10g，酵母膏3.5-6.5g，蒸馏水/去离子水1000ml，pH值7.0-8.0。

将枯草芽孢杆菌B2在上述优化后的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml。另外，将枯草芽孢杆菌B2在包含葡萄糖10g、牛肉胨8g、酵母膏5g和蒸馏水1000ml、且pH值为8.0的培养基中发酵，发酵液中活菌数可以达到4.06×10¹⁰cfu/ml。

试验二：对枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的活性进行检测。

在上述试验一中已确定枯草芽孢杆菌B2的最适培养基的基础上，将保存在斜面培养基中的枯草芽孢杆菌B2，在营养琼脂(Nutrient Agar，简称NA)培养基的平皿上培养活化24h后，接种于营养肉汤(Nutrient Broth，简称NB)培养基中；培养24h之后，以5％的接种量接入种子发酵罐中培养20h之后，转接种于10L的发酵罐中进行发酵，以发酵液中活菌数和对病原菌的抑菌能力为指标，分别对通气量、转速、接种量和装液量进行优化，最终确定枯草芽孢杆菌B2在10L发酵罐中的最适发酵条件为：温度25-28℃，接种量5％-10％，pH值7.5-8.0，通气量800-1000L/h，转速200-300r/min，培养时间为36-44h，活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml。

将枯草芽孢杆菌B2在上述发酵条件的发酵罐中发酵，即可制得到具有良好促生能力和抑菌能力的微生物菌剂。其中，在温度为28℃。接种量为10％，pH值为7.5，通气量为1000L/h，转速为200r/min和培养时间为36h的发酵条件下，发酵液中活菌数可以达到1.73×10¹²cfu/ml。

下面对枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的质量检测方法进行验证。

平板菌落计数法用于测定平板菌落中活菌体的密度，比浊法用于测定平板菌落中活菌体的个数。这里，分别以平板菌落计数法和比浊法测定平板菌落中活菌体的密度和个数，测定结果基本一致，即平板菌落上活菌体的密度越大、个数越多，紫外分光光度计测定OD₆₀₀nm处的吸收值越高。

可见，枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的质量可以采用平板菌落计数法检测，也可以采用比浊法检测。

下面对枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2与其它生防菌株的复合菌株进行复配试验。

以豌豆尖镰孢菌Fusarium oxysporum Schl.f.sp.pisi(Van Hall)Snyder& Hanson为指示菌株，对枯草芽孢杆菌B2与Bacillus sp B3、Bacillus spB4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株的复合菌株进行复配试验。这里，Bacillus sp B3为芽孢杆菌sp B3，Bacillus sp B4为芽孢杆菌sp B4，Bacillus sp B5为芽孢杆菌sp B5，Bacillus sp B6为芽孢杆菌sp B6。

具体为：将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus spB6无菌液任取两种，其重量百分比含量为25％，与重量百分比含量为50％的枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2复配，后将复配液无菌液接入培养皿，其中，两个培养皿中培养基的组份相同；然后测定不同组合中培养基的组份相同，浓度不同；然后，测定两个培养皿中复合菌株的生物活性；这里，生物活性以药物安全性指标EC₅₀和共毒系数表示。

测定结果表明，上述菌株复配中，部分复配组合具有明显的协同作用，可以提高枯草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2的抑菌和促生能力。

针对上述不同菌株复配中，分别计算不同组合中菌落的直径平均值，并求出抑制率；再以浓度对数-抑制率的机率值求出回归直线方程，并根据得到的回归直线方程求出EC₅₀，根据得到的EC₅₀比较两个组合中菌落的毒力大小；然后，根据得到的EC₅₀，分别计算不同组合中菌落的共毒系数。最后，根据得到的毒力指数、理论毒力指数、实际毒力指数和共毒系数四个指标，对上述复配试验的结果进行综合分析评价。

其中，抑制率、毒力系数、理论毒力指数、实际毒力指数和共毒系数的计算公式如下，依次为公式(1)-公式(5)。

理论毒力指数＝第1杀菌剂的毒力指数×第1杀菌剂在混合杀菌剂中的质量百分数

(3)

+第2杀菌剂的毒力指数×第2杀菌剂在混合杀菌剂中的质量百分数

当某一组合中复配菌株的共毒系数大大超过100时，该组合具有增效作用或协同作用；当某一组合中复配菌株的共毒系数接近100时，该组合具有相加作用；当某一组合中复配菌株的共毒系数明显低于100(如为80以下)时，该组合具有拮抗作用。

上述不同菌株复配组合对豌豆尖镰孢菌的生物活性测定结果见表四。

表四：枯草芽孢杆菌B2与两种其它菌株的复合无菌液对豌豆尖镰孢菌的生物活性测定结果

更进一步的，将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillussp B6无菌液任取三种，将接种量为55％的枯草芽孢杆菌B2分别与接种量均为15％的三种无菌液复合后，对豌豆尖镰孢菌的生物活性进行测定，测定结果见表五。

表五：枯草芽孢杆菌B2与三种其它菌株的复合无菌液对豌豆尖镰孢菌的生物活性测定结果

由表五可知，枯草芽孢杆菌B2与其它菌株复合后，如果复合菌株的EC₅₀比复合菌株中各菌株单独的EC₅₀小，则说明复合后各菌株的抑菌效果大大提高。由表五可知，复合菌株B2346的EC₅₀为41.02μl.ml^-1，其浓度为200μl.ml^-1时，抑制率高达80.5％，比枯草芽孢杆菌B2以及其它复合菌株的抑制率都强。

另外，以枯草芽孢杆菌B2为标准菌株，测定上述各复合菌株的共毒系数(即CTC)，测定结果参见表六。

表六：拮抗菌株不同组合的共毒系数

组合	EC50/μl.ml^-1	I	II	CTC
					B2	52.00	100
B234	76.78	67.73	84.40	80.25
					B235	87.74	59.27	75.43	78.58
B236	90.92	57.19	84.01	68.08
					B245	90.85	57.24	81.41	70.31
B246	80.22	64.82	89.99	72.03
					B256	79.43	65.47	81.00	80.83
B2345	65.01	79.99	80.43	99.45
					*B2346	41.02	126.77	86.14	*147.17
B2356	61.94	83.95	80.15	104.74
					B2456	65.01	79.99	87.14	95.07
B23456	68.08	76.38	76.95	99.26

注：“I”表示实际毒力指数，“II”表示理论毒力指数。

表六表明，各复配组合的CTC差异很大，大部分小于100，说明复配组合中各菌株之间具有拮抗作用；但复配无菌液B2346的CTC高达147.17，说明复配后，无菌液B2346中各菌株具有明显的协同作用，可大大提高枯草芽孢杆菌B2的抑菌和促生能力。

对于上述各试验中的试验方法，如无特别说明，则均为常规方法。

综上所述，本发明提供一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用，即将具有生物活性的枯草芽孢杆菌B2以5-10％的接种量，接种于牛肉胨培养基中进行液体发酵，同时加入菜籽油作消泡剂，得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml，可以直接作为Bacillus subtilis B2微生物菌剂使用；另外，将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株经牛肉胨培养基中液体发酵，得到的发酵液与Bacillus subtilis B2按比例复配，可以得到Bacillus subtilis B2复合微生物菌剂，可以直接作为Bacillus subtilisB2复合微生物菌剂使用，其中，总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml；枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力，可以作为微生物农药和微生物化肥使用；使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂，可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌；从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差的缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在所写的说明书、权利要求书、以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为根据本发明枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂、复合微生物菌剂及应用中草芽孢杆菌菌株Bacillus subtilis.B2的光学显微镜照片。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的基本思想是：保藏编号为CGMCC No.1747的枯草芽孢杆菌B2具有抑菌和促生能力，将枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵，得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml，可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用；另外，可以将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种菌株接种于牛肉胨培养基中，分别进行液体发酵，得到的发酵液与Bacillussubtilis B2按比例复配，得到总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂；该枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力，可以作为微生物农药和微生物化肥使用；使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂，可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌。其中，牛肉胨培养基包括葡萄糖10-20g、牛肉胨6-10g和酵母膏3.5-6.5g，并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml；这里，牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。

菌株实施例

根据本发明实施例，提供了一株枯草芽孢杆菌菌株，该枯草芽孢杆菌菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2，由中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.1747。

如图1-图3所示，分别提供了枯草芽孢杆菌B2的光学显微镜照片、系统进化树和相似性比较图。

微生物菌剂实施例

实施例一

根据本发明实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，该微生物菌剂由接种量为5％的枯草芽孢杆菌B2，在牛肉胨培养基中液体发酵，当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.007×10¹⁰cfu/ml时，得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用，发酵液的pH值可以达到7.5。

其中，牛肉胨培养基包括葡萄糖10g、牛肉胨6g和酵母膏3.5g，使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里，牛肉胨培养基的pH值可以达到7.0。

在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中，难免产生许多泡沫，可以加入重量占牛肉胨培养基0.8％的菜籽油作为消泡剂，消除发酵过程中产生的泡沫。

在上述发酵过程中，发酵条件包括：发酵温度25℃、发酵时间36h、通气量800L/h和转速200r/min。

实施例二

在本实施例中，提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，该微生物菌剂由接种量为7.5％的枯草芽孢杆菌B2，在牛肉胨培养基中液体发酵，当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.50×10¹¹cfu/ml时，得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用，发酵液的pH值可以达到7.8。

其中，牛肉胨培养基包括葡萄糖15g、牛肉胨8g和酵母膏5.5g，使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里，牛肉胨培养基的pH值可以达到7.5。

在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中，难免产生许多泡沫，可以加入重量占牛肉胨培养基1.0％的菜籽油作为消泡剂，消除发酵过程中产生的泡沫。

在上述发酵过程中，发酵条件包括：发酵温度27.5℃、发酵时间40h、通气量900L/h和转速250r/min。

实施例三

在本实施例中，提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，该微生物菌剂由接种量为10％的枯草芽孢杆菌B2，在牛肉胨培养基中液体发酵，当枯草芽孢杆菌B2的活菌数达到1.73×10¹²cfu/ml时，得到的发酵液可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用，发酵液的pH值可以达到8.0。

其中，牛肉胨培养基包括葡萄糖20g、牛肉胨10g和酵母膏6.5g，使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml。这里，牛肉胨培养基的pH值可以达到8.0。

在上述枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵的过程中，难免产生许多泡沫，可以加入重量占牛肉胨培养基1.2％的菜籽油作为消泡剂，消除发酵过程中产生的泡沫。

在上述发酵过程中，发酵条件包括：发酵温度28℃、发酵时间44h、通气量1000L/h和转速300r/min。

经试验验证，在上述微生物菌剂实施例中，枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂适宜在干旱、半干旱及冷凉地区使用。

复合微生物菌剂实施例

实施例一

根据本发明实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂。在本实施例中，枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括：

枯草芽孢杆菌B2：50％；

芽孢杆菌sp B2：25％；

芽孢杆菌sp B3：25％。

经测定，在上述复合微生物菌剂中，活菌数可以达到1.33×10⁹cfu/ml。

实施例二

在本实施例中，枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的生物活性成份和接种量包括：

枯草芽孢杆菌B2：50％；

芽孢杆菌sp B4：25％；

芽孢杆菌sp B5：25％。

实施例三

枯草芽孢杆菌B2：55％；

芽孢杆菌sp B2：15％；

芽孢杆菌sp B6：30％。

经测定，在上述复合微生物菌剂中，活菌数可以达到2.03×10⁹cfu/ml。

实施例四

枯草芽孢杆菌B2：50％；

芽孢杆菌sp B3：15％；

芽孢杆菌sp B4：15％；

芽孢杆菌sp B5：20％。

经测定，在上述复合微生物菌剂中，活菌数可以达到10.50×10⁹cfu/ml。

实施例五

枯草芽孢杆菌B2：50％；

芽孢杆菌sp B2：15％；

芽孢杆菌sp B3：10％；

芽孢杆菌sp B4：15％；

芽孢杆菌sp B5：5％；

芽孢杆菌sp B6：5％。

经测定，在上述复合微生物菌剂中，活菌数可以达到4.06×10¹⁰cfu/ml。

应用实施例

实施例一

根据本发明实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂的应用。在本实施例中，枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等病原菌具有抑制作用。

经测定，枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌的抑菌率可以达到93％，对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌的抑菌率可以达到70％。

实施例二

根据本发明实施例，提供了一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂的应用。在本实施例中，枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌等病原菌具有抑制作用。

经测定，枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂对茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌的抑菌率可以达到95％，对辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌的抑菌率可以达到70％。

综上所述，本发明各实施例，以枯草芽孢杆菌B2为生物活性物质，将枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵，得到的发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml，可以直接作为枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂使用；另外，可以将Bacillus sp B3、Bacillus sp B4、Bacillus sp B5和Bacillus sp B6中至少一种与Bacillus subtilis B2为活性物质，分别接种于牛肉胨培养基进行液体发酵，再按比例复配，得到总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂；该枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂具有较强的促生能力和抑菌能力，具有生物农药和/或生物肥料特性，可以作为微生物农药和微生物化肥使用；使用枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂，可以抑制茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌和小麦全蚀病菌等病原菌；从而可以克服现有技术中化学农药环保性差、易产生抗药性和安全性差等缺陷，以实现环保性好、不易产生抗药性和安全性好的优点。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于，所述菌株的拉丁文名称为Bacillus subtilis B2，所述菌株已于2006年6月29日保藏在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1747。

2.一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂是枯草芽孢杆菌B2在牛肉胨培养基中液体发酵得到的发酵液，所述发酵液中枯草芽孢杆菌B2的活菌数为1.007×10¹⁰-1.73×10¹²cfu/ml。

3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，其特征在于，在所述牛肉胨培养基中，包括葡萄糖10-20g、牛肉胨6-10g和酵母膏3.5-6.5g，并使用蒸馏水或无离子水定容至1000ml；所述牛肉胨培养基的pH值为7.0-8.0。

4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵时，使用菜籽油作为消泡剂。

5.根据权利要求4所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，其特征在于，所述菜籽油在所述牛肉胨培养基中的重量百分比含量为0.8-1.2％。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌B2在所述牛肉胨培养基中液体发酵的条件包括：接种量5-10％、发酵温度25-28℃、发酵时间36-44h、通气量800-1000L/h和转速200-300r/min，所述发酵液的pH值为7.5-8.0。

7.一种枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成份包括枯草芽孢杆菌B2，以及芽孢杆菌sp B3、芽孢杆菌sp B4、芽孢杆菌sp B5和芽孢杆菌sp B6中的至少一种；其中，总活菌数为1.33×10⁹-4.06×10¹⁰cfu/ml。

8.根据权利要求7所述的枯草芽孢杆菌B2复合微生物菌剂，其特征在于，所述活性成份的接种量包括：

所述枯草芽孢杆菌B2：≥50％；

所述芽孢杆菌sp B3、所述芽孢杆菌sp B4、所述芽孢杆菌sp B5和所述芽孢杆菌sp B6中任一种：≤50％。

9.一种枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂的应用，其特征在于，基于权利要求2或权利要求7所述的枯草芽孢杆菌B2微生物菌剂或复合微生物菌剂，所述应用包括对以下病原菌的抑制：

茄子菌核菌、番茄灰霉菌、小麦纹枯病菌、小麦根腐病菌、小麦全蚀病菌、辣椒立枯病菌、茄子枯萎病菌、番茄早疫病菌、豌豆尖镰孢、豌豆镰刀菌和番茄叶霉病菌。